利用x射线微ct自动分析果实薄壁组织的三维微观结构解释了通气的差异

背景

三维高分辨率X射线成像的方法已经出现在过去几年中用于可视化的组织样本的解剖结构而没有实质的样品制备。在这些图像中的细胞和细胞间隙的定量分析已然而，难以和在很大程度上是基于手动的图像处理。我们在这里提出的自动程序，用于处理苹果的实质组织的高分辨率X射线图像（马鲁斯×有明显和梨(Pyrus Communis.L.）作为用于在单细胞和细胞间隙的水平表征3D植物组织解剖结构的一个快速客观方法。

结果

我们在苹果和梨皮层组织的三维图像中分离邻近细胞，并构建一个虚拟筛，以丢弃错误分割的细胞颗粒或未分离的细胞块。空洞网络被剥离，直到它们的基本连接特征保留下来。结构参数的统计分析表明，气孔和细胞网络的基因型之间存在显著差异，这与组织的通气特性的差异有关。

结论

提出了一种新的实质组织有效氧扩散模型，该模型不仅考虑了相互连接的空隙的弯曲性，而且考虑了空隙网络未连接的细胞间的显著扩散。这将大大有助于解释和分析未来的组织通气研究。自动图像分析方法也将支持表型和基因分型研究，其中3D组织解剖学发挥作用。

果果等体积较大的植物器官主要由薄壁组织组成，薄壁组织在呼吸等代谢过程中起重要作用。曝气(1是维持果实细胞代谢所必需的。[2，3.］．水果组织的有效氧扩散率已经被证明非常低，限制了呼吸，这可能导致在低氧条件下ATP缺乏[4］．此外，果实薄壁组织的氧扩散率在不同基因型之间也存在显著差异[5，6］．曝气性质的知识从而有助于果实生理的理解。

果实实质可以被视为具有分布在细胞之间的空间的多孔介质。多孔媒体理论表明，组织的有效扩散性可以根据分子扩散率乘以孔隙率并除以曲折因子[7- - - - - -10.］．弯曲解释了这样一个事实，即气体在组织中遵循的是曲折的空气空间网络而不是直线路径。虽然组织孔隙度很容易测量，但弯曲度取决于孔隙网络的结构，很难量化。通常，弯曲度与测量的扩散系数成反比，正如已经应用于水果中的气体扩散[10.］．利用不同的预测方法从孔隙度预测弯曲度的尝试[7- - - - - -9导致有效扩散系数的数值比在新鲜组织样本上测量的数值大几个数量级。假设植物组织结构与传统多孔介质有显著差异，导致有效扩散系数低于理论预期值。事实上，组织不一定是均匀的、各向同性的和随机的，扩散也可以通过细胞发生[3.］．可以预料，弯曲不是孔隙度的函数，而是其他结构特征起作用的。目前还不清楚哪些组织特征是决定性的。因此，有必要量化组织中影响实质组织有效氧扩散率的细胞和空隙的结构特征。

植物组织微观结构通常使用光学显微镜进行可视化[11.，12.]，可能有化学染色[13.，14.]或标记[15.], cryo-SEM [16.]或ESEM [17.］．这些技术需要侵入性的样品准备和/或预处理步骤，这是耗时的，可能会引入人工制品的图像。此外，由于这些技术本质上是基于图像的2d切片，样本覆盖范围受到所拍摄的切片数量的限制。此外，切片角度可能会导致对细胞直径或其他微观结构特征(如细胞间隙的连通性)的错误估计[3.，6］．激光共聚焦扫描显微镜允许用甚至超越极限折射决议制作三维图像。然而，即使在多光子系统其穿透深度被限制为小于1mm，并且高分辨率图像需要在细胞中[待插入的荧光探针18.］．

x射线微计算机断层扫描(X-ray micro-CT)已成为一种有吸引力的植物解剖研究3D成像工具，与其他方法相比有重要进展[6，19.- - - - - -21.］．x射线微CT可以看到组织样本的细胞和细胞间隙，不需要其他预处理，只需要从水果中切割并固定在x射线CT设备的样品支架中，在几十分钟内呈现分辨率为1微米的图像。这样可以获得足够高质量的细胞间隙图像，但细胞之间的细胞壁边界无法分辨。当应用相位反差成像时[22.，23.，细胞壁可能会变得稍微可见，但单个细胞的自动隔离仍然是不可能的，因此必须通过繁琐的手动操作进行分割。因此，单个细胞的鉴定和定量并不简单，除非用染色方法增强对比[24.，大大增加样品制备次数。以标准化的方式处理新鲜样本的层析图像可能是一个巨大的挑战[23.，25.，26.，但需要定量分析细胞的大小、形状和连通性以及细胞之间的空隙。x射线层析成像的自动细胞分析算法尚未可用，这将增强该方法的更广泛应用，以帮助理解植物的曝气。

其结果，虽然可以得到微断层图像的大数据集，将与图像处理，这通常是用于任何可视化方法是成功的主要障碍所取得的进展的需求。我们推测，植物组织实质细胞轮廓的X射线显微CT图像边界接触细胞间隙充分地使得轮廓可以使用具有先进的图像处理技术此信息完成。

本研究的目的是:(1)建立一种自动识别和表征苹果和梨果实薄壁组织三维图像中单个细胞和空洞的方法;(2)利用该方法提高对梨果薄壁组织气体交换特性的认识。该方法同样适用于其他植物器官薄壁组织的性质分析。我们选择了四种不同的经济相关性梨果基因型，它们对缺氧条件有不同的反应[4］．“会议”梨和'Braeburn'苹果对在低氧气条件下开发储存障碍特别敏感;'jonagold'不太敏感，“kanzi”是一种相对较新的品种，这几乎没有研究过。在这里，我们验证这些差异是否与由实质组织结构差异引起的通气的变化有关。

梨果皮层薄壁组织细胞的特征

以5 μm像素分辨率获得的果实皮层薄壁组织图像可以解析苹果和梨组织的细胞结构和空气空间的特征特征。1)．通过应用细胞分离协议，我们能够从每张3D图像中量化大量的单个细胞(500-1500个)。这种数字筛允许对细胞大小和形状的差异进行定量分析和统计测试，这在以前是不可能的[6］．“Jonagold”细胞平均最大，等效球形直径为210 μm，而“Conference”细胞最小(159 μm)(见表)1)．Braeburn (197 μm)和Jonagold(约拿金)的细胞大小差异不显著，而Kanzi (172 μm)的苹果细胞大小与Conference梨相似。我们能够使用算法将正态分布与测量的细胞体积进行拟合，如图所示。2（p- >正常值0.05)。不同基因型的皮层细胞数量密度1)有相同的统计差异:“Kanzi”和“Conference”的细胞数量明显大于“Jonagold”和“Braeburn”。

苹果和梨不同组织的细胞形状在很大程度上是相似的。‘Jonagold’细胞伸长最均匀，‘Kanzi’细胞形状分布最多变。苹果品种Braeburn(37.0%)、Kanzi(34.4%)和Jonagold(41.7%)的气孔面积百分比差异不显著。然而，“Conference”梨的这一比例要低得多(21.8%)，这意味着只有不到四分之一的细胞表面暴露在细胞间隙进行气体交换。这对代谢气体交换有重要的影响[3.，6］．

沼泽水果皮层中空隙网络的特征

空穴隔离协议的应用导致每个3D图像中有500至3000个空穴，用于详细量化，超出了以往更多的定性描述[6］．与细胞相比，单个空隙的大小分布表现出更高的变化(图)。3.)．孔洞的等效球面直径范围为50 ~ 500 μm。对于苹果品种来说，‘Kanzi’表现出相对较大的小空隙丰度，而‘Jonagold’的空隙是迄今为止最大的，并且在体积上与该品种的细胞相似(见表)1)．在“Conference”梨样品中检测到的空隙在大小上分布更均匀，远远小于苹果组织中的空隙。各果型的平均空隙直径存在显著差异。

我们成功地将正常分布拟合到空白大小直方图（p-值> 0.05)(图。3.)．“会议”的空隙网络显然不是正态分布的，由于有大量的小孔隙，以及作为一个小数目的高度支化大的空隙，形成空隙体积的大部分。我们试图以适应威布尔分布到直方图，但是由于一个非常大的情况下，在样品的拟合的分布是不好的一个相互连接的空隙约为750微米的当量直径。

“Kanzi”的空隙体积形状特征更类似梨，而“Braeburn”的空隙更不规则，如“Jonagold”。然而，这两组水果之间的统计差异不如细胞特征那么明显。每毫米的空隙数^3.（桌子1）是关于“会议”梨（540）相比，这些苹果样品的（28“乔纳”，77“Braeburn”和220间的空隙“坎兹”）显著更高。在虚空计数的变化是除了“乔纳金”有空隙的最小号的所有水果高。这个特性也用于空气的空间的在组织中的网络的连通性的度量。值1意味着空气空间是在整个组织的连续网络。数字越大，越断开的空隙。显然，所有的水果有显著断开无效网络，证实了早期的观测[6，19.］．

所测量的空隙，为2〜3次，只要它们的宽度，比细胞更细长的（或更窄）。所估计的空隙的表面形状是关于“乔纳”比“会议”梨显著较大，但苹果基因型之间没有不同。差异很小，但表明，在苹果个人空隙的表面积上更平均模制以适应周围的细胞，和“会议”空隙是多个管状。支化数量“会议”无效系统的（5500每毫米^3.)显著高于苹果基因型(<2410 / mm)^3.)．尽管梨组织的整体孔隙度值较低，但这意味着“会议”中的空隙网络比任何一个苹果品种都更加复杂，包含更多的连接途径。

空穴网络图显示了不同基因型的基本空穴结构和连通性。4)．很显然，“乔纳金”具有最宽的空隙，相比于“Braeburn”和“坎兹”当地最大厚度。关于“会议”梨，空隙网络示出了其中与不存在围绕石细胞空隙的典型配置可以被识别。更详细的空隙网络的图像（图4 e-h）揭示空隙的不同的微体系结构，厚度和连接的大量差。

基于所提取的骨架，我们可以计算出的理论总路径长度，其中代谢气体可以在整个不同基因型的空隙的网络进行传输。在一立方毫米，我们估计有100 mm光程的小区之间在“会议”梨分配用于气体扩散，通过大迷宫空域（表1)．总空隙长度为“会议”和“坎兹”比“Braeburn”和“乔纳”大得多。最后，在“会议”的时间越长空白网络是伴随着高度碎片化。碎片是“Braeburn”和“坎兹”，和在最低“乔纳”以下。

果实薄壁组织通气特性的关系

果实细胞间隙最重要的生理功能是促进代谢气体的运输[3.，5，6］．我们现在将研究微观结构特性是否与不同的基因型在气体输送方面相关。表观氧扩散率是果实皮层组织中这种呼吸气体交换的特征速率的量度。研究表明，该参数显著影响果实采后贮藏期间的呼吸代谢[4］．'braeburn'，'kanzi'，'jonagold'和'会议'的皮质组织的氧气扩散系数从同一品种上的以前的工作获得[5]列于表中1．‘Conference’的扩散系数明显小于苹果品种。对于苹果来说，Jonagold基因型的扩散系数最大，显著大于其他基因型。

经主成分分析(PCA, Fig.， PCA)后，测量的微观结构参数和组织的有效扩散率之间的关系在双图中以图形形式表示。5)．在这个PCA双曲线图中，分数代表苹果样本;研究了相关载荷下的微观结构特征和功能性能(O₂扩散系数)。后者应解释为从原点开始，以相应符号结束的向量。指向相同或相反方向的相关载荷向量表示较大的正相关或负相关;相互垂直的相关装载向量是完全不相关的。如果相关载荷向量指向一个分数(苹果样品)的方向，那么这意味着后者具有相应的微观结构特征或生物物理特性的正值。在两个同心圆内结束的相关载荷向量可以认为是相关的。

第一和第二主成分分别占56％和总变化的21％，这表明在大概微观结构特征的一些冗余。增加的孔隙率与细胞和空隙的小的数量和大等效直径相关联。空隙路径长度尺度与分支空隙的数量和碎片。虽然“会议”的样品具有低的孔隙率，它们的特征在于大量的空隙（也指示一个分段强烈空隙的网络）的，具有高支化度，但低的细胞 - 空隙表面积。在光谱的另一端，“乔纳金”位于，而其他苹果品种有两个极端之间的中间位置。

微观结构形状的决定因素如细胞的伸长、空洞和组织的各向异性是相互关联的，但大多数与其他微观结构描述符和功能特性无关。气孔连通性、细胞连通性和细胞表面体积比对果实皮层组织的通气性影响不大。孔隙度的有效氧扩散系数呈正相关(及其相关参数)和空洞的面积和形状,和负面关联空洞和细胞的数量,以及分支机构的数量和长度的空白网络和网络的分散程度。氧的有效扩散系数比空气的有效扩散系数小几个数量级((\ D{} _{提取成分,}\)= 2.15×10⁻⁵米²年代⁻¹)．同样在基因型差异涵盖不同的数量阶数：'jonagold'具有最高的平均值，其次是'kanzi'和'braebrun';最低价值是“会议”。每个基因型也可以注意到相当大的变异性。

果实薄壁组织有效扩散系数的相关公式

有效的属性模型以参数方程的形式存在于双组分材料中，用于解释一系列标准结构的结构效应[27.，28.］．其中，有效介质理论(Effective Medium Theory, EMT)和maxwell型结构模型更接近于观察到的薄壁组织结构。此外，这些模型仅依靠空气和胞体中的孔隙率和扩散率来计算有效扩散率。细胞扩散系数近似为水的扩散系数((\ D{} _{提取成分,w} \)）乘以溶解度：{D}_{O_2,w}}\cdot R\cdot T\cdot {H}_{O_2} \= 9.3 × 10⁻¹¹米²年代⁻¹,(\ D{} _{提取成分,w} \)= 2.75 × 10⁻⁹米²年代⁻¹，R(J摩尔⁻¹K⁻¹）通用气体常数，T温度（K）和\ ({H} _{成分}\)(0.0137摩尔米^3.kPa⁻¹)水的亨利常数。有效扩散系数的结果值(使用Maxwell-Eucken模型，Eq。5下文)为1.1 × 10⁻¹⁰米²年代⁻¹for ‘Conference’, 1.3 × 10⁻¹⁰米²年代⁻¹for ‘Kanzi’, 1.6 × 10⁻¹⁰米²年代⁻¹“Braeburn”和1.9 × 10⁻¹⁰米²年代⁻¹对于“乔纳金”。的有效扩散系数的方法，通过将细胞氧的并且将所得值比测定小得多。因此，这些近似值以上强调蜂窝扩散通路。

需要新的薄壁组织有效扩散率模型，该模型应该是平行多孔介质模型的加权和[29.“异构导电模型”[28.根据…的方法[30.]：

和ε孔隙度，τ在迂曲w该权重因子。(\ D{} _{提取成分,}\)和(\ D{} _{提取成分,w} \)氧在空气和水中的扩散率，和\（\ cdot r \ cdot t \ cdot {h} _ {o_2} \）是决定氧在水中溶解度的因素。麦克斯韦-欧几肯公式[28.用于Eq中的序列贡献。3.假设空隙的体积分散在细胞的连续基质。使用每种基因型的有效扩散的平均实验值，可以大致估计权重因子w．的价值w所有苹果基因型的变异系数均在0.90以上，而“Conference”的变异系数为0.65。即使多孔介质通过连通孔扩散的贡献相对较高，但在不连通孔之间的胞间扩散的贡献低至几个百分比，也能使有效扩散率降低近2个数量级。梨在35%时，有效扩散系数下降3个数量级。由此产生的有效值对权重因子也非常敏感，这有助于解释为什么根据组织中空洞网络的局部连通性，观察到有效扩散率的高变异性。

组织结构特征的自动处理x射线图像是可能的

使用自动图像分析的植物结构分析旨在以几种空间和时间分辨率将基因型链接到表型和研究植物生长和生理学。在线数据库中组织了来自Cell到CoLopy水平研究的最新软件解决方案[31.（www.plant-image-analysis.org)．最常见的应用是叶片分析和茎或根分生组织，基本是平面或表面结构，可以通过传统的2D光、共聚焦或电子显微镜成像，二维面积测量足以表征基本的细胞解剖。然而，对于体积庞大的植物器官的薄壁组织细胞的成像和分析，实现足够的空间分辨率来解析特定深度的特征特征是一项更有挑战性的任务[32.］．目前的作品仅达到了手动分段[33.或使用近似的图像分析方法[34.- - - - - -36.］．Dhondt等人。（2010）分析了微型CT图像拟南芥单杆子定量;然而，在X射线CT成像之前需要样品的固定，之后可以测量单个细胞体积。我们的方法测量体内样本的实际细胞体积，以及自动的完整空隙空间。

我们开发的分析植物组织三维微观结构的工作流程已经成功地应用于分离处于自然状态的单个细胞，而不需要大量的样品制备。该方法也适用于数量级为1毫米的样品^3.采用现有的台式x射线显微断层摄影技术[22.]，从而超过以往的尝试，至少有一个数量级[18.］．

The年代米一个llest voids (i.e., isolated air space volumes) that we observed measured 6.9 × 10⁻⁶毫米^3.，对应于51个图像体素。默认情况下，默认情况下默认拆除较小的空隙。

尽管相比于典型的细胞大小的样本大小为大时，人们认识到，相对大的空隙可以水果组织中存在。所使用的协议中的样本大小的范围disfavours这样的空隙尺寸，因为这些具有相交的体积边界的较高概率。较大的样本量是可能的;然而，这是以降低图像分辨率和图像质量的损失[牺牲19.，22.］．x射线CT技术的进步将需要克服这一限制。在这项研究中，其体积已经超过了代表性基本体积(REV = 1.3 mm)的10倍以上^3.)测定苹果组织[19.］．然而，该REV仅用于整体孔隙度，而不是用于评估其他单个微观结构特征，因此，应该重新评估。在“Jonagold”的情况下，排除边界相交的空隙导致64%的空隙体积在分析中被丢弃，而“Braeburn”、“Kanzi”和“Conference”的这一比例分别为34、42和49%。因此，实施了一种基于在计数过程中对较大的空隙分配较大权重的纠正措施。

细胞分水岭分离有利于不规则球形细胞的分割。不同图像处理步骤去除的细胞组织体积分数如表所示2．除去大部分组织体积，用于接触图像边框（40％）。较小体积的细胞材料（约20至30％）仍然不直观，除去进一步分析。通过排除更极端的细胞形状，去除这些聚类细胞可能影响结果。然而，考虑从每个组织样品获得的大量细胞，结果可能是果组织的代表性。由于在原始X射线CT图像上测量空隙体积和形状描述符，而没有流域分析，这并非如此。

空洞网络的碎裂降低了组织的有效扩散率高达3个数量级

虽然有效扩散高度相关的孔隙度（图5），其它组织特异性特性需要考虑。曲折是最显而易见的选择。利用现有理论的多孔介质模型[8，组织弯曲度为1.4 ~ 4.2，孔隙度为25.4% ~ 5.7%。计算得到的有效扩散系数平均为2.7 × 10⁻⁶米²年代⁻¹“Jonagold”和7.0 × 10⁻⁸米²年代⁻¹对于“会议”，或200至300倍小于平均实验值。水果的皮质组织，以及最可能植物组织，因此不能被认为是用于气体交换的常规多孔介质，其中孔隙率是主要参数。测量的空隙形状因子也可以被解释为饼干（表1)．这个值的平方可以是对弯曲系数的合理估计[9］．这使得所有基因型的有效扩散系数值都很高，即1.0 × 10⁻⁶米²年代⁻¹，9.9×10⁻⁷米²年代⁻¹，5.9×10⁻⁷米²年代⁻¹3.4 × 10⁻⁷米²年代⁻¹对于“乔纳金”，“Braeburn”，“坎兹”和“会议”，分别。这些值比实验值较大倍100和1000之间。必须指出的是，空隙形状因子具有与图氧扩散率的正相关性。5；这与多孔介质理论不符。因此，这种形状因素可能不是弯曲的真正指标，或者更有可能是其他因素主导了扩散过程。

每个空隙的平均路径长度从“Conference”的0.19 mm到“Jonagold”的0.43 mm不等。因此，在厚度为几厘米的皮层组织中，不太可能通过多孔介质扩散的空隙找到一个完全连接的通气网络;因此，多孔介质假设失效，必须考虑网络的不连通性。每毫米的空隙数^3.成交量确实表达了虚空网络断开的事实。数目为每28毫米^3.“Jonagold”为540每毫米^3.“会议”。数字7很好地说明了该参数对氧扩散率和孔隙破碎指数的重要意义。

因为空隙网络断开连接时，通过将细胞扩散，必须考虑到用于在组织中有效扩散。有效扩散只会变成零，否则为气体不能通过断开无效网络扩散。这就解释了为什么暴露于空域的细胞的分数面积是正到有效扩散（图相关。5)．在组织中的这种性质越大，细胞 - 空隙界面的更好的气体扩散，这是具有断开孔隙的低孔隙率组织中的重要途径。所有基因型中特定空隙表面积的值确实高（表1)．电池和空隙的等效直径是相同的重要参数。在具有断开的空隙的组织中，气体扩散的机理不再遵循简单的并联机制，使得有效扩散性是空气空间和细胞中的扩散的孔隙率加权之和，而是空隙和细胞的相对厚度串行层模型也很重要。以前提出了用于组织有效扩散性的平行模型[10.，29.因此]应当改进以包括通过蜂窝或细胞壁通路串行扩散的效果。这样的模型公式公式假设。（3.)．

方程(3.）可以是基于在文献中和符合测量扩散系数的当前观测已经可用类似方程的组合呈现的组织的氧扩散率的新的参数方程。因此，它并没有提出新的建模方法。在过去，我们已经开发并应用了新的建模方法，直接计算从多孔结构的三维微观几何形状的组织有效扩散[3.，37.，38.］．虽然这是一个有效的方法，它依赖于3D显微CT图像的可用性那需要对计算使用来处理。此外，它是有启发性量化这微结构性质恰恰是行列式的扩散率。这是现在大多数明确，第一，主成分分析，二是所提出的参数方程，原则上可以，而不需要实际的显微图像来解决，但需要通过影像或其他方式确定的相关参数。”

这是很难找到式中的权重因子之间的良好的相关性。（3.)和表中的平均结构参数1．很明显，这在很大程度上取决于空洞网络的破碎特性。物理模型取得了重大进展，而不是发展统计相关性，直接从组织结构计算有效扩散率，与实验确定的值相匹配[3.］．这种建模方法直接依赖于精确的组织解剖的三维计算机模型，而不需要进行组织结构分析。然而，使用本文开发的分析工具可以进一步支持这种建模:统计属性可以用作为这种计算模型生成虚拟组织的基础。目前正在为此目的开发不同的植物组织生成算法[39.- - - - - -42.］．此外，在其他植物曝气研究中，该建模方法已成功应用[43.- - - - - -45.］．

不同基因型果实组织特性与缺氧反应的关系

在这里学习的基因型的最佳储存条件有很大不同。对于长期存储，“乔纳金”通常被保持在1kPaÒ₂， Kanzi在2kpa O₂“Conference”和“Braeburn”在2.5 kPa O₂［46］．事实上，存储澳效果₂利用氧气扩散率值结合基因型各自的呼吸动力学可计算出水果内部发酵风险的分压[4，47］．这种分析表明，“乔纳”（具有相对较高的扩散率）可以被存储在低Ô₂当O₂“Kanzi”、“Braeburn”和“Conference”(组织扩散率较低)需要分压。

本文所描述的方法提供了细胞大小和形状的分布，以及组织结构和空隙网络的定量描述，这可以导致更好的植物解剖学理解和模型。通过对活体水果样品中单个细胞的计数和表征，以及由此获得的几何信息，我们实现了与组织通气有关的水果微观结构的详细了解。结果表明，3个苹果品种和梨品种的氧扩散率在结构上存在显著差异。这些微观结构信息对于解释甚至预测与气体交换有关的紊乱是有价值的。我们建议使用这种方法作为研究工具来创建详细的组织库，其中包含不同的3D几何模型(“cybertypes”)，可以用于生成支持一般植物研究的硅组织模型。在实际应用中，本文提出的协议是在一个用于3D图像处理的商业软件中开发的，在其他环境中实现时需要重新编程。

苹果和梨的水果样品

“会议”梨(Pyrus Communis.)、“Jonagold”、“Kanzi”和“Braeburn”苹果(马鲁斯×有明显Borkh。）分别在米兰（比利时）的果实研究站的实验果园里生长，分别于17 / 09/2006，04/10/2010和2010年2月25日收获，这是每种品种的长期储存的最佳商业采摘窗口，由Posttharvest技术（VCBT，Leuven，Belgium）确定。

从采集到实际的x射线CT扫描之间的时间从“Braeburn”的19天到“Conference”和“Jonagold”的2个月不等。在贮藏期间，水果被保存在凉爽的房间里，在最适宜的长期贮藏温度下，在正常气氛下(Braeburn为1°C, Kanzi为4°C)或控制气氛条件下(Jonagold为1 kPa O2, 2 kPa CO2和0.8°C;- 2.5 kPa O2， < 0.8 kPa CO2， -1°C for ' Conference ')。苹果的抽样是按标准方式进行的。一个直径为5.98 mm的圆柱形样品，用软木孔沿果实赤道径向切除。在苹果的例子中，这是从水果裸露的一面，而梨是在一个随机的位置。用手术刀切开亚样本(5毫米高)，直接去除皮肤下和核心(果皮)内的组织，只取样所谓的皮层(托杯或苹果果实的附属组织)。对每个品种的4个不同果实的样品进行了测定。

x射线CT扫描

根据Herremans等人(2013b)的报道，使用SkyScan 1172系统(Bruker microCT, Kontich, Belgium)获得了新鲜“Conference”、“Braeburn”和“Kanzi”水果组织的x射线CT图像。“Jonagold”皮质组织的3D显微结构是由Verboven等人(2008)从欧洲同步辐射设施(ESRF，法国格勒诺布尔)的ID19束记录的同步辐射断层扫描图像获得的。重建数据集得到了一个由各向同性体素组成的3D堆栈，对于Braeburn、Kanzi和Conference的图像，单个像素测量5.14 μm，对于Jonagold的图像，测量5.08 μm。该像素分辨率足以显示果实薄壁组织的空气空间和细胞轮廓。在0.7 μm和5 μm像素大小的图像中，三维空间体积和形状相同[6];while lower resolution (pixel size > 5 μm) results in loss of image quality [19.］．所述像素值对应于线性的X射线衰减系数，虽然有一定的分辨率和信噪比方面比较桌面X射线CT，以同步加速时的差异显示为0和255之间的校准的灰度值X射线CT图像时，由于类似的像素尺寸并且由于定制的图像处理协议所产生的3D图像栈得到相同的结果。

组织解剖分析算法

图像预处理

micro-CT图像数据集(10.28 x 10.28 x 5.39 mm)^3.)的侧面进行修剪，以从图像中去除周围的聚苯乙烯泡沫区域。因此也排除了6 - 7个细胞层，以去除边缘因切割样品而损坏的细胞。剩余的棱镜体积测量2.1 x 2.1 x 3.1毫米^3.，被发现代表皮层组织[19.］．通过大津阈值法可以很容易地将果实皮层组织中的细胞从细胞间隙中分离出来[48]因为图像中的两个不同区域之间的良好对比。

细胞隔离

图像中的3D区域被识别为细胞，需要细分为单个细胞。算法的不同步骤如图所示。6．为了区分二值图像中的相邻细胞，我们优化了一种专门的图像处理工具，称为分水岭分离，特别适合分离触摸、凸特征[49］．该算法通过计算二值图像，其中灰度级表示从该像素到最接近的黑色（背景）的像素的距离的欧几里德距离图（EDM），与方向无关。的EDM可以被看作是一个高度图表，产生在每个小区的中心的山峰。在地形的洪水，水会流下来的山峰和下坡运行，直到它到达谷底。在当地山谷地区被水从不同的山峰向下运行到达。除去这些点分离的峰，并且相应地分离在二进制图像中的各种细胞[50，51］．

在流域分离后，移除了与数据集边界相交的所有细胞以从后来的形态分析中排除不完全的单个细胞。基于文献数据[6，52)和人工细胞分割,平均细胞大小和细胞球形指数(比一个球体的表面面积,体积相同的细胞,细胞的表面积)被用来构造一个虚拟筛丢弃错误分割细胞颗粒或未分离的细胞碎片。单个物体长度均大于400 μm(不同苹果品种的平均代表性直径为200 μm [52]），并用球形指数低于0.75从3D模型中除去，仅保留正确分离单细胞。该协议由手动分割单个细胞在3个数据集验证（附加文件1：S2）。计算出的卷分布在统计上进行比较。对于自动隔离协议和手动专家分段，没有发现显着差异（意义水平0.05）。细胞分离算法在Avizo Fire（France）中实施，并在附加文件中详述1: S1。

无效的网络分析

空气空间可以被认为是通过较窄通道互连的单个空隙的集合（图。7)．为了识别单个的空隙，它足以评估每个空隙体素与周围26体素的结构元素的三维连通性。这意味着具有至少一个公共顶点的体素被认为是相互连接的，并且属于同一个空洞。

为了正确地计算单个空隙的数目，调整已被以校正由用于空隙相交的图像边界。由于这些空隙可视场的边缘之外彼此连接，空隙数目将被高估。的溶液包括执行所有对象的加权计数不接触任何边缘[的49］．这样的策略被称为“数-Lantuéjoul校正” [53］．加权计数补偿了具有特定维度的空白接触数据集边缘的可能性。每个void的权重调整计数是一个实数，大于以下定义的一个:

在哪里我_x,我_y和我_z图像的尺寸是否在X，Y.和z的方向,P_xP_y和P_z的最大投影尺寸孔隙的方向,由计算得到相应的Feret直径的空白,仿佛空洞的卡尺测量,以确定平行平面之间的距离3 d图像栈,和切向空白。因此，不太可能接触或越过图像边缘的小空隙大约每一个都算作一个;而较大的空洞更有可能接触或越过图像的边缘计数一个以上。

除了空穴分析，空穴网络骨架的构造揭示了组织中的空穴是如何连接的。专用骨架算法[54]的实施，基于变薄的过程，它由从二值化的空隙空间的体素的体素删除直到仅连接体素遗体的字符串。初级输出是中心线的空间图形表示，维持必要的空隙拓扑和到最近的空隙 - 细胞边界的欧几里德距离被存储在作为本地厚度属性的空间图形对象的每一个点。得到分离的空隙的三维二进制图象栈和进一步使用Avizo消防软件（VSG，法国）的骨架化模块处理和在其他文件中详述1: S1。

结构参数计算

特定结构参数是不同组织的空间和细胞的相关定量描述符。我们计算细胞和空隙的孔隙率，体积，表面和等同的直径分布，细胞体积计数和细胞的伸长，直接从个体细胞和空隙图像中的空隙。还计算了暴露于空隙空间的细胞表面的级分。

为了表达的空隙表面的在其细胞之间的突起方面的形状，我们计算了空隙的表面形状为实际测量的空隙表面面积之比一个_v和圆柱体的表面积(一个_V，Cyl.)V和等效直径d_情商：

通过将所有分支的长度相加，估计出整个空相中分支的总路径长度。从空穴骨架的拓扑结构中提取分支点的个数来评估其复杂性。

各向异性表明在皮层组织中存在一种优先方向的空隙。它是通过执行平均截距长度分析来计算的，在该分析中，线的网格基本上是通过大量的3D角度通过二元空隙空间发送的。网格线和空隙/细胞间相之间的截距的数量和长度在所有这些角度上进行计算。不同3D角度的平均截距长度不同，表明空间组织各向异性[55］．

破碎指数是通过在表面积在空隙空间的体积的变化而变化的由图像扩张的比例计算出的[56］．相对较低的值表示连通较好。然而，这个数值没有物理意义。

结构参数在商业软件CTAN 1.12.0.0（Bruker Microct，Kontich，Belgium）和Avizo Fire Edition 8.0.0（VSG，Bordeaux，France）中计算。

果实薄壁组织的氧扩散率

使用Ho et al. (2006a)开发的测量装置测量苹果和梨水果样品的薄壁组织扩散率。不同苹果基因型的内皮层有效组织扩散率的值以前由[37.];那些梨由[57］．

采用SAS Enterprise guide软件4.3 (SAS Institute, Cary, NC, USA)和Unscrambler软件10.1 (CAMO software, Oslo, Norway)进行统计分析。

S1。Avizo Fire软件中的组织解剖分析程序

S2。自动单元隔离算法的验证

支持本文结果的数据集将在http://www.biw.kuleuven.be/biosyst/mebios/mebiosdownloads.．

财务资源:通过科学和技术促进创新研究所(IWT-Vlaanderen，批准号093469,SBO项目TomFood)，弗兰德斯科学研究基金(FWO Vlaanderen，项目G.0603.08，项目G.A108.10 N)，大力神基金会，鲁芬大学(项目OT/12/055)和欧盟(项目InsideFood FP7-226783，本文件所表达的意见绝不反映其官方意见或其代表的意见)。

隶属关系

1. BIOSYST-MeBioS，鲁汶大学，威廉·Croylaan 42，3001，比利时鲁汶

   Els Herremans，Pieter Verboven，Dennis Cantre，Metadel Abera＆Bart M.Nicolaë

2. Postharvest Technology的佛兰德斯中心，Willem de Croylaan 42,3001，Leuven，Belgium

   Bert E. Verlinden & Bart M. Nicolaï

3. MTM，鲁汶大学，阿伦贝尔Kasteelpark 44，3001，比利时鲁汶

   马丁尼威夫

通讯作者

对应到彼得Verboven．

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

EH进行的X射线CT测量，显影的图像分析协议和起草的手稿。DC和MA参加了图像处理和稿件写作。BV协助统计分析。PV负责指导这项研究，参与其设计和协调，并协助起草了手稿。MW和BN发起和协调研究。所有作者阅读并认可的终稿。

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