RNA-seq揭示了氨基酸在大麦组织库源通讯中的假定作用

背景

籽粒中积累的氮大部分来自营养器官转移的蛋白质。然而，人们对籽粒灌浆和再动员之间的相互作用知之甚少。本研究利用转录组大规模焦磷酸测序技术，对大麦旗叶、颖片和发育中的籽粒进行了半胱氨酸肽酶和N转运基因的鉴定，发现这些基因在大麦中氮素的调动和积累中发挥作用。

结果

已知序列信息和新衍生序列信息的结合降低了冗余度，增加了重叠序列长度，并发现了半胱氨酸肽酶和N转运蛋白基因家族的新成员。N转运体基因数据集与来自阿拉门农数据库的水稻和拟南芥的N转运体氨基酸序列进行了比对。57AAT, 45岁NRT1 / PTR和22.选择通过该方法鉴定的unigenes集群在各个系统发育树中定义的亚组，其中25AAT，8NRT1 / PTR和5选择全长序列。此外，鉴定了编码半胱氨酸肽酶的59个unigenes并细分为木蛋白酶半胱氨酸肽酶蛋白蛋白质的不同家族。表达剖析全长AAT基因突出了氨基酸作为显示最高转录活性的基团。hvaap2.和HVAAP6.在营养器官中高度表达，而HVAAP3是谷物特异性的。序列相似性群体HVAAP2和推定的转运蛋白HVAAP6与拟南芥传输液一起参与氨基酸的长距离转移。HVAAP3与ATAAP1和ATAAP8密切相关，并在提供N-发展种子中发挥作用。对于HVLHT1和HVLHT2，可以分别考虑在血糖和标志叶中特异性表达的HVLHT1和HVLHT2中的重要作用。PCA和K-MEARE集群AAT转录数据显示旗叶、颖片和籽粒发育阶段协调一致。韧皮部特有的代谢化合物可能表明水稻对远位置器官的高氮需求。

结论

该方法鉴定了AAT家族的半胱氨酸肽酶和特定的N型转运蛋白，显然是对谷物填充的明显相关，因此大麦的谷物产量和质量。到目前为止，信息仅基于转录数据。为了使其相关的应用，必须更详细地分析所识别的候选候选者在源通信中的作用。

在作物植物中，超过70%的种子氮从茎和衰老的叶子等营养组织转移和转移[1]．N的再动员有不同的时间过程，不同器官和组织对种子发育中的N经济的贡献也不同[2]．在谷物中，旗叶和颖片维持其代谢活动的时间比其他营养组织长，它们对最终粮食产量的贡献很高[3.]．

在光合作用活跃的叶细胞中，多达75%的还原氮位于叶绿体中。核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)代表叶绿体氮的主要部分[4.]．在氮气出口到韧皮中，Rubisco必须降解肽和氨基酸[5.]．小麦和大麦的基因表达分析鉴定出几个半胱氨酸蛋白酶基因在叶片衰老过程中转录水平升高[6.-8.]．某些C1A型（纸蛋白型）半胱氨酸蛋白酶以及可能还有S10型丝氨酸羧肽酶参与叶片衰老期间基质蛋白的体积劣化[8.]．两种类型的蛋白酶在内粒状网上潜在地合成，并通过分泌途径引导，这表明裂解裂解液体室，例如小型衰老相关的空间[9.]．编码木瓜样半胱氨酸肽酶的基因的高表达和强上调表明，在自然衰老的大麦叶片中，特别是7 - 21 DAF之间的家族成员起着重要的作用[7.]．

在衰老过程中，细胞蛋白质被降解为多肽和氨基酸。植物内氨基酸或多肽的有效分配需要有活性的转运体将N化合物通过细胞膜进行转运[10.]．对于基因组全序列的植物(如拟南芥和水稻)，Aramemnon数据库[11.那12.]提供了推测的N转运体基因的完整集合的注释和进一步的信息，而迄今为止只列出了4个推测的大麦N转运体的序列。根据序列相似性，将氨基酸转运蛋白分为ATF(氨基酸转运蛋白家族)和APC(氨基酸-多胺-胆碱)家族。ATF家族可进一步分为AAPs(一般氨基酸渗透体)、lht(赖氨酸组氨酸转运体)、脯氨酸转运体(ProTs)以及具有底物的转运体，如γ-氨基丁酸(GATs)、芳香和中性氨基酸(ANTs)和吲哚-3-乙酸(AUXs) [10.那13.那14.]．APC家族的细分揭示了阳离子转运体(CATs)和l型氨基酸(LATs)以及GABA渗透体(GAP)。63个(拟南芥)和80个(水稻)候选植物聚在一起。

植物中的肽转运由两个基因家族完成，寡肽转运体(OPTs)转运四肽和五肽，二肽和三肽转运体转运体属于硝酸盐/肽转运体家族(NRT1/PTR) [14.]．在拟南芥和米饭中，53和81名成员属于该组，而9和8个运输扣作为选择注释。虽然在功能上表现了相对较高的拟南芥氨基酸和NRT1 / PTR转运蛋白（用于评论[10.那13.单子叶植物，特别是大麦的信息是稀缺的。特征最明显的单子叶肽转运体是HvPTR1，它位于大麦颗粒的盾片中，负责从胚乳动员肽进入萌发胚胎[15.那16.]．OsPTR6被证明可以运输Gly-His-Gly [17.]．在OPT家族中，迄今为止只有一个单子叶序列(OsGT1)被功能鉴定[18.]．

描述了许多有助于植物的铁贩运的运输障碍，并在功能性地表征草。这是由于草地演变了一种不同的机制，从被描述为“螯合”战略的土壤中获得Fe的机制[19.]．强铁螯合剂被称为植物铁载体(PS)，由植物合成并分泌到根际，在那里它们结合铁(III)。Fe(III)-PS复合物被Fe(III)-PS摄取蛋白吸收[20.那21]称为黄色条纹状（YSL）运输器。已经识别并表征了几个YSL运输器（参见例如[22-25)，其中大麦转运体HvYSL5 [26]，hvysl2 [25]及HvYS1 [27]．YSL转运体在再动员和谷物灌浆中的作用尚不清楚。YSL转运体与OPT家族远亲[28]．在拟南芥和水稻中，分别有8个和18个序列属于YSL组。

虽然已经鉴定了大量的植物氨基酸和肽转运体，并对其中一些进行了功能特征分析，但很难确定哪些是植物氮在源和汇两方面最重要的转运体。对于大麦来说，这种情况更加复杂，因为基因组序列只是部分组装[29]．此外，在HarvEST: barley v1.83 (H35， [30.])表示颖片中表达的序列，而从叶片cDNA文库中提取的33376条est序列(7.47%)在旗叶动员中不具有代表性。EST收集的序列信息也可能减少膜相关化合物，因为各自的高度不稳定性大肠杆菌克隆。

下一代测序（NGS）技术提供了新的机会，可以在没有完全测序的基因组的情况下分析植物。转录组大规模平行的焦乳酶测序以旗叶，吞咽和开发晶体，以分析在种子组之前和之后立即重新渗入和进口N化合物。数据评估侧重于两种特定基因组，其负责重新融合和积累氮，半胱氨酸肽酶和N转运蛋白。公共可用和RNA-SEQ数据的组合降低了冗余，基因特异性成簇的长度，并确定了各种基因家族内的新成员。成员AAT基因家族在RNA-seq N型转运体序列中具有较高的代表性。序列比对允许重建25个全长AAT基因。基于这些基因的时间表达谱，我们假设在籽粒发育过程中高氮库强度的建立是在旗叶和颖中感知到的，这两个组织与籽粒发育密切相关。我们假设，代谢产物通过调节转录量，如这里所示的氨基酸渗透，将增加的库强度传递给组织的动员。因此,AAT大麦源库通讯可能与基因活动有关。此外，变化的转录本丰度AAT特别是旗叶的基因可能反映了库/源转换的组织特异性调控。

rna测序和序列组装

大麦旗叶、颖片和颖果在籽粒发育的不同阶段均可获得mRNA。对旗叶和颖片，从开花期到开花后24天(DAF)，颖果从开花期到24天(DAF)，每隔2天进行等量的RNA合成。

在对样品进行定量和质量控制后，由GATC Biotech (Konstanz, Germany)对三个文库进行逆转录和归一化以及转录组测序。对每个库进行一半的Roche/454 GS-FLX运行。从总共1,806,025个读到旗叶(FL)， 701,026个读到颖片(GL)， 57,505个读到谷粒(G)， 57,494个读到谷粒(G)。适配器和质量修剪将读到率降低到1,585,811(615,568 + 485,800 + 484,443，见表1）.平均读取长度为397 BP（FL），400bp（GL）和392bp（g）。对于每个器官，读数被聚集并组装成Contigs和Singletons（表1）.旗叶显示出最高的CONTIG数（43,467），但最低的CONTIG长度（688 BP）。膨胀显示最低的CONTIG数（31,022）和最高的CONTIG长度（835 BP）。谷物显示中等水平（37,790和791，表1）.平均来说，每个contig有11到15个reads。虽然三个器官间的重叠组数具有可比性，但单个组数从FL和G的高值(97348和82446)到GL的低值(29388)不等。这表明旗叶和籽粒中低表达基因数量较多，而颖片中高表达基因数量较少，表明颖片转录组的复杂性较低。

注解

序列组装后获得的Contigs和singleton的特点是，使用不同的数据库，从大麦特有的数据集过滤到更一般的数据集，并从高到低严格，顺序如下:(1)H35 [30.， (2) UniProtKB/Swiss-Prot [31]， (3) UniProtKB/TrEMBL [31（4）来自NCBI的非冗余数据集[32， e值截止值<1E^－20, < 1 e^－20, < 1 e^-10年和<1E^-5,分别。在一个数据库中没有匹配的序列将与下一个进行比较。注释的输出如表所示2．

颖片和籽粒的连片率相当(88.73%和88.56%)，但旗叶的连片率较高(90.34%)。BLAST检索不同数据库，发现有14.1% (FL)、11.3% (GL)和10.1% (G)新的contig序列在H35中未被功能描述。在总未命中类别中，旗叶与颖、粒的未命中分类结果不同(分别为9.7%、11.3%和11.4%)。旗叶和籽粒的单重率分别为51.1%和50.8%，但颖片的单重率较高(69.5%)。这一结果与观察到的低颖单次数吻合(表)1）与标志叶和晶粒相比，表示与旗叶和晶粒相比较低的血糖转录组的复杂性。

旗叶中注释的contigs和singleton的总和(33,743 + 38,119)产生了71,862个表达基因，明显高于H35中注释的ungenes的数量(50,938)。这可能反映了旗叶数据集的高冗余，这在粒级(62,467条注释序列)中也很明显，但在颖级(40,616条注释序列)中则不明显。这可以用一个事实来解释，即只有RNA-seq序列用于组装过程。显然，一些RNA-seq单例和/或contigs代表相同的基因，但不重叠，因此增加了总命中类别的数量。contigs的贡献应该低于singleton的贡献。

contigs的组织特异性

数字1显示了CAP3 contigs的组织特异性。在颖中特异表达的contigs比例(4.9%)显著低于旗叶(13.8%)和籽粒(14.0%)。颖片转录组中含有少量与旗叶(5.0%)和粒级(5.5%)相同的序列。与此相反，旗叶和籽粒之间共享序列的比例较高(34.8%)。

为了概述分子功能的组织特异性，我们基于基因本体术语对pyrosequence contigs和H35 unigenes进行了注释[33]，并由Blast2GO软件分析[34那35]．类别分子函数的3级的结果在图中描绘2．

有两项主要发现:(i)旗叶和籽粒转录组在所有描述的类别中高度相似;(ii)颖片转录组不同于旗叶和籽粒，但与H35相当。颖片中富集了“跨膜转运蛋白活性”、“底物特异性转运蛋白活性”以及较小程度上的“转移酶活性”和“核苷酸结合”。特别是在“离子结合”、“核酸结合”、“裂解酶和连接酶活性”、“氧化还原酶活性”和“辅因子结合”等方面，颖片转录组比旗叶和籽粒转录组更接近H35。

RNA-seq获得了N转运体和半胱氨酸肽酶的新序列信息

在注释的基础上，从H35个unigenes中选择编码推测的N转运体和半胱氨酸肽酶的序列，并在RNA-seq contigs中进行独立BLAST搜索。结合H35和RNA-seq信息，创建了新的N转运体和半胱氨酸肽酶unigenes，并对每个组织进行手工修订(组织特异性总结见图)3.）.

为了评估N转运蛋白和半胱氨酸肽酶基因家族的RNA-SEQ方法的力量，与H35进行比较葡萄片（图4.）.在结合了来自所有三个器官的信息后，67% (CPEP)到100% (OPT)的焦磷酸测序contigs与H35相比扩展了已知的或增加了新的序列信息。

从三个库和H35组装所有候选序列的结果总结在图中5.A并显示出明显增加的平均折叠长度（右侧面板），而对于总折叠号码没有发现一般趋势（左侧面板）。在包含来自两个来源的信息的Contig子集中（图5.B)所有基因组的contig数减少，平均contig长度的增加比整体数据集更明显。

N转运体和半胱氨酸肽酶的RNA-seq contigs与来自拟南芥和水稻的注释同源物聚在一起，并放大可用的全长序列

Papain-like半胱氨酸肽酶

对于所有进一步的分析，考虑了衍生自焦磷酸和H35和H35的组合以及独特的焦塞源的序列。

共组装了CA家族推定的木瓜样半胱氨酸肽酶的59个基因(见表)3.）.基于序列相似性，将产生的contigs细分为CA clan的不同家族(Merops数据库，[36那37])。通常，序列组件后定义的大麦百百种数量低于拟南芥和稻米的全长基因数，除了家庭CO 2，C85和C88。拟南芥和稻米的CO 2半胱氨酸肽酶被单一拷贝基因编码。相比之下，鉴定了两个全长基因和一个另外的体葡萄曲，反映了至少三个基因家族成员。尽管C85的情况不明确，但这种亚家族可能涉及进一步调查的有希望的候选者，因为高折叠数表明在至少一个分析的组织中进行重新化过程中这种类型的半胱氨酸肽酶的含义。

N运输器

新数据集与来自阿拉门农的水稻和拟南芥的所有N转运体氨基酸序列进行了比对[12.]，并构建系统发育树。

AAT家族的所有假定成员从大麦群集到所描述的亚群答:芥Rentsch等人[13.]．此外，我们还纳入了与EcTyrP相关的转运蛋白组，EcTyrP是一种酪氨酸特异性渗透酶E. Col.．[38]．AAT序列的系统发育树（图6.额外的文件1:图S1)包含33个功能特征传输器(附加文件2:表S2)。其中26个属于ATF分支，7个是APC转运体。大多数已证实具有功能的基因(27个)来自拟南芥，只有3个来自水稻，4个来自大麦。这些传输程序在附加文件中列出2表S2，包括作者实验室鉴定的两个大麦转运体(HvAAP1和2)。

在大麦NRT1/PTR家族的71个RNA-seq contigs中，只有45个簇被Tsay等人定义为4个亚家族[14.]，而26个序列形成一个单独的分支(数据未显示)。由于BLAST分析显示这26个候选基因与其他45个候选基因在序列相似性上与聚类的水稻序列没有明显差异(数据未显示)，因此大麦中似乎不太可能出现一个独特的组，这些序列在树中被省略了。这种异常行为可能是由于该组内的整体异质性或这些异常点的序列信息有限(平均长度为184个aa，而聚集的序列为305个aa)。

根据Tsay等人[14.]的子组命名为NRT1/PTR-I、II、III和IV(图7.额外的文件4.：图S3）虽然我们的数据建议调整该分类，但由于NRT1 / PTR-I组的成员不是单噬细胞。子组I内的高异质性也由序列距离矩阵数据反映（附加文件5.：图S4）分别显示亚组I的相似之处39.1％的相似性分别与44.6％和42.3％的亚组II和III。亚组IV的相似性百分比甚至更低（37.9％），该分支是单噬细胞，确认Tsay等人提供的基本结构。[14.]．在功能上表征了30个所呈现的NRT1 / PTR序列（附加文件2：表S2），其中18岁来自亚洲人，11来自米饭。从大麦，迄今为止，只有属于子组II的HVPTR115.]．

所有22麦利序列用作推定的optorporpers群集到图中呈现的系统发育树中8.．系统发育分析清楚地将OPT型和黄条样(YSL)转运体的序列分开。此外，根据郑等人的分类ysl [26]被转载。YSL组1,2和3的运输器显示出高度的序列相似度，而YSL-4组更多样化（附加文件6.:图S6)，而非单系(图8.额外的文件7.:图S5)。此外，这个组是水稻特异性的，只有OsYSL18的功能特征[24]．NGS来自水稻基因组注释项目的转录组数据[39指出了ysl转运蛋白组的花粉特异性。属于亚群1、2和3的hvysl转运体的序列可能是分析发育中的大麦中微量营养素转运的起点。目前为止，在OPT和YSL-1基团中所鉴定出的OPTs最多(10个和8个序列)，而未鉴定出YSL-3转运体。

大麦全长cdna序列分析的额外贡献

H35和焦磷酸测序输出与24,783个大麦全长cdna进行了比较[40]．结合来自这些数据集的信息，减少了所有三个N转运体类的RNA-seq unigenes的数量CPEP基因(见表4.），但也揭示了全长cDNA方法内的冗余。因此，这些序列的一部分是冗余的，至少关于N运输器和CPEP基因．

两种方法都确定了另外的未知序列。Matsumoto等。[40]确定了36个新推定的N个传输车CPEP共检测到36个新基因。综上所述，大麦N转运体和半胱氨酸肽酶的序列信息为78AAT, 71年NRT1 / PTR, 29岁选择和120年CPEPunigenes（表格4.）.所有RNA-SEQ unigenes都可以被认为是以旗叶，葡萄糖或晶粒表达，并且如靠在大麦基因组序列上检查的大麦特异性[41]．

AAT基因的表达分析显示旗杆，卷曲和谷物中的坐标明显的发育阶段

将RNA-SEQ和H35序列组装成57AAT, 71年NRT1 / PTR和22.选择unigenes（表格5.），除26 nRT1 / PTR序列外，它们在相应的系统发育树中纳入定义的亚组（图6.那7.那8.额外的文件1:图S1，附加文件4.:图S3，附加文件7.:图S5)。这个unigene集合代表25AAT，8NRT1 / PTR和5选择全长序列，显示相当高的百分比全长AAT与假定的基因相比NRT1 / PTR和选择基因(42.3%，15.7%和22.7%)。为了排除H35导致这些数字的主要偏倚，我们比较了导致这些数字的RNA-seq读数AAT那NRT1 / PTR和选择重叠群。表格5.显示了AAT那NRT1 / PTR和选择表示3:2:1的比率。将读数与注释的水稻N转运体的平均长度进行归一化后，得到的比率为4.0:2.3:1.0(数据未显示)。所以，原始的和标准化的读取数字都指向更高的转录活性AAT基因与NRT1 / PTR和选择组。由于它们在一组RNA-seq N转运子序列中具有过多的代表性，我们认为这组N转运子可能在N重转和籽粒灌浆中发挥重要作用。由于与增加粮食库强度相关的迁移可能通过改变相关N转运蛋白的转录水平来反映，我们决定比较全长蛋白的表达AAT三个器官的基因。

利用qRT-PCR分析，从营养组织开花前4天开始，到籽粒开花后24 DAF(籽粒开始干燥)，每两天估计转录量(图)9.,上半部分)。其中6人AAT显示三个器官中每一个的最高表达的基因，aap(表6.）.此外，轻型运输机似乎对重新动员很重要。HvLHT2和HvLHT1分别以旗叶和毛彩表达。在开发颗粒中，它们的表达是非常低或不可检测的。在那里，蚂蚁组的特定成员高度表达，HvANT3在6和8 DAF之间HvANT4在谷物发育的早期和晚期(图9.,上半部分)。

为了可视化三个组织之间的关系，主成分分析(PCA)应用于组织特异性qRT-PCR结果。然后，利用K-means聚类识别可能相互关联的发育阶段。两步操作的结果如图所示9.．在每个面板中，彩色区域代表相关阶段。对于所有三个器官，确定了一个包括阶段8和10 DAF的组（紫色区域）。此外，代表晶粒发育晚期的发育阶段形成单独的群体（黄色上色的区域）。K-Means Green的群集地表示早期发展的阶段。它们高度分散，特别是旗叶和闷闷不乐（图中的下面板）9.A、B)。

大多数在谷物中积累的N累积来自从营养器官中重复化的蛋白质，但谷物填充和重新化的相互作用仅被理解得很差。在这里，我们使用了国旗叶，困难和开发谷物的大规模转录组焦点，以鉴定氨基酸，肽和寡肽的推定的半胱氨酸肽酶和转运蛋白，所述氨基酸，肽和寡肽在N重新化和重新分配到显影颗粒中。该方法表明，不同的氨基酸转运蛋白在重复器官和积聚颗粒之间的水槽源通信中可能是重要的。

RNA-seq揭示了颖片转录组的特异特征

通过转录组测序获得的读数与每个器官相似的约0.5百万，标志叶值较高（表1）.每个CONTIG的平均长度和读数数量在三个器官之间是可比的。在膨胀的葡萄片下，发现每个CONTIG的读数较高，而且与国旗叶和晶粒相比，孵化转录组中的单身数量仅为三分之一。这表明荷敏组的较高特异性或更低的复杂性。

如图所示，三个转录组的比较1旗叶序列与籽粒序列相似性较高(34.8%)。另一方面，只有5%的颖片序列与旗叶或谷物中的相同，这再次表明颖片转录组的特异性更高或复杂性更低。

强调血糖转录组的具体特征的另一个论点来自器官特异性RNA-SEQ ContIG的注释及其与基于基因本体论术语的H35的比较（图2）.这些结果表明，与其他两种组织相比，颖片转录组具有不同的功能，特别是在转运活性方面。与旗叶和籽粒相比，颖片转录组的潜在功能更接近H35。H35 contigs由来自不同组织的ESTs组成。因此，胶粒转录组的功能注释指向了代表许多组织的平均表达模式。这表明，在颖片中注释的功能不太具有组织特异性，而旗叶和籽粒的转录组似乎具有组织特异性，功能注释表明两个器官之间具有相似性。

综上所述，旗叶、颖片和籽粒转录组的比较表明，颖片中的基因表达具有较低的组织特异性，可能以较少的基因数量具有较高的活性为特征。颖片转录组与旗叶和籽粒转录组不同，而旗叶和籽粒转录组功能相似。

颖片可能是营养组织动员和积累籽粒的中介物质

相对于籽粒，旗叶和颖片都是源器官。籽粒灌浆过程中的氮素调动和旗叶和颖的作用主要在小麦中进行了研究[3.那42那43]．这些研究表明，与同一发展阶段的叶片相比，揭示了不同的细胞组织和膨胀的分布[43]．颖片有更多的厚壁组织细胞，这些细胞是支撑谷物的结构。与旗叶相比，颖片含有较少的绿色组织，因此叶绿体较少，Rubisco也较少[44那45]．

在晶粒发育过程中，在两个旗叶和泡沫中检测到可溶性蛋白质含量的下降，但重新化的模式不同。标志叶中的蛋白质含量仍然持续到开发出的时间，并且当谷物的发展时下降。膨胀在重新筛选之前，继续累积蛋白质直至5个DAF。不同的重新定位的不同启动时间表明，困难充当源自旗叶和参培营养器官的瞬态水槽。这些研究表明，在以后的发育阶段期间，膨胀是向谷物供应氮气[43]．

闷闷不乐含有高百分比的gln，pro，lys，arg和他的[43]．籽粒灌浆初期珠心投射(NP)中谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸和His含量也高于胚乳转移细胞(ETC) [46]．NP/ETC复合物代表母粒和子粒组织之间的转运途径，同时也是氨基酸供给发育胚乳的代谢界面。在NP细胞中，Gln合成酶(GS)不同胞质亚型的基因表达可能参与蛋白质分解中氨的再同化和N转运化合物的产生[46]．已经提出了这种功能，也提出了Glumes中的GS [43]．

综上所述，旗叶和颖片的功能明显不同，至少在籽粒发育早期，胚乳的下沉强度仍然较低。在颖片和提供母体谷物组织之间可以观察到类似的现象。这表明，颖片代谢是根据发育中的籽粒需求的变化而调整的，并指出颖片作为营养组织和籽粒之间(动员)的调解者的假定功能。

RNA-seq鉴定了一组可能参与氮的转移和积累的半胱氨酸肽酶和N转运基因

与H35相比，RNA-seq提供了半胱氨酸肽酶和N转运体基因的新序列信息(图)4.)，减少冗余，增加H35数据内的unigene长度(图5.B).关于Matsumoto等人发表的全长cdna [40]，36种Centigs在焦塞的收集中被鉴定为独特（表4.）.虽然这些新序列可能参与了粮食发育过程中N化合物的降解和重转，但仅存在于H35或Matsumoto收集物中的cdna与这些功能的相关性较小。

半胱氨酸肽酶

类木瓜半胱氨酸肽酶在自然衰老的大麦组织中起重要作用[8.那9.]，特别是在开花后7到21天之间[47]．虽然编码半胱氨酸蛋白酶的几个基因在衰老过程中上调[6.那8.那48-50，缺乏直接证据表明这类蛋白酶在蛋白质降解过程中有特定的成员。

H35和RNA-SEQ序列信息的组合鉴定了一组59个未编码木瓜蛋白石半胱氨酸肽酶的未成件（表4.）.该组表示属于未知数量的基因数的21个全长序列和38个未成年。其中一些序列可能属于相同的基因，但不能对齐（冗余问题）。这些候选物可以被认为是在三种组织中的至少一种中的开花和DAF 24之间的活性。相比之下，来自相同肽酶的水稻和拟南芥的半胱氨酸肽酶基因的总数是高（两个物种中的88个候选基因），指向新组装的Contigs的一定程度的重新化的特异性。在CO1和C85家族中，大多数未成熟（26和17），以及大多数新的全长序列（4和2）（表4.)，预先确定他们的成员是有前途的候选人。组织特异性分析和各自基因产物的定位到确定的细胞室仍有待完成。

氨基酸渗透在籽粒氮重转和灌浆中起主要作用

AAPS似乎是n重转移和谷物填充的主要部分。该结论来自该组RNA-SEQ衍生的N转运序列中该基因家族的过度表示（表5.)，并从其在来源和库组织中的强烈表达(图上面板9.、表6.）.两个高度表达的推定AAP基因(HvAAP2, HvAAP6)只在源组织旗叶和颖片中有活性，另外两种(HVAAP4.和HVAAP7.)在源组织和汇组织中表达。表中列出的推定转运体基因6.那HVAAP3.特点是谷物。HVAAP3还有HVAAP4显示与ATAAP1和ATAAP8的高序列相似之处（附加文件1:图S1)。两种拟南芥运输司机在用氮气供应显影种子时发挥作用[51那52]．HVAAP2和HVAAP6与ATAAP2和ATAAP5密切相关（附加文件1:图S1)。AtAAP5在成熟的叶、茎和花中表达，参与氨基酸的长距离转移，特别是谷氨酰胺，在韧皮部中发现的主要氨基酸[53]．启动子-报告基因融合显示了这一点ATAAP2.表达于茎和角果的维管组织中。此外,ATAAP.表达与连接果实的韧皮部束紧密相关。因此，AtAAP2似乎是木质部-韧皮部沿这条途径转移的极好候选[54那55， HvAAP2和HvAAP6也可能假定该角色。HvAAP7是AAT树的一个独立分支的成员，仅含有未鉴定的水稻和大麦序列(附加文件1:图S1)。由于其在籽粒灌浆过程中在旗叶和颖中大量表达，HVAAP7.可以被认为是一个有趣的候选人的功能研究大麦。

除了AAP家族的成员之外，两个推定的运输器HVLHT1和HVLHT2似乎对旗叶（HVLHT2）和难闻（HVLHT1）中的N重新分配特别重要。在序列水平上，两种蛋白质彼此密切相关并在功能表征的ost1 [56]．由于其高表达和强烈的组织特异性（见图的上面板9.），HvLHT1可能是阐明颖在向发育中的籽粒提供氮方面的具体作用的一个极好的候选。ANT基因家族的两名成员(HvANT3那HvANT4,表格6.）在开发谷物中高度表达（图9.，右上意图）。因为到目前为止只有一个大蚂蚁家族的成员在功能上表现出来（Atant1，[57)，没有任何关于HvANT3和HvANT4在籽粒灌浆中的可能功能的提示。

氨基酸输送器在水槽源通信中的一种调整作用

N的种子槽强度，这意味着谷物吸引和进口N化合物的能力，是由于高储存蛋白质合成和高需求和/或活性摄取的强度，通过膜局部运输仪[58]．我们实验室最近的研究表明，由于豆类种子中过表达氨基酸转运体而增加的库强度增加了氨基酸供应、种子总N和蛋白质含量[59那60]．

在大麦粒中，储存蛋白基因的最高表达量出现在10 - 12 DAF之间[61]．在糊粉和淀粉胚乳细胞中，贮藏蛋白的积累开始于两天后[62]．同时，当高氮库强度启动时，一组AAT基因在籽粒中被转录激活(图)9.C，上部面板）。值得注意的是，在早期发育期间，这些基因的表达低至8至14天，但在早期发育中较高。PCA和K-MEARES聚类AAT基因表达数据，清楚地分离属于阶段4和6 DAF，8至14个DAF和16至24个DAF的三组数据点（下图9.C).这些组分别被分配到大麦谷物发育的预储存、中间(过渡)和储存阶段。谷物发育的这一阶段已经从12,000个谷物表达的ungenes的转录谱中推断出来。数据评估证实了6至10 DAF之间的中间阶段[61]．仅考虑AAT基因的表达谱，中间期将晚2天开始，并延长至14 DAF(图下半部分)9.C).这反映了颖果中心分化后淀粉开始积累的时间间隔(6 DAF， [63)和高贮藏蛋白质合成在粮食的外围部分。这种转变阶段开始时间的差异，反映了蛋白质积累开始时间相对于淀粉生物合成的延迟，也揭示了颖果分化的内部梯度。

旗叶和闷闷的AAT基因家族的高度表达成员与填充颗粒中的AAT基因家族（图中面板）不同9.）但是，谷物发育的阶段也体现在供应器官旗叶和困难中（图中的下面板9.）.籽粒和颖粒的过渡阶段和灌浆阶段是相同的(分别为8 ~ 14 DAF和16 ~ 24 DAF)。这支持了颖片根据谷物的特定需求调节代谢的假说。值得注意的是,的表达AAT旗叶的基因比颖片和谷粒的基因早4天升高(图上面板)9.）.因此，国旗叶片似乎在谷物中建立沉积物之前响应对氨基酸之前的预期对氨基酸的需求，过渡阶段前两天开始。在出生前和早期籽粒发育期间（-4至6个DAF）之间的旗叶和困难之间的显着差异是可见的。与旗叶相比，这种假设以独特的方式膨胀的假设，至少在早期谷物的发展中。

增加N的需求可以在工厂内产生长距离信号[64]．可能某些氮化合物或氨基酸可以通过韧皮肌挥发，其波动水平可能发出植物的氮气状态。特别提出谷氨酸谷氨酸在植物中的进化保守的长距离信号以及动物中的作用[65]．细胞分裂素也可以参与信号转导植物的N状态[66那67]．Phloem在将信号传送到远方位于植物器官的情况下可能很重要。以这种方式，对n的高粒要求可能会降低韧皮内的同化水平，这可能产生用于在源中重新化的信号。

我们假设，以这种方式，谷物的发育阶段可以在穗附近的组织，旗叶和颖片中被察觉。这表明发育特异性信号在谷物发育过程中介导了库源通信，也可能调控AAT基因表达。组织特异性调节水槽/源过渡也可以起到从波动转录性丰富的观察到的作用AAT特别是旗叶的基因。总的来说，这种信息库-信息源通信中的假设关系来源于一组基因的表达谱，这些基因的转录本在一组特定的pyrosequences中过度代表，这证明了这种方法的力量。

对整个数据集的分析显示，当胚乳水槽强度低时，旗叶和膨胀显然在早期籽粒发育过程中具有不同的功能。在血糖和供应母体组织之间观察到的基因表达中的类比表明浮华荧光作为重复营养组织和积累颗粒之间的介质。已知序列信息和新衍生序列信息的结合降低了冗余度，增加了重叠序列长度，并发现了半胱氨酸肽酶和N转运蛋白基因家族的新成员。可以预期各自的基因产物的参与，可以预期在N个重组或积累中。氨基酸透明（AAPS），AAT系列的AAT系列的亚组似乎是N重转移和颗粒填充的主要阶段。在系统发育树中，推定HVAAP.将组织聚集在复制组织中高度表达的基因以及功能表征的拟南芥转运蛋白负责氨基酸的长距离传输。相反，谷物特异性AAP与拟南芥转运蛋白有关在发育胚胎中的拟南芥。基于表达分析AAT基因和随后的统计数据分析我们假设N的高晶粒需求可能降低韧皮内的同化水平，这可能会产生用于在源中重新化的信号。我们未来的科学作品将侧重于鉴定代谢/激素验型组分，这向植物发出谷物N地位。

总体而言，这项研究中鉴定的半胱氨酸肽酶和N转运序列可能对应用研究具有很高的兴趣，因为它们在谷物填充中的N分区中的显而易见。到目前为止，信息仅基于转录数据。为了在开发新的育种策略方面的应用中，必须澄清单个候选者（例如特异性半胱氨酸肽酶，LHT，AAP和ANT基因的特定作用，必须阐明N重键和积累。

植物生长和RNA制剂

大麦(大麦芽c)植物;在3叶和抽穗期，巴克用Substrat2 (Klasmann-Deilmann GmbH，德国)种植，并分别施10 g Osmocote (Scotts Ind BV，荷兰)和0.2% Hakaphos red溶液(Compo GmbH & Co KG，德国)。在18°C光照16 h的温室中生长。根据Weschke等人的描述确定了大麦的发育阶段[63]．基于籽粒发育阶段收集旗叶，灌注级分（包括宫，宫颈，甲状腺马和AWN）和晶粒组织。对于国旗叶和荷兰，在开花（DAF）后24天至24天开始，以两天的时间间隔收集样品。将0,4,8,10,12,14个DAF的晶粒被手动被解剖到母体和型叶子，并在16,20和24个DAF中取样整个Caryopses。使用PureScript RNA分离试剂盒（Biozym，汉堡，德国）分别从不同阶段分离总RNA。为了制备用于转录体测序的RNA样品，对于每个组织来说，来自所有阶段的等量RNA为每个器官达到27μg的RNA。使用Roche / 454 GS-FLX钛技术的三个图书馆的焦点进行由GATC Biotech（德国Konstanz）完成。

序列分析

生成的原始读取可在EMBL/EBI, European Nucleotide Archive (ENA Project ERP001286， [68])。所有读取是适配器和质量修剪使用SeqClean [69]．使用TGICL管道对每个库分别进行聚类和组装[70]．管道使用megablast [71]用于预聚类和CAP3 [72用于序列组装。组装的重叠设置为95%同一性和35 bp重叠(所有其他参数设置为默认)。最好的blast [73使用对所有contig的单个读命中来确定每个contig的读数。为了核对这些结果，使用Newbler生成了第二个组件[74，(数据未显示)。

通过BLAST相似性搜索，将组合序列与公共数据库进行比对[73的e值不同。对于逐步爆炸，一个perl脚本[75]使用几种生物填充包[76写。为了确定基因本体论(GO)术语，使用Blast2GO [34那35]．

获得在网上在BLASTn查询中，匹配一个contig的所有单个读的表达式级别数(E-value >1E^－20）总结了衍生自相同的组织。

N型转运体序列的鉴定

来自组织特异性组件的所有环节的爆破针对从H35选自H35的N转运蛋白收集（AAT，OPT，NTR1 / PTR）进行了30.]．将Blast E-Value设置为<1E^-10年我们认为超出这个界限的序列是假定的候选序列。候选序列采用Lasergene 8 (DNAStar Inc, Madison, USA)的标准算法与H35序列组装。新创建的contigs和剩余的RNA-seq单例用于进一步分析。

利用BLASTp对阿拉门农进行氨基酸序列确认[12.]并与稻米同源物的比较。观察到30-94％（AAT），59-92％（OPT）和51-94％（NRT1 / PTR）之间的身份。为了排除污染物，对可用的大麦基因组序列进行这些序列的爆炸[41]，并在核苷酸水平上验证了大麦特异性，同源性在97 ~ 100%之间。

系统发育树木

在Lasergene 8 (DNAStar Inc, Madison, USA)中使用ClustalW算法计算树构建的基本比对和相应的序列距离矩阵[77]包括为外群体。对于每个数据集(AAT, OPT，和NRT1/PTR)，序列之间的平均成对距离计算和聚类的邻居连接算法在PAUP* [78]．引导支持值由每个数据集的1000个引导重样计算。用FigTree v1.3.1可视化系统发育树[79]．RNA-seq N转运体序列和IPK之前未发表的序列(HvAAP1, HvAAP2, HvPTR2, HvPTR3, HvPTR6)的EMBL加入在附加文件中进行了总结8.表S3，另外使用的est序列在H35 [30.]．

半胱氨酸肽酶序列的鉴定

半胱氨酸肽酶通过BLASTn搜索得到(e值<1E)^-10年）针对来自H35和Blastx的已知半胱氨酸肽酶序列（E值<1e^-10年)搜索半胱氨酸肽酶拟南芥蒂利亚纳和栽培稻[80那81]．使用Lasergene 8（Dnastar Inc，Madison，USA）的标准算法组装来自三种组织文库的候选物。产生的Contigs和剩余的RNA-SEQ单身用于进一步分析。对于半胱氨酸肽酶的注释和分类，将翻译的氨基酸序列与来自Merops数据库中的拟南芥和稻米的已知半胱氨酸肽酶的Blastp与来自Merops数据库中的拟南芥和稻米的同源物的比较[37]．为了排除污染，对现有的大麦基因组序列进行了爆破[41]，在核苷酸水平上的一致性在93到100%之间。

存在分析

植物材料收集2天(旗叶−4 - 24daf，颖片−4 - 24daf，子粒组织4 - 24daf)，并在−80°C下均质。使用Spektrum Plant Total RNA Kit (Sigma Aldrich, Steinheim, Germany)提取总RNA，并使用RNase-free TURBO™DNase (Ambion, Life Technologies, Darmstadt, Germany)处理。根据制造商的说明书，使用poly(dT)和随机六聚体引物，用Superscript™III (Invitrogen, Life Technologies, Darmstadt, Germany)从2 μg总RNA中合成cDNA。用1 μg稀释后的cDNA(1:32)进行qRT-PCR，引物特异(附加文件)9.：表S1）。使用ABI Prism 7900HT序列检测系统和Power Sybrgreen PCR Mastermix试剂进行实时PCR;使用SDS 2.2.1软件（所有应用的生物系统，达姆施塔特，德国）分析数据。根据Radchuk等人确定合适的参考基因，PCR效率试验和CT值的测定。[82]．三个生物重复的CT值被确定，每个值有三个技术重复，并将其归一化肌动蛋白表达式(ΔCT)。计算ΔCT值的算术平均值和2^-Δct.使用多个实验查看器V4.7的数据用于聚类和可视化的值[83]．

PCA和K-means聚类

对整套QRT-PCR数据进行原理分量分析（PCA）并使用J-Express软件2011进行分析[84]．由此，第一轴沿最大方差分量的方向放置在第二大方差方向上的第二正交轴的方向上。由于大约60％的总方差沿第一轴表示，并且沿第二轴大于12％，在这两个轴上坐标，在一起在图中绘制了近三分之一的总方差的近三分之一9.．将给定的数据集集中，并定义每个组织具有代表性的聚类数量。K-means聚类[85使用OriginPro 8.1执行[86]．

AAP:

氨基酸易释放

AAT:

氨基酸转运蛋白

DAF：

几天后开花

等:

胚乳转移细胞

fl：

旗叶

旅客:

粮食

GL:

颖片

g:

谷氨酰胺合成酶

H35：

第35集收获:大麦v1.83 [30]

NP:

珠心的投影

NRT1 / PTR:

硝酸/肽转运蛋白

选择：

寡肽转运蛋白

主成分分析:

原理成分分析

PS:

Phytosiderophores。

我们感谢Ruslana Radchuk在qRT-PCR分析方面的支持，感谢Angela Stegmann、Elsa Fessel和Gabriele Einert出色的技术支持。这项工作得到了德国Forschungsgemeinschaft (FOR948, WE 1641/13-1)的支持。

作者指出

从属关系

1. 莱布尼兹研究所für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK)， Gatersleben, D-06466，德国

   Stefan Kohl, Frank R Blattner, Volodymyr Radchuk, Franka Andersch, Burkhard Steuernagel, Thomas Schmutzer, Uwe Scholz, Hans Weber & Winfriede Weschke

2. Christian-Albrechts-Universität (CAU)，基尔，D-24118，德国

   Julien Hollmann＆Karin Krupinska

相应的作者

对应到斯特凡•科尔要么Winfriede Weschke．

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

SK: RNA制备，qRT-PCR原始数据分析，RNA-seq、H35和Aramemnon数据比较，N转运体序列比对。JH, BS, TS, usa:大麦基因组序列比对分析。JH:对半胱氨酸肽酶序列进行比对和注释，聚类到MEROPS分支。FRB:系统发育树的构建。虚拟现实:RNA制备。费尔南多-阿隆索:存在分析。KK:对知识内容的批判性修改。对概念的实质性贡献，对知识内容的批判性修正。对数据的概念和解释做出了重大贡献。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

Stefan Kohl, Julien Hollmann对这项工作做出了同样的贡献。

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