利用高等植物中码头策略探索基因家庭的保护和多样性

背景

关于越来越多但数量仍然有限的植物的全基因组信息的可用性，提供了在具有重大经济影响和复杂基因组的物种中鉴定同源物或相关基因的可能性。在这篇论文中，我们利用最近描述的CODEHOP引物设计和PCR策略，在大基因家族中有针对性地分离同源物。

结果

该方法用两种不同的目标进行了测试。首先是分析的演变CYP98细胞色素P450家族基因参与多种植物中酚类化合物的3-羟基化和木质素化。第二步是分离高粱糖基转移酶的同源物UGT85B1并确定的复杂性UGT85.麦子的家庭。P450S的CYP98在所有血管植物中发现了家庭或密切相关的序列。在苔藓中没有发现相关序列。既不是广泛的重复CYP98基因也没有正式的UGT85B1在小麦中发现。这UGT85A.然而，亚家族被发现在小麦中具有高度变化。

结论

我们的数据涉及CYP98S在木质化和木质素前体与血管植物的3-羟基化的演变。高度保护CYP98家庭强烈地认为，有利于植物开发的基本功能。相反，重复和多样化UGT85A.小麦的基因家族表明其参与适应性反应，并为生物技术应用提供了有价值的基因库。这项工作展示了Codehop探索植物中大型基因家族探索的高潜力。

植物进化出了极其多样化的基因家族，作为应对恶劣环境的工具。其中一些家族，如细胞色素P450和udp -糖基转移酶(UGT)，反映了植物和整个植物物种非凡的生化多样性，并代表了生物技术的一个非常有价值的基因来源。这两个基因家族为作物和杂草抗药性的生物修复和控制提供了巨大的潜力[1-3.，但显然也适用于工业应用。p450，被认为是已知的最通用的催化剂[4.]通常激活二恶英并将其一个原子转移到各种底物中，同时还催化来自C-C和C = N键切割，酚类偶联，脱水，脱氢，缩短的异构化的大多数反应[5.］．其中许多反应对激素、药物、色素、芳香、生物聚合物构建块和防御分子的生物合成都很重要[6.那7.］．糖基转移酶对于生产天然化合物也是必不可少的，因为它们控制了它们的溶解度，稳定性，运输，储存，有时也是它们的生物活性[8.那9.］．如果通过全基因组测序可以直接获得其中的一些潜力，那么广泛的信息将局限于模式植物(通常是基因组较小的植物)或具有重大经济利益的植物。利用这些知识来靶向其他需要研究或工程的植物的基因，或探索具有特定生物合成能力的植物的基因家族，是未来几年的一个目标。

随着基因序列及其多样性和系统发育信息的日益丰富，越来越复杂的PCR技术已经发展到靶向基因家族。植物p450蛋白是一种低含量且不稳定的膜结合蛋白，通常很难纯化。因此，早期有几个研究小组尝试在最保守的共识区基础上分离P450基因，通过传统PCR低严格度生成探针[10.-13.］．这种方法后来被改进，并被其他几个小组用于分离不同植物物种中的P450基因[例如，P450基因]。[14.-18.]]。它被证明是成功在许多情况下，虽然只导致少数高表达，并与P450的家庭。甲显著一步导致从简并PCR与扩增片段的血红素结合引物和差异显示，，允许有效识别响应于诱导物处理大豆细胞培养物的[9个P450基因的方法联接19.和21个独特的P450基因水松用于紫杉醇生产的细胞[20.］．然而，这种方法需要精心控制和强差动系统。最近报道了另一个有趣的改善，涉及使用嵌套引物来增加PCR选择性[21.］．然而，迄今为止所报道的所有策略的主要局限性是，它们没有考虑到最近在高等植物基因组测序中发现的P450的巨大多样性和低保守性，既不允许集中基因选择，也不允许分离最分散的P450进化支，即在高度分化的物种中没有系统的探索P450超科。

在本文中，我们报告了最近描述的共识 - 简并杂交寡核苷酸引物（Codehop）策略的高潜力[22.]的引物设计，确保最佳匹配，PCR扩增集中于非常短的保守序列，分离进化遥远的物种的同源物，集中或系统地探索具有非常大基因组的植物的基因家族。用该方法分析了许多植物P450基因CYP98家族的复制和保存情况。这个家族最近被认为在木质素化和植物发育中起重要作用[23.-25.］．相同的方法也用于分析小麦的UGT85家族。

在小麦中追逐CYP98基因

这CYP98细胞色素P450家族基因编码香豆素酯的3'-羟化酶，催化木质素单体和绿原酸合成的关键步骤[23.-25.］．许多酚类调味料化合物如丁醇，Safrool或vanilin的生物合成也需要CYP98活性。工程P450S家庭的表达具有重要的农业产业应用，包括提高植物防御和木质素组合物的改性，以改善饲料消化率和木材制浆[26.那27.］．访问CYP98主要作物和饲料植物的基因以及大多数常见的木质物种是改变其表达的必要步骤。如果通过EST测序可获得有限数量的物种的一些部分序列，则它们不会反映在植物或植物组织中表达的全系列基因同种型，特别是对于大型基因组植物。

因此，我们的第一个目标是测试是否有可能检测出属于CYP98家人在幼苗具有非常大的基因组表达的小麦，主要的农作物。当这项工作已启动，几CYP98序列是可用的，其中一些只是来自ESTs的部分序列。为了优化引物的选择，在偏向单子叶基因的情况下，来自水稻和玉米的可用est与高粱的全长序列进行了比对[17.,大豆28.] 和拟南芥．在后一种情况下，A. Thaliana.基因组测序揭示了三个基因。他们两个人 （CYP98A8和CYP98A9：功能未知）与第三个是密切相关的，显然是不同的，CYP98A3，最近被证明可以编码香豆蔻酯3'-羟化酶。CYP98A3似乎是从高粱，米，玉米和大豆分离的序列的原貌。使用Codehop策略设计了引物。选择三种意义（p98a，d和c）和一个反向（p98cr）底漆（图1），以避免强烈的共识，地区常见的其它P450家族如高度保守的PERF主题。为了进一步确保高选择性引物，向下触摸基因选择进行PCR开始随退火温度高（70℃）。

BLASTP分析与对应于当地植物P450库上的每个引物对应的共有蛋白质序列进行的，表明感测引物比反向更特异，并且可能控制扩增选择性（表一世）.BLAST分析预测，P98c/P98cr对特异性最强，导致两种不同但密切相关的基因扩增CYP98小麦幼苗cDNA文库的片段。在琼脂糖凝胶上获得预期大小的单个条带，琼脂糖凝胶被洗脱并在3'-T悬垂载体中亚克隆。在19个测序克隆中，有11个对应于CYP98A11，7到CYP98A10,和一个非cyp序列(图2）.正如预测的那样，P98d/P98cr对是第二有效的。除了CYP98A10和CYP98A11在美国，它也放大了一个明显的分歧CYP98基因，CYP98A12．在14个扩增的片段中测序为13个编码的CYP98S。预计P98A引物匹配更多数量的P450系列（表1）.与P98cr配合使用，放大效果更佳CYP.和非CYP98 CYP.序列比CYP98s (CYP98A11和CYP98A10）.两者中的两个CYP.然而，序列与之密切相关CYP98沙CYP76s。在较低的温度下启动触控PCR并分析扩增片段没有透露额外的CYP98序列。

因此，CODEHOP策略似乎非常适合于对具有大基因组的植物基因家族进行更广泛的探索，这取决于引物的选择性。BLAST分析可以预测每一套引物的选择性。在小麦幼苗中，集中CODEHOP筛选可以检测出三种明显不同的基因CYP98基因。所有这三个基因显然与答:芥CYP98A3．

其他植物中CYP98邻位/同系物的分离

这项调查的第二步旨在测试分离的可能性CYP98A3在广泛的远方相关物种中的正交。最初选择性引物对P98C / P98CR，无需修改密码子使用，首先使用相同的放大程序或使用各种cDNA文库将初始退火温度从70℃切换出来，从而制备Capsicum Annuum.水果（茄科）水蕨richardii（蕨类），柯伊斯布卢美细胞培养（LamiCeae），桉树球液木质部(桃金娘科),Helianthus Annuus.茎和叶（菊科），Lycopersicon esculentum芽(茄科),Picea amies细胞培养（针叶），松果体松树茎和根（针叶），毛果杨茎，根和叶（Salicaceae），Physcomitrella patens.protonemal组织(苔藓)。CYP98从库中扩增出相关序列c . blumei那e .桉那H. Annuus.那p .冷杉属,杨树．经过底漆密码子使用的优化，一CYP98- 静物片段也从中扩增C. Richardii.互补脱氧核糖核酸库。但未获得扩增子P. Paten.那p .松树或者在优化密码子使用之后，也不是在进一步降低触摸PCR的初始温度之后的茄科。

出在宽范围的维管植物，包括蕨，针叶树，单子叶植物和双子叶植物的这十个代表品种，从而提供的CODEHOP策略CYP987个病例的相关DNA序列(图3.）.由于扩增子的短尺寸，无法将它们全部分配给CYP98系列。这种作用需要全长序列，如果不是蛋白质的催化活性。迄今为止，这些仅在小麦的情况下获得，确认基因身份和功能（M. Morant，个人沟通）。然而，扩增片段的同源性分析与血管植物的进化史一致（图4.）.结合爆炸分析，它表明了p .冷杉属和C. Richardii.扩增的片段可以是任一代表的祖先形式CYP98S或来自相关A型P450系列，可能是CYP81。不CYP98在苔藓中检测到相关的序列P. Paten.，这将与CYP98S与血管植物的演变一致。CYP98相关的序列也没有P. Paten.ests，其中CYP73预计可以找到肉桂酸酯的4-羟化酶。CYP73的演变，参与苯丙烷型途径的上游步骤和黄酮类化合物的生物合成，所以应该是Lignification [29.］．

该方法的限制

在少数情况下，在降低触摸PCR的初始退火温度和适应密码子使用后，不得获得扩增。这发生在图书馆的地方CYP98预计CDNA将存在于例如杉木茎和根系中，以及来自贝尔皮普果实或年轻番茄植物的文库。在松干，CYP98在木质素单体的合成中，应该有高水平的表达，而茄科植物被描述为积累大量的羟基肉桂酯，如绿原酸。将最初设计用于小麦基因扩增的P98c和P98cr引物与其他植物的最佳密码子设计引物进行比较(图)5.）.P98C在夹具中的16个位置不同，从针对松树优化的底漆中，从引物中的16个位置预测为Salanaceae的最佳选择。P98CR在夹具中的11个侧面也有4个位置，适用于松树和溶性粘合剂。因此，密码子使用的差异似乎为我们的第一个实验失败提供了解释。因此测试了使用适应密码子的新引物，但在任何测试的PCR条件下没有导致扩增的片段。

为了找到一个解释，现在可以检查现在可用于松树和番茄的EST和cDNA序列，并与我们的引物和共有序列对齐。除了所选共识序列之外，与真实序列的这种比较显示出来自大多数常见的密码子使用情况的显着分歧。假设引物的钳位片段对扩增的影响非常轻微22.因此，可能应该重新考虑。然而，该实施例中存在的不相似性可能是局部的，因此应该通过使用沿全序列分布的多个引物来获得成功的扩增。

探索小麦的另一个基因家族：UGT85

糖基转移酶(1型)是另一个在农业化学中有重要应用的大基因家族，因此，我们测试了CODEHOP策略在探索六倍体小麦糖基转移酶多样性方面的有效性。在这种情况下，我们决定关注与udp -葡萄糖相关的ugt:P.-HYDROXYMANDELONITILE-O.-Glucosyl转移酶（sbHMNGT要么UGT85B1）催化在氰基糖苷的合成中的最后一步，最近分离出来美国二色的[30.］．当这项工作已启动经BLASTp搜索发现只有2个序列，UGT85A2和UGT85A3，在基因组显著相关sbHMNGT（43％同一性）拟南芥。Codehop引物设计，基于3个全长序列的对准，提供了五种意义和五个可能选择该组UGT的五个反向引物（表2）.PCR用引物的所有组合进行的，开始在70向下触摸PCR℃。当一对夫妇的引物扩增预期大小的产品，他们亚克隆和分析。然后将该引物对夫妇弃去文库使用另一引物组合筛查但与的初始温度向下触摸PCR下降5℃。连续的温度降低导致扩增成功从8对夫妇的引物。葡糖基转移酶，最近证明是由除草剂安全剂解草酯在小麦诱导[31.］．与本报告一致的是，通常使用经过安全处理的幼苗作为模板制备的cDNA文库获得更强的扩增(图)6.）.分析63个子克隆导致18个不同的分离ugt.由特异性扩增产生的序列。它们的序列可以从基因库的种质AJ438327，AJ438326，AJ438330，AJ438331，AJ438332，AJ438316，AJ438315，AJ438318，AJ438320，AJ438317，AJ438319，AJ438333，AJ438335 AJ438337，AJ438334，AJ438338，AJ438329，AJ438328和下获得。

并非所有扩增的碎片都是重叠的（图7.）.因此，不可能确定它们是否与超过12个不同的小麦UGT基因或等位变异相对应。它们与不同UGT家族的代表性成员的比对表明，它们与UGT85A亚家族的UGT85A亚家族具有系统亲缘关系，起源于同一祖先A. Thaliana.和sbHMNGT．没有一个碎片对应于明显的正非SBHMNGT。

在本文中，我们研究了CODEHOP策略的潜力，从尚未提交广泛测序的生物体中靶向分离基因，并探索大型植物基因组中选择的基因家族的复杂性。特别强调了小麦作为具有复杂基因组的代表植物。CODEHOP方法被证明对广泛的植物物种的基因同源物或同源物的表征非常有用。基因搜索的重点可以通过改变引物的特异性程度(很容易通过BLAST分析检查)和选择触地PCR温度来控制。在我们看来，这种方法是成功的，因为用异种探针筛选cDNA文库(例如，用玉米cDNA筛选小麦文库)是失败的。这种方法的主要优点是能迅速提供一个具有代表性的样本，要么是等位变异和最近进化的类似物，要么是复杂基因组中给定基因的同源物。与其他方法相比，获得的有用序列比例非常高(部分引物偶占90%以上)。除了靶向搜索特异的表达序列外，它还可以完全探索单个生物中不同的P450进化支，这是之前描述的方法无法做到的。失效的主要来源似乎是局部序列或密码子偏离了共识或最频繁的使用。通过使用从基因的不同区域选择的几对引物，可以很容易地绕过这个问题。 Using the CODEHOP strategy on subgroups of phylogenetically related genes, families or clades, within large superfamilies such as UGTs or P450s is a powerful approach for exploring their complexity in various genomes. It is a very effective tool for the construction of expression libraries for agrochemical and other industrial applications. It can also be used for identifying genes from a given subgroup expressed at a specific stage of development.

一些植物的P450家族源自广泛的复制，其中一些形成了多达13个基因的集群拟南芥[7.］．一些P450科或亚科仅存在于植物的亚群中。广泛搜索CYP98在小麦幼苗中表达的基因，未发现3个以上的不同序列，均与答:芥CYP98A3．面包小麦基因组是六倍体，是连续杂交和重排的结果[32.］．这表明，三个CYP98A10，A11和A12每个基因可能对应三个小麦基因组中的一个CYP98A12这是最近最近的基因组介绍导致的最分歧。目前调查了这一假设。在与小麦中表达的少数CYP98的协议中，在其他植物物种中未检测到CYP98的广泛复制。这种观察结果与CYP98AS基因的高度守恒，以跨越CYP98基因在较高植物发育中的基本功能争论。因此，观察到强烈的生长和生育能力CYP98A3突变体[[24.]，S. Goepfert，个人沟通]。对于参与早期苯基丙醇途径和激素稳态的其他P450基因，观察到类似的保守。

的无明显同源sbHMNGT基因小麦被发现。这可以被连接到大量的dhurrin不会报告给在小麦积累，因为sbHMNGT被描述为示出用于扁桃腈底物的强烈偏好[事实30.］．然而中共检测出大量的相关基因，都属于UGT85A亚科。这并不奇怪，考虑到6个UGT85A基因在小被报道拟南芥基因组[33.］．该家族基因的这种复制可能反映了适应性进化及其在某些类型的应激/防御反应中的含义，而不是发育的必要功能。值得注意的是，从受病原菌侵袭的小麦ESTs中发现了大量ugt85a相关序列。这些基因的重组表达将为植物病原学和毒理学研究以及植物病原互作的进化生态学研究提供一个有价值的文库。

Codehop策略显示为探索植物中基因家族复杂性的强大方法，以及跨越进化的基因。CYP98S是早期进化的基因，并且在进化期间高度保守，正如在稳态和血管植物的发育中具有重要作用的基因。相反，UGT85S更具变量。没有高粱的直字UGT85B1UGT85As存在于许多植物中，也存在于小麦中。这个亚科在小麦中的巨大变异性强烈地表明了它在环境适应和植物防御中的作用。

cDNA文库

poly(A) cDNA文库的构建⁺从表达3-5毫米Triticum aestivum.（L.CV。Darius）幼苗，控制或预涂覆克罗奎丁-Mexyl（0.1％种子干重）和苯巴比妥，如前所述[34.]，在λziplox（Gibcobrl）中，T. Thomas（德克萨斯大学站）。其他cDNA图书馆由B. Camara，IBMP Strasbourg（Capsicum Annuum.)， W. Faigl, MPI科隆(水蕨richardii)， M. Petersen, phillips Universität马尔堡(柯伊斯布卢美），J.Grimma-Pettenati，CNRS图卢兹（桉树球液），J.L. Evrard，IBMP Strasbourg（Helianthus Annuus.)， A. Schaller，苏黎世联邦理工学院(Lycopersicon esculentum），D.Ernst，GSF慕尼黑（Picea amies），J. M. Frigerio，Inra Gazinet（松果体松树)， C.道格拉斯，不列颠哥伦比亚大学温哥华分校(毛果杨)及利兹大学(Physcomitrella patens.）.

生物信息学

Codehop引物旨在确保在其3'-末端和有效扩增的11-12个完全退化的核心核苷酸中对感兴趣的基因进行退火的非常高的概率，其在5'末端的共有18-25个核苷酸夹序列．夹具的设计基于可用序列和靶生物体的可用序列和密码子使用的对准。引物在他们的3末端完全退化并确保退火的高概率CYP98s要么ugts.使用Codehop Stratege设计特定序列[22.]， P450家族CYP98的基因序列为AF029856、AF022458、AA86449、C74921、D47937、AI881302、AI734373、AAG52369、AAG52373, ugt的基因序列为AAF17077、AAF18537、BAA34687。首次使用ClustalW生成多重对齐[35.]然后使用BlockMaker Server切成块[36.］．引物使用CODEHOP服务器的默认参数设计[37.］．假设服务器提出的大麦密码子使用足够接近，以获得有效的底漆设计。

根据服务器提出的底漆解决方案，选择了五个P450引物，其两者都提供了最大的PCR片段，并避免了大量P450S共同的最守恒的共识区域。在UGTS的情况下，服务器提供更广泛的选择，因此可以在与P450S相同的基础上选择5个感测和5个反向引物。

探针放大与分析

在目前的工作中，CODEHOP做法是不是基因组DNA，但与cDNA文库中，我们的主要目标是，以确定具体的植物组织中表达的基因。筛选可以在cDNA文库中直接进行，但是从噬菌体的cDNA的初步萃取后，获得更好的结果。对于提取，cDNA文库的等分试样加热到70℃10分钟，然后用苯酚 - 氯仿中的一个体积萃取。然后在50纳克使用2.6高保真（Expand高可靠性，罗氏）的的U，1.5mM的镁此模板进行PCR筛选²⁺，在聚合酶制造商缓冲液中0.3mm DNTP和0.5μm引物。PCR程序根据码普服务器的提示设计，包括连续触摸（a）和经典（b）pcr，如下：94℃的前3分钟初始变性，然后（a）20次循环1分钟94℃，在70℃（-1℃/循环中2分钟），72℃下2分钟，然后（b）在94℃下的20次循环，在58°C下2分钟，2分钟，2分钟最小72°C，最后延伸5分钟。伸长时间适应每种筛选中最大的预期片段。当用引物对获得不得获得扩增的片段时，退火的触摸起始温度降低5℃，直至实现成功扩增。

PCR产物的分析与克隆

在1％琼脂糖凝胶上分析PCR产物，并通过对超超塔（Millipore）离心，沉淀并克隆到PGEM-T载体（Promega）中来洗脱预期尺寸的片段。大肠杆菌用1/10的连接体积电穿过XL1Blue（Stratagene）。测序来自五个白色菌落的插入物。

BLASTX分析序列对来自发现的数据生成的本地数据库[33.那38.］．非P450序列在NCBI位点上是混合物。CYP98A10，CYP98A11和CYP98A12名称基于随后从CDNA文库分离的全长编码序列来分配。

Aventis作物科学及其协会DE LA RECHERCHE技术对M. M.的支持。We thank D. Little for critical reading of the manuscript and B. Camara, W. Faigl, M. Petersen, J. Grimma-Pettenati, J. L. Evrard, A. Schaller, D. Ernst, J. M. Frigerio, C. Douglas and Leeds University for providing cDNA libraries.

隶属关系

1. 法国植物分子生物学研究所植物胁迫反应系，CNRS-UPR 2357, Université

   马克·莫兰，阿兰·海恩& Danièle Werck-Reichhart

通讯作者

对应到DanièleWerck-Reichhart．

作者的贡献

M. M.调整和优化该方法，进行序列比对，引物设计和PCR片段分析。A. H.参加了对UGT家族的分析。D. W.-R.参与了设计和协调，并起草了稿件。

再版和权限