模式豆科植物的分子遗传连锁图谱Medicago truncatula：对比较豆科基因组学的一个基本工具及分离农艺学重要基因的孤立

背景

的豆类Medicago truncatula已成为一种模型植物，用于分子和遗传解剖的各种植物过程中涉及的根瘤菌，菌根和病原植物微生物相互作用。旨在为这种遗传方法开发基本工具，我们已经建立了该物种的第一个遗传图谱。基于它们的分子和表型多态性，从品种Jemalong和阿尔及利亚天然群体（DZA315）中选择了两个父母纯合。

结果

利用建立的高效人工杂交技术，获得了两个株系间124个个体的F2分离群体M. Truncatula.并被用来构建基因图谱。该图谱全长1225 cM(平均470kb /cM)，包含289个标记，包括RAPD、AFLP、已知基因和同工酶，排列在8个连锁群(2n = 16)。标记均匀分布在整个图谱中，分离失真仅限于3个连锁群。通过对一些常见标记的定位，表明这8个连锁群与二倍体紫花苜蓿(m .漂白亚麻纤维卷)，表明两个基因组之间具有良好的宏观同源性。使用这个M. Truncatula.地图和衍生的F3种群，我们能够绘制Mtsym6联动群8和中的共生基因SPC.基因，负责荚卷曲的方向，在连锁群7。

结论

这些结果表明Medicago truncatula易于进行二倍体遗传分析，并为利用该模式植物进行共生或其他重要农艺基因的图位克隆开辟了道路。

对更可持续和环境安全的农业的需求加强了对豆科植物种植的兴趣，其中包括一些最重要的农业物种，如紫花苜蓿、三叶草、豌豆、大豆、大豆和花生。这些物种具有与土壤细菌(统称根瘤菌)建立大气固氮共生关系的能力，并与土壤真菌形成共生的根菌根，从而促进它们对磷酸盐、水和其他土壤养分的吸收[1，2］．然而，由于四倍体、大基因组和/或缺乏有效的转基因方法等特点，这些过程的遗传分析在主要作物豆科植物中仍然很困难。从模型厂开始拟南芥,如确为其他Cruciferacae，无法建立任何根瘤菌或菌根共生，建立一个模型，豆类的需求已经认识了十多年。此外，研究模型豆科植物提供了机会，在同一个工厂比较这两个共生和植物病原体相互作用，并分析哪些不能令人满意地研究植物的生理过程答:芥［3.］．

苜蓿相对的，Medicago Truncatula，最初是提出作为豆科生物学的模型工厂，因为它具有分子和古典遗传学的许多有趣的特征[4- - - - - -6］．关键属性M. Truncatula.包括二倍体和自花受精受精，小基因组（500-600 MBP / 1C，[7])、快速的繁殖周期、高度的生物多样性、大量可用的品种[8- - - - - -10.]和一个特征良好的氮素固定的symbiont，Sinorhizobium meliloti［6，11.］．M. Truncatula.也被用作研究菌根相互作用的模式植物[12.，13.］．最近开发了一些分子遗传学和基因组学工具，包括:突变集合[12.，14.]，cDNA文库[15.- - - - - -17.]，一个大插入的BAC库[18.]和高效的转型方法[19.- - - - - -21.］．

此外，属Medicago.是Galegoid门的一部分，因此与许多的另外重要的作物豆类苜蓿如豌豆，蚕豆，鹰嘴豆，小扁豆和苜蓿[22.］．该门的成员有望表现出高水平的核苷酸序列保存和相似的遗传组织，因此有可能在成员物种之间相对容易地传递基因组信息。

的二倍体Lotus对虾也被提出为模型豆类[5，23.，24.］．这种植物有类似的特性M. Truncatula.但它是从Galegoid门和其他豆类，例如大豆或豆系统发育上遥远。

到目前为止，对任何一个二倍体共构建了5个遗传连锁图谱m .漂白亚麻纤维卷［25.- - - - - -29.]或四倍体m .漂白亚麻纤维卷［30.］．在本文中，我们描述了二倍体模型豆类的第一个遗传地图M. truncatula，这是这个物种的遗传学和基因组学的基本工具。我们报道了两个多态的选择M. Truncatula.基因型为古典和分子遗传学提供基础。改进的协议用于跨越这两条线，导致构建遗传地图M. Truncatula。该图谱以124个植株的F2群体为基础，由289个分子标记组成，分离畸变程度低，没有标记聚类。利用现有的高密度二倍体异种遗传图谱Medicago Sativa.［29.]映射许多正交基因并鉴定同源键合基团。这些已经类似地编号为两者Medicago.物种。最后，我们说明了使用这些新工具来精确地绘制两个基因M. Truncatula：这Mtsym6基因[31涉及菌株x的固氮特性和品种特异性SPC.基因，确定吊舱的方向[32］．

亲本基因型的选择

由于遗传分析是建立在研究两个亲本之间性状分离模式的基础上的M. Truncatula.基于它们的表型和分子差异选择线。M. Truncatula.是一种自肥厂，其自然群体由可变数量的不同纯合基因型组成[33］．由于多线选择过程或来自繁殖期间的其他植物物种的遗传造成，品种可以是基因上的异质性。此外，在一些自然人，M. Truncatula.花偶尔交叉授粉（<1％）[34，35］．由于这些原因，选自栽培品种Jemalong和从DZA315，阿尔及利亚天然群体（JMP，未发表的结果）单个种子，以确保的最大纯合性两次至少自交M. Truncatula.线。这两个亲本(Jemalong 6和DZA315.16)分别以各自的群体或品种命名，然后用数字表示特定的品系。

如上所述，我们选择DZA315.16系是基于大量与Jemalong多态性的形态学、发育或共生性状(JMP和TH，未发表的结果)。例如，这两个株系可以通过叶片的色素分布模式很容易区分:Jemalong 6在叶片的正轴面表现出典型的模式，而DZA315.16叶片只有很少的随机分布的斑点(图1A）.另一个显著的不同在于豆荚的形状:Jemalong 6豆荚有刺桶状的特征截尾分枝杆菌Lesins和Lesins描述的豆荚[36]，而DZA315.16形成短和更小的豆荚和棘（图1B.）.最后，两条线显示相反的卷绕：逆时针方向jemalong 6和dza315.16的顺时针方向（图1C）.

所述两条线之间的分子多样性通过使用匿名AFLP带型来估计。我们观察到，AFLP带的32％的Jemalong 6和DZA315.16（未示出）之间的多态性。

选择这两个品系的另一个标准是自Blondon以来它们的DNA含量相同等［7已经表明M. Truncatula.基因型的DNA含量差异可达20%。流式细胞仪测定了两个亲本的DNA含量，结果显示相同(1.16 pg/2C)，大约相当于580 Mb的单倍体基因组大小。37]，以及贝内特等［38]，该值是类似于Lotus对虾(1.0 pg / 2摄氏度,23.)，大约是145mb /1 C的4倍拟南芥蒂利亚纳（0.30 pg / 2 c）。值得注意的是二倍体m .漂白亚麻纤维卷(800mb /1 C， [7]）具有明显较高的DNA含量M. Truncatula。

在过去十年的研究中，许多其他单种子血液下降线M. Truncatula.已被描述。其中三种源自Jemalong品种。Jemalong系A17 (TH，未发表结果)已被用于大多数cDNA和BAC文库的构建以及诱变[39]并且Jemalong线J5用于γ射线诱变计划[12.］．到目前为止，尽管使用超过4000个AFLP标记（TH和JMA，数据未显示），我们未能观察到Jemalong线A17，J5和J6之间的任何区别。此外，我们从未能够识别这三条Jemalong系之间的任何表型（形态学或共生）差异。我们的结论是，即使不能排除核苷酸序列的差异非常有限，也可以被认为是具有相同的基因型的线条，A17，J5和J6。另一方面，罗斯等［40]孤立，之后已经孤立体外选择，衍生，2Ha，从杰隆的再生能力。除了Jemalong，Penmetsa和Cook [41]提出的A20，从自然群体中选择的一个系(TH，未发表的结果)，用于遗传学研究。同样，R108-1 (c3)系从细胞培养选择中分离出来，具有较高的再生能力，也被提出作为模型基因型[17.，20.，42］．由于所有这四个M. Truncatula.基因型(Jemalong, DZA315.16, A20和R108-1 (c3))具有明显的性状特征，表明在开发天然遗传变异方面具有相当大的潜力M. Truncatula.揭示植物发育过程。

遗传图谱的构建

映射群的124个个体是基因分型，适用于313个标记物，其包含292种显性匿名标记物（72 RAPD和220 AFLP），19个具有已知功能的基因（表3.)和2个共显性同工酶标记物(表3.）.使用一组18 10聚体引物产生的72条RAPD多态性带（表1，平均每个引物产生的4个频段）。所有13个AFLP底漆组合（表2，平均产生16.9个标记/引物组合。

的M. Truncatula.遗传地图使用MapMaker软件构建[43]与5.三百四个标记最低LOD得分值在8个连锁群被组织，对应于单倍体染色体组的M. Truncatula.(2 n = 16)。只有9个标记(2个RAPD标记和7个AFLP标记)未连接。5对RAPD和10对AFLP显性标记分别转化为5个和10个共显性标记，在以下条件下:两个条带处于排斥期，大小相近，后代中不存在条带缺失的情况。在此之后，重新计算了一个新的基因图谱(图2）.除了较高的LOD分数值外，在标记顺序或地图距离中没有发现显着的修改，并且未连接的标记数量不变。

所结果的M. Truncatula.遗传图谱跨越1225个Kosambi cM，平均470kb /cM。8个连锁群的遗传大小从92 cM到219 cM不等4）.数字3.显示两个相邻标记之间的间隔距离的分布图，平均值为4.4cm，标准偏差为4.3cm;90％的标记位于小于10厘米的间隔内。根据标记的数量，原产地和性质它们的分布在联动组之间大致相似（表5）.

建立F2基因图谱的一个严重问题是在偶联和排斥阶段存在交替标记。为了解决这一问题，我们将显性标记分为两组，分别将雄性(DZA315.16)和雌性(Jemalong 6)显性标记与共显性标记进行分组(表2)6）.如果隐性等位基因形式是男性(或女性)，显性标记被认为是男性(或女性)标记。构建的雄性和雌性遗传图谱分别跨越888和979 Kosambi cM(表1)7）.由于共显性标记的顺序在两个图谱之间没有被修改(数据未显示)，我们在这里给出了易于阅读的全局F2表示(图)2）有289个标记。

如表所示6，约27标记的％不显示在α= 0.05的典型的孟德尔分离比率。值得注意的是，有偏离仅在3个连锁群的情况下的理论比值高的水平。59，46和在连锁群1，2和3中的标记物的88％，分别被扭曲，一起表示所有具有高χ失真的标记的86％²1:3隔离值。另一方面，其他5个连锁基团中每一个都有少于3个中度扭曲的标记(数据未显示)。此外，这些扭曲的标记并不是随机分布在染色体上:例如，在连锁群3上可以观察到近似线性的扭曲梯度(图3)4）为有利于雄性等位基因的男性和女性的标记孟德尔平等到5倍的频率。上的全基因组的基础上，相比于女性标记失真雄性标记物的频率似乎是相似的：22％和29％（表6）.

对齐m .漂白亚麻纤维卷和M. Truncatula.基因地图

农学重要的豆科Medicago Sativa.(紫花苜蓿)在分类学上非常接近M. Truncatula。然而，两个基因组的共线性尚未被评估。为此，我们绘制了18个基因或同工酶标记3.， 数字2）哪个标记二倍体的8个联系组m .漂白亚麻纤维卷遗传地图[29.］．所有这些标记在两个物种中都是相似的连接，除了在连接组5上发现的rDNAM. truncatula，与连接基团6相比漂白亚麻纤维卷。为了便于比较，我们给出了相同的编号同源连锁群。连锁群1，3，4，5，6和7之间的相对取向m .漂白亚麻纤维卷和M. Truncatula.可以确定，因为至少有2个常见标记已被映射。另一方面，从远端遗传位置推导出连锁基团2和8的取向PEPC和ENOD16分别标记。

共生关系(Mtsym6）和发育（SPC.)基因

Jemalong 6与DZA315.16之间存在许多多态性。我们选择了一个共生的和一个发育的单基因性状，并绘制了遗传图谱来说明我们的遗传图谱的使用。

Tirichine等［31显示了一个Fix^-/使固定⁺在与野生型接种后，Jemalong 6和DZA315.16父母之间存在多态性Sinorhizobium meliloti一个145株。这种多态性由单一隐性基因控制，命名Mtsym6：修复⁺特质处于主导地位。为了准确定位该基因，我们将定位群体的73个F2植株接种其F3后代，确定其固氮基因型。总共修复了15个F3家族^-，19人修复⁺， 39同时显示修复⁺和修复^-，表明其F2亲本为杂合子。的χ²值为0.768，与Tirichine的单基因分离数据一致等［31］．用分子标记偏析共生打字数据一起使我们能够映射Mtsym6基因在从共分离PI 12和连锁群8 L12200标记小于1厘米（LOD> 10）（图2）.

在父母豆荚上观察到的顺时针（DZA315.16）或逆时针（Jemalong 6）多态性（图1)作为形态学标记。F1代植株自交后荚果顺时针卷曲。通过检测F3植株上的荚果，推测了定位群体中F2植株的基因型。在110个F3科中，有28个(25.5%)荚果缠绕呈逆时针方向，82个(25.5%)荚果缠绕呈顺时针方向。的χ²1：3分离的价值是0.012，其与单一的确定性与DZA315.16顺时针特征在一起。我们将此基因命名为此SPC.通过与PE24标记共分离，将其定位到连锁群7上。

亲本选择

来构建基因图谱M. truncatula，我们选择了两个多态系，一个来自澳大利亚的品种，另一个来自阿尔及利亚的自然种群。这两条线是非常多态的，并有特征，使他们很容易区分。例如，在DZA315.16线中几乎没有Jemalong叶标记。Penmetsa and Cook [41据报道，存在对Jemalong和A20线之间的叶斑负责的单一基因。

品种Jemalong是第一个M. Truncatula.品种被释放[44]，并广泛应用于种地[45］．由于其转化/再生特征，最初选择味道jemalong用于分子研究[4，19.，46］．到目前为止，大多数的Medicago.包括诱变，大规模cDNA和基因组文库的建设，DNA测序和遗传资源39利用了Jemalong线。Jemalong线的一个主要的兴趣是它可以被Sinorhizobium meliloti1021株，其基因组最近已被测序[11.］http://sequence.toulouse.inra.fr/meliloti.html.．

Jemalong与DZA315.16的AFLP多态性条带比例为32%，与3个生态型之间的30 ~ 34%相似拟南芥蒂利亚纳［47］．除了有一定程度的标记畸变，这种高百分比的多态性便于在模型豆科中生成遗传图谱M. Truncatula。

遗传地图

我们已经建立了使用匿名显性标记和共显性评价已知基因组合的基因图谱。此遗传图中的可靠性和值被证明在以下方面：1）相同的连接基团和染色体以及少数以最小LOD 5未连接的标记物（2.8％）的数量;ii）所述全球F2地图和男性和女性的地图之间没有差异;三）只在少数连锁群标记的有限群集。标记物的优异的分布由以下事实的标记的90％位于从相邻标记的小于10cm的间隔内示出。这一点M. Truncatula.遗传映射由289个标记物组成，形成8个连接基团，其对应于物种的单倍体染色体组和跨越1225 kosambi cm，其平均为470kb / cm。尽管具有各种分离群体（F2，F3，RIL）获得了遗传数据，但现在众所周知，基因组的遗传尺寸与单倍体DNA含量不成比例。这导致物理到遗传距离的平均比率不同的值（Kb / cm）：263 kb / cm拟南芥蒂利亚纳［47]， 3000 kb/cMPisum一［48] 1900千字节/厘米Helianthus Annuus.［49]，为1000 kb/cMMedicago Sativa.［29.］．

利用显性标记很难构建F2遗传图谱，因为只有当标记处于偶联阶段时才能可靠地估计标记之间的重组。为此，我们建立了另外两份包含共显性标记的图谱，作为锚标记，与偶联阶段的雄性或雌性标记联合使用。将这两种图谱与全球F2图谱进行比较，可以合理地估计遗传图谱的质量。除了由于杂交估计不足导致遗传长度缩短外，共显性标记间的距离及其相对顺序的估计在两个图中非常相似。

8个联系组M. Truncatula.遗传尺寸的不同，从92到219厘米的差距为2.4倍，而M. Truncatula.染色体长度的差异为1.5 (3 ~ 4.5 μm)或2.3 (29 ~ 68 μm) [50或粗线期[51]染色体分别。没有明显的相关性可能会连锁群，粗线期染色体长度测量[遗传大小之间找到51］．最后，基因大小的范围M. Truncatula.联动组暗示，平均每种染色体发生1至2次过度发生。

标记分离畸变与遗传图谱质量

关于标记物的27％的不具有预期的孟德尔比率（在α= 0.05）。这可以通过观察Jenczewski 40％值进行比较等［52在蒺藜苜蓿×M. tornata在二倍体紫花苜蓿中，种内杂交和具有扭曲分离的基因座的15 - 50%值[26.，27.，29.］．在偏析失真高频m .漂白亚麻纤维卷基因组可以用Brouwer和Osborn假设的在近交系中导致配子和/或合子选择的有害隐性等位基因暴露来解释[30.］．有趣的是，扭曲的标志不是分散在M. Truncatula.但主要集中在连锁组I、II和III，这表明了这种扭曲的结构原因。

从Jenczewski进行的分析等［52，很明显，在种间和种内杂交中，预期孟德尔比率的变化是常见的。扭曲因素可能是有害的隐性等位基因[53，自交不亲和等位基因[54，结构调整[55或DNA含量的差异[52］．以Jemalong 6和DZA315.16为例，两种基因型的总体DNA含量相似。然而，我们不知道两系同源染色体的DNA含量是否相同。然而，沿连锁群3的变异梯度有利于雄性等位基因，表明存在特定基因干扰减数分裂。不管原因是什么，染色体分离扭曲的一个后果是，染色体，或至少部分染色体，不能平等地传递给后代。如果分离畸变频率取决于涉及交叉的线，如果它总是局限于相同的3个连杆组，这将是有趣的。细胞遗传学实验正在进行中，以确定减数分裂配对和分离畸变之间的联系。

之间MacrosyntenyMedicago.物种

尽管存在不同的基因组大小和进化分歧，但对比较遗传映射实验已经揭示了显着的基因组保护程度，例如在Poaceae家族中[56］．我们利用了致密的遗传图的可用性，其中二倍体中有超过850个标记m .漂白亚麻纤维卷［29.，包括许多已知的基因，以解决宏观共同的问题M. Truncatula.和苜蓿。选择时的苜蓿地图上每个染色体的至少两个远离的标记和映射到M. Truncatula.隔离人口。这些结果允许鉴定两种物种之间的同源键合组，因此命名M. Truncatula.下面的链接组m .漂白亚麻纤维卷令人留言，如kalo所示等［29.］．该命名法进一步扩展到染色体命名法[51］．唯一观察到的差异是两个物种的rDNA在连锁群5上的不同定位M. Truncatula.而不是第6组m .漂白亚麻纤维卷［29.］．的rDNA的连锁群5上的定位是从LOD分数ENOD40和rDNA和Lb1和rDNA的分别的，7和10之间。此外联动确定，FISH实验表明的rDNA被定位在同一染色体上比ENOD40 [51］．这两个密切相关的豆科植物之间(以及与更遥远的豆科植物)的基因组共线性程度的估计目前正在进行中。这将打开使用的道路M. Truncatula.作为鉴定豆科植物的重要基因的节点植物，具有突变后或在自然多样性范围内的特征。不幸的是，由于紫花苜蓿的杂合子特性，无论是在诱变中还是在基因组程序中都不容易使用，因此加强了人们对一种密切相关的模式豆科植物的兴趣。然而，仍有几个问题有待解决:1)宏观与微观同步的程度如何M. Truncatula.和二倍体苜蓿吗?二)二倍体和四倍体紫花苜蓿是同源的吗?和iii)是synteny一般内Medicago.Genus和更普遍的豆类内？

基因图谱

两个亲本系，Jemalong 6和DZA315.16，被有效地由参考形成根瘤Sinorhizobium meliloti菌株1021和2011(数据未显示)。然而，我们已经观察到，接种与各种其他S. Meliloti.和S. medicae.这些菌株均能有效地结瘤苜蓿，表明菌株与品种之间存在较高水平的共生特异性M. Truncatula.（TH，未发表的结果）。通过这种方式，一个特定基因（Mtsym6）牵连Jemalong和野生型之间的低效率的共生S. Meliloti.我们实验室最近发现了A145菌株[31］．在这里，我们将该基因精确地将该基因映射到Liblage组8.这是模型豆类中共生基因的遗传映射的第一报告M. Truncatula。基于地图的克隆Mtsym6目前正在实验室进行研究。

逆时针荚卷曲是最多的特征Medicago.种[36］．笨啊等［57]的研究表明，只有一个单一的单系枝包含物种(包括M. Truncatula.)，豆荚可以在任何方向卷曲，这表明一个单一的变化必然导致顺时针卷曲的特征。Lilienfeld和Kihara [32]已经证明，在Medicago littoralis（亲密的相对M. Truncatula.)，顺时针方向为显性，受单基因控制。利用Jemalong 6和DZA315.16对该性状的多态性，分别具有顺时针和逆时针的荚果，在我们的定位群体中对该性状进行遗传分析。根据Lilienfeld和Kihara的协议[32[我们达到了吊舱卷曲意识与顺时针转动主导的单一确定性确定性的结论。我们将此基因命名为此SPC.并将其映射到联动组7.基于地图的克隆SPC.目前正在实验室进行研究。

在本报告中描述的鉴定多晶型Jemalong 6和DZA315.16系列与F2遗传图谱的制定和与苜蓿的鉴定有可能为基本和应用方法提供强大的工具，例如研究豆类基因组与其他模型物种基因组之间的守恒，以及农业上重要基因的位置克隆。

植物材料

单个种子M. Truncatula.用Jemalong和阿尔及利亚自然群体DZA315 (JMP，未发表的结果)至少自交两次，然后以Jemalong为母本进行人工杂交。一个由124个F2植株组成的群体，由一个单一的F1植株衍生而来，用于遗传定位，随后被指定为“定位群体”。用分子标记证实了F1植株的杂种特性。超过95%的F2种子发芽，其中约6%的白化苗被丢弃。每个亲本1株、1株F1株和定位群体F2个体在SHb10培养基上的品红盒中进行无杂交培养[58)，并每两个月修剪一次。

交叉程序

通过对授粉和施肥动力学的微观研究，提出了一种高效的人工杂交方法M. Truncatula.(E.-P。脚印,未发表)。这种方法类似于Pathipanawat中描述的方法3等［59]并在这里概述。在发芽后在4℃下在4℃下富集，在生长室（25℃，16小时光照周周期，100μEmm^-2.sec.^-1）.花粉采样时，在雄性亲本上选择最佳花期(刚过花期)的花，在立体显微镜下用弯曲的超细镊子解剖。在这个阶段，释放的花粉肿胀，潮湿和粘性，并包裹在柱头周围。在母本上，花在花药破裂和花粉释放之前的发育阶段被选择。用手术刀在其中心线以下纵向切开约0.5毫米的标准花瓣。然后小心地取出10个未打开的花药袋，并将刚收获的有性柱的顶端应用到柱头上，以使其粘性表面充满外源花粉。然后将授粉的雌蕊轻轻地放回标准花瓣下。将带有异花授粉花朵的枝尖标记，插入一个含有1毫升水的25毫升透明塑料小瓶中，并用棉絮塞轻轻固定。将雌性植株置于间接光照下，24-48小时后取出保护瓶。授粉后2-4天，小的卷曲豆荚的发育表明了杂交的成功。 The efficiency of this method is close to 80 % on average with 5 viable seeds per pod. Significant variations in the optimal stage for crossing and in the rate of success have been observed for differentM. Truncatula.基因型和表现取决于母系基因型的特点和亲本间的遗传距离。EPJ可以根据要求提供更详细的跨协议。

DNA含量测量

利用在服务德Cytometrie，研究所DES科学Végétales，CNRS，GIF河畔伊薇特，法国的EPICS V流式细胞仪测定DNA含量。如由Blondon描述测量进行了评估等［7]，采用溴化乙锭荧光法佩妮矮牵牛PXPC6（2C = 2.85 PG）作为例行内部标准。每个基因组大小估计是每种植物的五种独立测量产生的。

DNA分离和标记分型

DNA分离和RAPD扩增，详见Ghérardi等［60］．RAPD标记的命名如下:字母和前两位数字表示对10-mer引物的鉴定1)，最后一个数字对应于多态带的分子量。

基本上由VOS描述的AFLP标记等［61]由莫鲁的修改等［62)与EcoR我和均方误差我限制酶，分别使用A + 2 / + 3组合。通过代码确定多态带Eco / Mse引物组合(表2)，后跟一个数字，该数字对应于父配置文件中的频带号。RAPD和AFLP标记被认为是存在/缺失的优势标记。没有考虑到带的强度。

在用于作图的19个基因中(表3.) 2个基因作为RFLP标记分型。RFLP分析如下:从10株以上的F3植物中分离出DNA，用限制性内切酶酶切(见表)3.）和南部泡沫。DNA探针（表3.)，并进行标记和杂交，如Kalo所述等［29.］．17个其他基因的多态性的PCR扩增后鉴定用引物上的微卫星基序（SSR）或外显子和内含子交叉内两侧任一锚（未示出数据）。当不能观察到一个长度多态性，扩增产物用限制性内切酶（CAPS，[消化63])。RFLP、CAPS和PCR标记均为共显性。

同工酶标记

活跃生长的幼叶组织的新鲜片在地面在冷的0.1M的Tris-HCl（pH值= 7.2）的提取缓冲液。将上清液吸附于滤纸吸液芯，在-80冷冻保存℃过夜，然后装载到13％的淀粉凝胶。6 phosphogluco脱氢酶（PGD）和phosphogluco-变位酶（PGM）酶同种型如肖莱[描述用Tris-柠檬酸盐（pH值= 7.0）缓冲液系统分辨34］．用带强度来鉴定杂合子。同工酶为共显性标记。

地图建设

使用MapMaker / Exp V3.0软件构建遗传图[43]，并使用Drawmap包绘制[64］．用卡方检验分离数据与预期孟德尔比率的偏差。在α = 0.05时差异显著的标记仍用于构建连锁图谱。

基因图谱

为了Mtsym6基因，对每个定位群体的F2植株进行共生表型评分，检测至少10株F3植株Sinorhizobium meliloti菌株A145由Tirichine描述等［31］．接种后30天的F3个体的氮固定表型（固定）被均得30天并作为Codominant标记物处理。因此，通过固定+和固定在其后代的情况下鉴定杂合F2。为了SPC.基因，对定位群体的F2植株按顺时针或逆时针方向标记荚果卷曲，标记为显性标记。

这项工作部分得到了INRA/CNRS的资助Medicago truncatula基因组计划（1998- 2000年）。我们感谢E. Jenczewski（INRA，雷恩，法国），S圣东尼（INRA，蒙彼利埃，法国）和P.弗南多（CNRS，法国尼斯），他们分别设计微卫星标记物MtLec2，ATP酶和GSHS，帮助。我们感谢S.布朗（CNRS，GIF S /伊薇特，法国）为他用流式细胞仪测量的帮助。我们感谢GB。吻和P.喀洛出版前提供苜蓿映射数据。我们感谢DG。巴克和J.Dénarié对稿件他们的批判性阅读。PT和AK来自INRA博士后奖学金（桑特des Plantes植物园等环境公司系）的收件人。JMA是从MINISTERE德拉RECHERCHE津贴获得者。

隶属关系

1. CNRS-INRA，BP27，去了Laboratoire BiologieMoléculaire德关系Plantes花园，物和微生物，卡斯塔内托洛桑Cedex的，31326，法国

   Philippe Thoquet, Michele Ghérardi, Etienne-Pascal Journet, Attila Kereszt, Jean-Michel Ané & Thierry Huguet

2. 站德Génétique等D'改善des Plantes植物园，INRA，去了Domaine Melgueil，莫吉约，34130，法国

   Jean-Marie Prosperi

3. 匈牙利遗传学研究所匈牙利科学院生物研究中心，匈牙利6701

   阿提拉Kereszt

通讯作者

对应于Thierry Huguet.．

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