表达硒半胱氨酸甲基转移酶的转基因植物硒甲基半胱氨酸的产生

背景

越来越明显的是，饮食硒在降低人类肺癌、结肠直肠癌和前列腺癌的发病率方面发挥着重要作用。不同形式的硒在化学预防效果上存在差异Se-甲基硒半胱氨酸是最有效的。有趣的是，积累硒的植物黄芪bisulcatus（双沟毒药虫）含有高达0.6％的枝条干重Se-methylselenocysteine。这种积累硒的生物合成能力Se-甲基硒半胱氨酸提供了一个重要的代谢分流，阻止硒半胱氨酸和硒蛋氨酸进入蛋白质生物合成机制。这种代谢分流已被提出是至关重要的硒耐受A. Bisulcatus.．将这一机制应用于其他植物，可能为植物耐硒基因工程提供一条可能的途径，该基因工程非常适合于硒污染土地的植物修复。在这里，我们描述了硒半胱氨酸甲基转移酶的过表达A. Bisulcatus.给工程师Se- SE非蓄能器中的甲基硒纤维素代谢拟南芥蒂利亚纳(Thale水芹)。

结果

通过过度生产A. Bisulcatus.酶硒半胱氨酸甲基转移酶答:芥，我们引入了一种新的生物合成能力，允许非蓄能器蓄积Se-甲基硒半胱氨酸和γ-谷氨酰甲基硒半胱氨酸。的生物合成Se-methylselenocysteine在答:芥也显著提高了对亚硒酸盐的耐受性和叶片硒积累量。

结论

这些结果表明，发展转基因植物基生产的可行性Se- 甲苯细胞，以及植物中的生物工程硒耐药性。硒耐药性是工程植物的第一步，其耐硒酸盐，环境中的主要形式的植物。

硒是动物、微生物和其他真核生物必需的营养物质[1］．虽然缺乏硒在美国很罕见，但在世界上一些低硒地区，如中国，确实会发生，并可能导致心脏病、甲状腺功能减退和免疫系统减弱[2，3.］．已知过量硒的毒性作用已有一段时间了。短期摄入高浓度的硒可能导致恶心、呕吐和腹泻，而长期摄入高浓度的硒化合物可能导致硒中毒[4］．只有一种形式的硒，即硫化硒，被认为是致癌物[4］．在加州的Kesterson水库和其他地点发现了硒的生物积累和由此产生的野生动物毒性，这使得人们对植物修复硒的兴趣激增[5- - - - - -8］．环境中的硒既可以是自然地质作用的结果，也可以是人类活动的结果。美国地质调查局已经确定了16万英里²美国西部的土地富含硒，这些土地很容易受到灌溉引起的硒污染，包括4100英里²目前灌溉农业的土地[9］．各种工业和制造过程也会产生硒污染，包括矿物燃料的采购、加工和燃烧[10]，以及采矿[11］．

有趣的是，在过去十年中，越来越明显的是硒也有潜在的健康益处。研究显示，特定有机形式的硒对某些类型的癌症具有抗癌作用[3.，12- - - - - -14］．在长期双盲研究中，补充膳食SE与人类的肺，结直肠癌和前列腺癌的显着减少有关[3.］．其他研究也在模型系统中证明了硒对乳腺癌、肝癌、前列腺癌和结肠直肠癌的化学保护作用[15- - - - - -17］．重要的是，不同的硒化合物对抗癌症的功效有很大的差异[13，18］．许多研究已经证明了Se-甲基硒半胱氨酸(MeSeCys)在大鼠模型系统中预防乳腺癌的作用[16，19- - - - - -23]，重要的是，MeSeCys在防止大鼠乳腺肿瘤的发生方面的活性已被证明是硒-蛋氨酸(硒-酵母补充剂的主要成分)的两倍[18］．此外，大蒜和西兰花中的MeSeCys也被证明比酵母中的硒-蛋氨酸(SeMet)或添加了亚硒酸盐的西兰花更有效地降低了大鼠乳腺癌和结肠癌的发病率[19，21］．这种非蛋白质氨基酸硒是产生于某些植物，包括成员芸苔属植物和葱属植物属(3.，24，以及积累硒的植物，如黄芪bisulcatus［25，26］．虽然硒抗癌作用的具体机制尚未完全阐明，但多项研究表明硒具有影响癌细胞周期和诱导癌细胞凋亡的能力[14，24，27- - - - - -35］．也有证据表明硒可能抑制肿瘤血管生成[36，37］．这两种活动都会抑制早期癌症病变的进展。

植物主要以硒酸盐或亚硒酸盐摄取硒[38]，然后通过硫同化途径进行代谢，产生硒半胱氨酸、SeMet和各种S代谢物的其他Se类似物，Ellis和Salt(2003)对此进行了综述[39］．硒氨基酸与蛋白质的非特异性结合被认为是造成硒毒性的原因[40］．植物耐硒的一种机制是将潜在的有毒硒氨基酸特异性转化为非蛋白质衍生物，如MeSeCys [41，42］．一些芸苔属植物和葱属植物在富硒培养基中可积累0.1 ~ 2.8 μmol g^-1γ-谷氨酰甲基硒半胱氨酸(γGluMeSeCys) [13，15，16，21，24，43］．然而，某些专门积累硒的植物，如A. Bisulcatus.，积累高达68μmolg^-1干重Se (6000 μg g^-1干重），其中90-95％是年轻人中的mesecys [44- - - - - -46］．

硒半胱氨酸甲基转移酶(SMT)，负责硒半胱氨酸对MeSeCys的甲基化A. Bisulcatus.，最近被克隆并加以描述[47］．这些遗传物质的可用性为开发具有更强生物合成MeSeCys能力的植物开辟了一条切实可行的途径。这些植物不仅对Se具有更强的抗性，这是对Se污染土地进行植物修复的一种有价值的性状，而且还提供了抗致癌化合物MeSeCys的植物来源[44］．在这里，我们描述一下成功的使用A. Bisulcatus.利用遗传物质来工程MeSeCys在硒非蓄能器中的代谢答:芥．通过企业A. Bisulcatus.酶SMT在答:芥，我们已经介绍了一种新的生物合成能力，增加了MeSeCys及其功能衍生物γGluMeSeCys的浓度，从本质上无法检测的野生型叶片答:芥可达3.9 μmol g^-1芽干重。

硒的形成和积累

过度生产SMT答:芥(图1)增加了对照植株中几乎为零的MeSeCys的积累(图1 b)平均为0.5 μmol g^-1干重在最高SMT积累线(图1 b)， MeSeCys浓度为0.09 ~ 1.3 μmol g^-1单株的干重。在转基因植株中，MeSeCys的积累与SMT蛋白的水平密切相关1和图1 b)，证实了SMT积累与MeSeCys的生物合成和积累之间的因果关系。

为了进一步研究表面贴装过量生产的影响，采用HPLC/ICP-MS和HPLC- esi - ms从芽组织中提取硒并进行形态分化。在smt2-9的总茎叶硒中，27%在甲醇/氯仿/水萃取的水相中不可提取，并假定主要代表被同化为蛋白质的硒。HPLC- esi - ms和HPLC/ICP-MS可提取硒含量为26%，为1.16 μmol g^-1茎干重为γGluMeSeCys, MeSeCys的衍生物1， 数字2）.峰4中的硒与离子的碰撞证实了该化合物的性质m / z.= 313 (M + H)⁺［⁸⁰se]（图2、2 c)显示预测的硒同位素比率[⁷⁶SE（9％），⁷⁷Se (8%),⁷⁸SE（24％），⁸⁰Se (50%),⁸²Se (9%)] [21以及由精确的质量测量得出的一致的经验公式。γGluMeSeCys，已知在接触Se的大蒜中积累到高浓度[21),A. Bisulcatus.种子(25］．γGluMeSeCys与MeSeCys具有相似的抗癌能力[16γGluMeSeCys在体内通过转肽酶迅速转化为MeSeCys。

剩余的可提取的硒大部分在早期运行的硒峰中被洗脱，包含MeSeCys，通过在这个峰中与离子的洗脱确定m / z.= 167 [M + H-NH_3.］⁺［⁸⁰se]（图2、2)显示预测的硒同位素比率[⁷⁶SE（9％），⁷⁷Se (8%),⁷⁸SE（24％），⁸⁰Se (50%),⁸²Se(9%)]，以及由精确的质量测量得出的一致的经验公式。正宗MeSeCys标准也显示出主要的离子与m / z.= 167，表示从氨中损失17m / z.= 184(数据未显示)。这个早期运行的含硒峰可能代表了含硒化合物的混合物[43]，用强离子对试剂HFBA进一步解析，显示出三种含硒化合物的存在(图2摄氏度(1、2、3峰)。1、2峰被鉴定为MeSeCysm / z.= 184 (M + H)⁺［⁸⁰由于氨的损失，这个离子的碎裂m / z.= 167 [M + H-NH_3.］⁺［⁸⁰Se)。MeSeCys的双峰洗脱已经被观察到，尽管这是由于它的部分质子化[43］．对这两个峰中总硒的定量分析表明，MeSeCys占总可提取硒的43%(表1)1）或2.4μmolg^-1射击干重。对于该分析，使用含有使用ACCQ标签氨基酸分析系统确定的含有最高浓度Mesecys浓度的SMT2-9芽样品。Mesecys浓度为1.3和2.4μmolg^-1使用这两种独立方法量化的干重显着不同，并且我们怀疑ACCQ标签可能由于标准Mesecys观察到的衍生效率降低而低估了Mesecys的浓度。在柱上注射到柱上，用含有0.1％TFA的流动相洗脱时，仅发现17％的峰1-5被峰值1-5（图2、表1）.当使用HFBA作为离子配对试剂时(图二维)， γGluMeSeCys预计在使用条件下无法洗脱，导致注入Se的回收率降低28%(83% - 55%)。

次要的Se峰值(图2(峰5)，占可提取硒总量的6%(表1)，很可能是γGluMeSeCys部分质子化产生的双峰[43］．MeSeCys及其衍生物γGluMeSeCys占可萃取硒总量的75%，即3.9 μmol g^-1射干重，在SMT生产过剩答:芥行smt2-9(表1）.

x射线吸收光谱法(XAS)可用于直接获取纳米材料的相关信息在活的有机体内植物中硒的形成，避免了提取人为因素的可能性[41，42］．来自SMT过度生产的拍摄组织的Xas答:芥表明大多数射源Se与两个C原子(R-Se-R)相关联(图3.)，这种化学形式的硒浓度的增加与SMT生产过剩的水平成正比(图1， 图3.）.XAS结果与MeSeCys及其衍生物γGluMeSeCys占Se的大部分相一致在足底在SMT过度生产植物。XAS还揭示了次硒鎓物种的存在（图3.)，可以代表Se-腺苷硒同型半胱氨酸在酵母中的观察[21］．预计该化合物将在HPLC期间强烈保留[43，可能代表了smt2-9提取物中17%的硒含量的一部分，这些硒含量在HPLC/ICP-MS色谱柱中未被回收(图)2、表1）.

在SMT过度生产的工厂或对照组(数据未显示)中，硒酸盐暴露在植物中均未产生可检测的MeSeCys。用XAS对硒酸盐处理过的植物中硒的形态测定表明，大约70%的总硒在SMT过度生产和控制的植物中都保持为硒酸盐。这证实了将硒酸盐还原为亚硒酸盐是植物中硒同化为硒半胱氨酸的限速步骤[48，并解释了我们的观察，SMT过量生产并没有显著增加硒酸盐暴露植物中MeSeCys的生物合成。XAS形态数据也支持过量生产SMT并不影响硒酸盐还原率的结论。然而，通过将SMT过度生产的工厂暴露于亚硒酸盐，绕过了硒酸盐还原的限速步骤，在SMT过度生产的工厂中，只有1 - 4%的累积硒以亚硒酸盐的形式存在，而在控制工厂中则只有3 - 11%(图3)3.）.这种高速率的亚硒酸盐同化解释了为什么当SMT存在时，MeSeCys和γGluMeSeCys可以有效地生物合成(图1 a、1 b）.

随着MeSeCys和γGluMeSeCys的积累，地上部总硒浓度显著增加(图2)1 c）同样与SMT过度产生呈正相关（图1）.总硒从约1 μmol g增加^-1控制植物中的干重（范围31-168μgg^-1)至8 μmol g^-1干重(范围358 - 1020 μg g^-1)在最高SMT积累线(图1 c）.

硒宽容

SMT的过度生产导致硒耐抗性显着增加，SMT累积植物显示出增加的生长和减少应力相关的花青素颜料的积累（图4）.为了量化对亚硒酸盐的耐受性，我们计算了一个相对耐受性指数，该指数表示在亚硒酸盐存在和不存在的情况下，每个转基因株系生长后最终鲜重之间的百分比差异。这一相对耐受性测定清楚地证实了亚硒酸盐耐受性与MeSeCys的积累以及在4个独立的转基因株系中的SMT生产密切相关(图4 b）.MeSeCys生物合成与亚硒酸盐耐受性之间的相关性有力地支持了MeSeCys在硒耐受性中的作用黄芪［40，47］．然而，SMT生产过剩并没有增加硒酸盐的公差(数据未显示)。因为硒酸盐还原成亚硒酸盐是非常低效的答:芥而表面贴装对亚硒酸盐下游的硒起解毒作用，表面贴装对亚硒酸盐不赋予耐受性是一致的。由此，我们提出硒酸盐对植物有直接毒性，必须将硒酸盐有效地还原为亚硒酸盐才能耐受。这得到了早期观察的支持，即通过ATP硫酰化酶的过表达有效地将硒酸盐还原为亚硒酸盐[48，赋予硒酸盐在芸苔属植物juncia．谁是皮尔氏smit等。（1999）[48的研究结果表明，硒酸盐耐受是由于ATP硫酰化酶过量产生的植物中硒挥发增加所致，我们提出硒酸盐的有效降低是硒抗性增强的主要原因。我们可以预测，这些转基因植物中产生的增加的硒半胱氨酸被已知存在的低水平SMT活性解毒B. Juncia.［43］．相比之下，在烟草细胞培养中过表达ATP硫酰化酶(不产生MeSeCys)不会导致可测量的硒酸盐耐受性[49］．我们认为硒在两个生化阶段对植物是有毒的，直接如硒酸盐[41]，并通过生物合成S氨基酸的Se类似物[34］．Se hyperaccumulatorA. Bisulcatus.都能聚集硒酸盐和MeSeCys [41，46］．因此，我们提出这些植物使用SMT来解毒硒细胞，并且还可以通过利用可能涉及孤隔离到液泡中的机制来解毒硒化物。该拟议的机制尚未确定。

此外，亚硒酸盐耐受性与总地上部硒积累量密切相关，最耐受性强的品系地上部硒积累量最高(图2)4摄氏度）.这种硒积累的增加可能只是由于健康的SMT生产过剩的工厂更有效地吸收和运输亚硒酸盐。然而，另一种可能的解释是，过度生产SMT可能通过甲基化为甲基半胱氨酸(MeCys)耗尽细胞游离半胱氨酸。这种半胱氨酸的消耗将会增加硫同化酶、丝氨酸乙酰转移酶和o -乙酰丝氨酸硫醇裂解酶的活性[50，导致硒与硒半胱氨酸的结合增加。硒半胱氨酸的生物合成增加，MeSeCys的积累，有望形成硒库，推动硒在茎组织中的积累增加。

支持这一观点的是，SMT的表达确实会导致MeCys的积累，这是一种代谢产物，在正常情况下是观察不到的答:芥(数据没有显示)。甲基半胱氨酸和MeSeCys的产生浓度大致相同，在产生smt的植物中MeCys的生物合成证明了这一点在活的有机体内无论以半胱氨酸或硒半胱氨酸为底物，SMT都具有显著的甲基转移酶活性。这对比了情况在体外其中SMT以半胱氨酸为底物活性极低[51］．这样的在足底以半胱氨酸为底物的甲基转移酶活性也得到了早期观察的支持，即在营养液中增加硒酸盐浓度会导致meecys浓度增加，而在营养液中降低meecysA. Bisulcatus.［52]，而硫酸盐的增加导致MeCys的增加和MeSeCys的减少。这表明在这两种化合物的合成中有一个共同的途径。

虽然MeSeCys是最具生物活性的硒化合物之一，但活性较低的SeMet和亚硒酸盐是目前大多数营养补充剂中可获得的硒形式。通过对植物进行基因修饰，提高硒代谢酶进入MeSeCys的水平，可能为这种化学预防分子提供了一个可能的来源。本文的结果首次证明了利用硒超积累器遗传物质的实用性A. Bisulcatus.对MeSeCys富集的植物进行生物工程，如Orser等人先前提出的，(1999)[44］．拍摄的组织答:芥过度生产SMT的MeSeCys及其功能当量γGluMeSeCys的组合浓度可达3.9 μmol g^-1干重(表1)，包括2周的亚硒酸盐。在SMT过度生产的工厂中，MeSeCys和MeCys的浓度也大致相同。由于MeCys已被确定为一种化学预防剂[53[预期SMT的这种双重功能进一步提高该转基因植物材料的抗核化潜力。虽然大蒜和斜坡已经用于产生类似的Mesecys和γglumesecys的浓度[15，21]，生产植物材料需要6个月[20.]可以预期生物质产量低。将SMT基因转移到更高的生物量，快速生长和可食用的植物中的能力可能导致成本有效的制造富含植物材料的Mesecys /γglumesecys方法。

过度生产的SMT答:芥也会增加硒的积累和对亚硒酸盐的抗性。在环境中，硒主要以硒酸氧阴离子的形式存在。累积的硒酸盐的解毒需要其还原为亚硒酸盐并代谢为一种死端代谢物，如MeSeCys。因此，如本文所示，在植物中构建亚硒酸盐抗性是植物从硒酸盐中超富集硒的关键第一步。在这一过程中进一步重要的步骤将是工程增强硒酸盐在硫酸盐上的吸收，并将其还原为亚硒酸盐。在我们的研究中，SMT过量生产的工厂在含1020 μg时能够正常生长^-1叶总。对这样高的叶面内硒浓度的耐受性与自然进化的硒积累植物(如A. Bisulcatus.(25, 26)，如果在高生物量植物中繁殖，这些叶面硒浓度是在实际植物修复硒污染土壤和水所需的范围内。因此，植物对亚硒酸盐耐受的工程使我们向理想的生物工程植物修复硒的目标又迈进了一步。

植物转化与生长

从中扩增出编码硒半胱氨酸甲基转移酶(SMT1)的基因A. Bisulcatus.如前所述[45]，并在pKYLX植物转化载体中克隆[54，55花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子下游[45］．拟南芥蒂利亚纳使用农杆菌属花卉浸渍[56，转化种子选择卡那霉素。同时生成了空的pKYLX矢量控制线。选择T1植株自交，株系纯合子SMT1在T3代选择转基因。所有实验均采用散装T4种子。种子被种植在Scotts redis -earth人工混合土壤中，冷在4°C为期3天的同步萌发和生长在一个专用房间在19到24°C和10个小时的光在90到150μe . 4周后生长营养植物浇水了100μM亚硒酸钠作为进一步需要2周后拍摄组织个体植物的收割,鲜重确定,用18 MΩ水洗，用液氮研磨，-80°C保存。每个单独储存的植物样品被下采样并用于后续分析。

总枝硒分析

为了分析总硒，将冷冻植物材料的样品在60°C下干燥过夜，称量并在浓缩的HNO中消化_3.在118°C下放置4小时。样品中Se的定量使用Thermo Elemental PQ ExCell ICP-MS (Thermo Elemental, Franklin, MA)，带有镓内标准、NIST可溯源校准标准和外部漂移校正[57］．

地上部硒形态分析

为了确定可提取和不可提取的硒，将组织(0.25 g - 0.5 g鲜重)用10 ml甲醇在4°C下提取24小时，加入6 ml水和5 ml氯仿[58]通过ICP-MS在水相中和氯仿和残留组织中通过ICP-MS测量的总SE。可提取的SE在功能上定义为提取到水相中的总硒，并且未提取的SE定义为残留组织和氯仿中的总和。对于常规定量Semecys和Mecys植物样品在50mM HCl（2：1V / W）中在4℃下夜间提取，总可提取物SE的78％回收。将α氨基丁酸作为内标加入每个提取的样品中，使用ACCQ标签氨基酸分析系统（Waters Corp.，Milford，MA）衍生化和分析的样品，使用由水分离模块2695组成的水HPLC系统水2475荧光检测器。通过用真正的Mesecys标准的辅助确认色谱图中mesecys的身份证实m / z.= 354的MeSeCys[6-氨基喹啉- n -羟基琥珀酰亚胺氨基甲酸酯]AccQ标签衍生物的离子特征。ICP-MS (Thermo Elemental PQ ExCell)证实了MeSeCys组分中存在硒。在HPLC分析中，MeSeCys加标样品的回收率为100%。MeCys的身份通过与一种真实的标准液洗脱，并在50 mM HCl中提取24小时后通过GC-MS确认，随后用MTBSTFA按照标准程序衍生化[59］．通过HPLC / ICP-MS和HPLC-ESI-MS进一步分析SE格式。在50mM HCl（2：1V / W）中萃取组织，注入5μm对称屏蔽RP8（15cm×3.9mm）柱（Waters Corp.，Milford，MA）并用流动阶段洗脱- 含有0.1％TFA或HFBA的甲烷醇（99：1，v / v）在得到的pH [43］．为了定量洗脱液中的Se，收集了0.5 - 1 mL馏分，并用ICP-MS (Thermo Elemental PQ ExCell)进行分析。对于分子质谱研究，洗脱剂在FinniganMAT LCQ (ThermoFinnigan Corp. San Jose, CA)或LC-Q-Tof micro (Waters Corp.， Milford, MA)质谱系统上使用电喷雾电离进行分析。从每个转基因和空载体控制线的一个代表性植物的组织样本也被用干冰运到斯坦福同步加速器辐射实验室(SSRL)，根据我们建立的协议进行Se K-edge XAS分析[45］．

SMT蛋白量化

通过免疫印迹法测定来自单个植物组织样本的SMT生产，并通过数字化发达的免疫印迹法进行量化[45］．

该项目由NIH国家癌症研究所的STTR拨款(R41 CA80444-01, R42 CA80444-02)资助，授予NuCycle公司，并分包给DES。斯坦福同步加速器辐射实验室由能源部、生物与环境研究办公室、美国国立卫生研究院、国家研究资源中心、生物医学技术计划支持。

隶属关系

1. 植物环境压力生理中心，普渡大学，1165园艺大厦，西拉斐特，47907，美国

   Danielle R Ellis，Thomas G Sors，Dennis G Brunk，Carrie Albrecht，Brett Lahner＆David E Salt

2. 访问学者:NuCycle Therapy, Inc, Hillside, NJ, 07205, USA

   Danielle R ellis.

3. Arete Associates, Gaithersburg, MD, 20878，美国

   Cindy Orser.

4. 化学系，普渡大学，西拉斐特，在美国47907

   Karl V木

5. 斯坦福线性加速器中心，斯坦福同步辐射实验室，加州门洛帕克94025，美国

   休·H·哈里斯和英格丽·J·皮克林

6. 悉尼大学化学学院，新南威尔士州，2006，澳大利亚

   休·H·哈里斯

7. 萨斯喀彻温大学地质科学系，萨斯卡通，SK, S7N 5E2，加拿大

   英格丽·J皮克林

通讯作者

对应于大卫E盐．

作者的贡献

DES和CO共同构思DES指导工作的实验;DRE，TGS和DGB主要负责将其携带的CA携带，为转基因植物的产生，BL执行ICP-MS分析，KVW执行LC-ESI-MS和IJP和HHH进行XAS分析。

重印和权限