WheatExp:多倍体小麦的RNA-seq表达数据库

背景

对于功能基因组学研究，重要的是要理解不同组织中转录基因的动态表达谱，发育阶段和响应环境刺激。工厂研究界使用下一代测序技术的增殖导致大量表达数据的积累。然而，通过经济学重要的作物物种之间的多倍体频繁发生，对这些数据集的分析是复杂的。此外，处理和分析这种大量的序列数据是一种技术和耗时的任务，限制了它们在功能基因组学研究中的应用，特别是对于缺乏对高功率计算基础设施的较小实验室。小麦是具有三种类似基因组的幼多水合物种的一个很好的例子（同源基因中相同的97％），迅速积累RNA-SEQ数据集和大型研究界。

描述

我们提供了一个表达数据库和可视化工具WheatExp，用于分析和比较多倍体小麦不同发育阶段广泛组织的同源特异性转录谱。从公开可用的RNA-seq数据集开始，我们开发了一个管道来区分来自四倍体和六倍体小麦注释基因的同源转录本。多个研究的数据经过处理并编译成一个数据库，该数据库可以通过BLAST或通过搜索一个已知的感兴趣的基因的名称或功能域来查询。多个基因的表达数据可以在所有表达数据集上并排显示，为小麦基因的特定子集提供了一个全面的表达数据面板。

结论

在gringenes网站上开发了一个公众可访问的表达数据库http://wheat.pw.usda.gov/wheatexp/-再加上一个简单和易于比较的可视化工具，将使小麦研究团体能够使用RNA-seq数据，并执行目标基因的功能分析。所提供的表达数据是同源特异性的，允许分析每个基因组对一个基因总体表达的相对贡献，这是育种应用的一个关键考虑。我们的方法可以扩展到其他多倍体物种，根据其基因组的特定差异调整序列作图参数。

谷物作物提供了人类消耗的大量卡路里（http://faostat3.fao.org/）因此维持和改善当前的生产水平对于为不断增长的世界人口提供粮食安全至关重要。为满足这一需求，将需要持续和专注的研究努力，为限制农业生产的最紧迫问题的解决方案来说，将需要解决方案[1]．这项研究的一个重要方面将是鉴定和功能特征的基因调控的发育阶段，最关键的决定产量和基因，帮助植物适应变化的环境。分析每个基因的动态表达谱，以描述它们在发育过程中、在不同组织中以及在特定环境刺激下的转录调控，将是功能遗传学研究的核心。

在许多经济学 - 重要的作物物种中，这种研究通过多倍体复杂化，在单个核中存在两种或更多种同种型基因组。多倍体在植物物种中普遍存在，并认为帮助工厂适应不同的环境条件[2]．这种增加的适应性是通过增加多聚体蛋白质复合物的多样性和全局基因冗余的可能性，在某些情况下可以随后进行基因分歧和亚或新官能化[2]．

小麦是新近出现的异源多倍体物种的一个例子。二倍体种小子-Aegilops.复杂从蛋白质编码区域平均相同的3-5毫升彼此分歧，平均相同97％[3.]．二倍体的杂交t . urartu(AA基因组)和一种Sitopsis小组（BB GB Genome）小于500,000年前，产生目前主要用于意大利面的四倍体小麦物种（AABB基因组）。四倍体小麦的杂交山羊草属tauschii不到10,000年前导致目前用于制作面包和糕点的六倍体小麦（AABBDD基因组）[4]．

小麦基因组的复杂性，以及它的经济重要性和大型公共研究和育种社区的存在，使小麦成为建立表达数据库和分析和区分同源基因所需工具的理想目标。这现在是可能的，因为国际小麦基因组测序联盟(IWGSC)最近发布了一份小麦基因组同源特异性草案。[3.]和多个RNA-seq表达数据集的发表[5- - - - - -10]．

为了组装小麦草案基因组，首先使用流式细胞术根据尺寸分离单个染色体臂。这允许分别测序和随后随后组装各优化染色体臂。这与广泛的努力结合使用物种特异性转录物和预测算法以及手动注释来注释基因编码区。注释的基因集经常更新和释放Ensembl.基因组平台(11]．因此，综合转录谱首次可以直接用于六倍体小麦的功能基因组学研究，包括精确分离不同的同源基因。

近来，通过提供在大深度序列的能力序列多种生物样品的整个转录组，一种称为RNA-SEQ [12]．下降的测序成本和简化的图书馆施工协议导致不同植物物种中的RNA-SEQ研究的增殖[13]．越来越多地，从这些研究中生成的大量的原始测序数据存放在在线存储库中（例如，序列读取存档[14]，基因表达综合[15]或欧洲核苷酸档案[16])。除了这些研究的作者所涉及的具体研究问题，这些数据集还代表了更广泛研究界的丰富信息来源。然而，处理和分析这种大量数据是一种技术上困难，耗时的任务，需要生物信息学专业化和访问具有高性能基础架构的计算集群。这限制了小型研究实验室和个人研究人员从RNA-SEQ研究中获得的丰富信息中受益的能力。为了解决这些限制并提供简单的免费访问此数据，我们开发了一种管道，用于使用小麦作为测试用例分析多重基因组中的转录组族数据。在这里，我们呈现惠夫（http://wheat.pw.usda.gov/wheatexp/），RNA-SEQ表达数据库和可视化工具，促进在多倍体小麦各种发育和组织样品中的分析和比较副转录物谱。

数据来源和生成

WheatExp中包含的所有数据都来自存储在在线序列存储库中的RNA-seq读取[14- - - - - -16]．目前，包括六项互补研究;跨多个时间点的五种不同组织的广泛研究[5，幼苗光形态建成的研究[6]，小麦幼苗干旱和热胁迫的研究[7]在单个时间点进行小麦晶粒层的研究[8，衰老的叶子时间过程[9[开发过程中不同谷物组织层的时间表[10] （桌子1）.组合，这些数据集代表多种组织，发育阶段和环境治疗的各种小麦表达数据。

我们设计了一种特定于多倍体小麦序列数据的管道，用于使用均匀的工具和质量控制来分析先前公布的RNA-SEQ数据集。我们的管道的输出是IWGSC项目的所有注释的小麦基因的一组表达值。简而言之，原始的RNA-SEQ读取首先使用两个开源包装的质量和适配器污染，“镰状”(https://github.com/cucdavis-bioinformatics/sickle.)和“长柄大镰刀”(https://github.com/vsbuffalo/scythe)，确保在生成表达式概要文件时只考虑高质量的读取。修剪后的阅读被映射到全套注释的同源特异性小麦转录本Ensembl.使用BWA的基因组平台[17]．使用“独特映射的读数”Htseq-count“[18]，然后根据定位率、转录本长度和文库大小进行调整，得出每个基因的RPKM/FPKM(转录本每千碱基每百万mapping Reads的Reads/Fragments)值。这种规范化意味着在数据集中，表达式值可以直接在不同的组织和发育时间点进行比较。虽然每个数据集使用了相同的参考，但由于不同数据集之间测序读取的数量和长度的差异，不同数据集之间的比较不太可靠。我们选择映射参数来报告序列比对/映射(SAM)文件中映射质量(MAPQ)评分为40的读，这个值表示该读是唯一映射的。不明确映射到多个同源词或其他相同序列的读取具有较低的相关MAPQ评分，因此在这一步中被排除。表格1报告应用此选择条件后从每个数据集映射的读的百分比。在所有6个数据集中，平均50.1%的reads被唯一绘制，导致每个基因的同源特异性表达数据。一般来说，长读(101 bp PE读)的数据集比短读(50 bp SE读)的数据集产生的唯一映射读比例更高。

网络实现

web界面是使用几个不同的编程包构建的。大多数项目的代码基础是PHP (https://secure.php.net/）和javascript（https://www.javascript.com/）.通过PHP数据对象(PDO)模块执行到后端的关系数据库查询，从而实现安全查询。使用PDO模块的另一个好处是，代码与标准数据库引擎，如MySQL, PostGreSQL和SQLite兼容。为了显示数据的动态图形，我们实现了HighCharts JavaScript库(https://github.com/highslide-software/highcharts.com.）.具体来说，该项目使用PHP模块，该模块在Github上自由地提供高级曲线曲面脚本库（https://github.com/ghunti/HighchartsPHP）.对于网站部分的动态文本搜索，该项目使用JQuery 1.11.3包实现异步JavaScript和XML (AJAX)技术。https://jquery.com/）.编写自定义PHP和JavaScript代码，以开发一个前端网站，以启用BLAST [19]搜索并选择表达式显示的多个结果。该网站的前端是用爆炸搜索用HTML和JavaScript编写的[19[Ajax基因标识符搜索表单允许用户选择表达式显示的多个结果。

数据库实现

数据库实现使用灵活的存储模式来容纳数据。存储表具有以下MySQL（https://www.mysql.com/）存储数据类型：Study_ID（varchar），seq_id（varchar），组织（varchar），均值（float），se（float），se_ow（float）和se_high（float）。实施二进制搜索树索引（BTree）以增加使用Scoary_ID和SEQ_ID列的查询的速度。

系统架构

Wheatexp工具在以下URL处于Graingenes服务器上安装在Graingenes服务器上http://wheat.pw.usda.gov/wheatexp/．GRAingenes是一个国际公认的基因组和遗传资源数据库Triticeae和燕麦属物种。该网站和数据库运行在ThinkMate ThinkTank IQ4系统上，该系统配备4台2.00 GHz、52 GB RAM的英特尔Xeon E7-4820。它目前运行的Linux Kernel 3.13发行版Ubuntu 14.04长期支持PHP版本5.5.9和MySQL版本5.5.43。

Web界面

WheatExp主页包括数据库和项目设计的简要描述，以及当前所有可用数据集的详细信息(图。1）.我们的数据处理流水线允许在发布的情况下快速加入互补的RNA-SEQ表达式数据集，我们邀请了从用户社区添加新数据集的建议。我们预计会定期扩展数据库，以扩大包括的发展和时间表达方式。这种方法将最大化数据库的实用性，用于研究小麦开发的不同方面的研究人员，并确保访问最相关的高质量表达数据集。

从这个主枢纽(图。1），可以以两种方式之一询问数据库;通过输入利益基因的DNA或蛋白质序列作为爆炸查询，或者通过文本搜索来自的已知基因IDEnsembl.基因组学注释平台[5]（例如，Traes_6as_9e38a95cb.1）或与基因编码蛋白质相关的注释功能术语（例如“bhlh”或“细胞色素p450”）。对于BLAST搜索，结果显示在新页面上，并包括每个BLATE对准，序列和外部相应基因ID页面的链接的详细信息Ensembl.基因组学枢纽用于简单的交叉引用（图。1 b）.最多可以选择六个匹配的结果并排显示在同一个图表中，以允许多个基因之间的简单比较。虽然这一功能最初是为了在小麦同源基因之间进行比较，但任何一组最多6个基因都可以被选择进行比较，不管它们的关系如何。

同样，当使用文本搜索功能浏览时，最多可以选择6个基因添加到结果列表中，这些基因随后可以在结果窗口中并排显示。对于更大规模的分析，任何数量的基因的表格表达数据可以通过提供列表下载Ensembl.感兴趣的基因ID。与每个基因相关联的功能术语通过从IWGSC中的GFF3格式中的标准基因注释文件获得，该IWGSC存储在数据库中进行文本搜索功能。我们选择遵守IWGSC和IWGSC使用的广泛使用的标准基因名称格式格式Ensembl.基因组平台(5]，并从该平台中选择一组注释的cDNA序列作为我们的mapping参考。结果中包含了每个基因注释序列的外部链接。这种命名格式正日益成为植物研究界基因注释的标准，因此我们使用这种参考文献将允许项目之间的简单翻译，并将与IWGSC项目保持互补性。这将促进比较基因组学研究模式植物物种和其他经济上重要的作物，如水稻、大麦和玉米，作为包含在基因组资源Ensembl.这些物种中的每一个的平台都会有所改善。另外，可以使用更恒定的相关物种进行比较，以分析在进化过程中的功能基因分解。

所有数据集的图形表达式概要显示在一个单一的结果页面上，显示平均RPKM/FPKM值+/−标准误差平均值(SEM)(图。1 c）.可以下载四种图像格式之一的图形，数据也显示在附带的表格中，可以导出为“。csv”格式(图。1 c）.基因级表达数据可以单独下载，也可以批量作为包含所有数据的单个表格文件。

表达数据

WheatExp中的所有表达谱都是由RNA-seq数据集生成的。这种方法比现有的来自微阵列数据的表达研究有几个优势，后者直到最近都是用于大规模表达分析的标准技术(如“植物表达数据库(PLEXdb)”，一个基于微阵列的不同植物物种表达谱数据库[20.])。RNA-seq的优点之一是它是一个开放的平台，不依赖于基因芯片上预先确定的探针集。此外，与微阵列相比，该技术在更大的动态范围内提供了更可靠的表达谱分析。

在多倍体物种中施用RNA-SEQ数据的一个重要优点是它通过允许应用严格的读取映射阈值来促进同源种子和最近分散的逐渐脱离基因的区别。我们只有独特映射的读取的选择具有双重益处，即表达数据不仅是鲁棒的，而且特定于同种型，因为这些基因组（平均97％相同）之间的差异由所选择的映射参数区分。这在图2中示出。2两个例子：生物钟ASSOCIATED1，其中三种同源基因的表达近似相等（图。2A） 和CONSTANS1其中d -基因组同源物贡献了大部分转录本的整体表达(图。2B.）.

模拟RNA-seq数据

使用unique -mapped RNA-seq reads进行表达分析的一个缺点是，任何可以很好地映射到不同基因中相同区域的reads都会被丢弃，可能会导致对高度相似基因表达水平的低估[21]．为了确定在我们的数据库中这种影响的程度，我们进行了一个模拟RNA-seq实验。我们生成了29.4 M合成100bp对端读取随机表达水平和Illumina HiSeq2000错误配置文件(' ART '，模式ART - Illumina，默认参数除了-m 500，−s 100 -ss HS20 [22])。所有读取都使用与所有生物RNA-seq数据相同的管道进行处理。通过比较已知的模拟读数和映射读数，我们可以确定每个contig在映射过程中丢弃的读的比例。使用之前研究中确定的3476个同源三胞胎(= 10428个基因)[7，我们将来自每个同源基因的reads子集映射到只包含其原始基因组的参考文献(即a基因组reads被映射到a基因组转录本等)。在A、B和D基因组中，平均分别有98.6、98.4和98.4%的reads被唯一地定位到它们的起始转录本上，这表明当同源基因从参考中缺失时，只有一小部分reads在定位过程中被丢弃。当我们将生成的所有reads重复映射到完整参考文献时，A、B和D同源三胞胎的唯一映射率分别降低到82.4、83.6和80.6%。在每种情况下，这都比我们数据集中所有剩余的转录本(84.4%)的唯一映射率略低。尽管映射率降低了，但我们观察到生成的读的数量和观察到的映射读之间存在高度的相关性(r = 0.95, 0.96, 0.95，对于a, B和D同源三胞胎，图。3.）.因此，虽然我们数据库中同源基因的估计表达水平由于序列相似，平均而言略有降低，但报道的表达水平仍然与真实表达水平密切相关。此外，这一效应对于来自三个同源小麦基因组的转录本大致相同(图。3.)，表明在比较感兴趣基因的同源特异性表达谱时没有偏倚。

限制

WheatExp的主要应用是比较一个基因在不同组织、发育阶段、环境条件和遗传背景下的不同同源物的相对表达水平。对于对比较不同基因表达感兴趣的用户，我们在网站上添加了一个声明，说明只有当被比较的基因在参考基因组中具有相同数量的同源物时，基因之间的比较才有效。根据我们模拟RNA-seq实验的结果，参考文献中缺失一个同源基因的基因会呈现更高比例的unique -mapped reads，而缺失同源基因的不正确的mapping也可能会夸大剩余两个同源基因的表达水平。此外，对于任何在当前IWGSC释放中缺乏注释的基因，以及任何在参考装配中重复的contig装配，将不会报告任何表达数据，从而减少唯一映射读的数量。然而，我们的项目设计允许定期更新和细化映射引用，因为这是通过IWGSC项目扩展的。随着映射参考的改进，我们将重新映射和重新处理每个数据集，使用新版本的引用生成更新的表达式集，减少这种偏差的发生率和影响。

我们的方法和数据分析管道可以应用于其他多倍体物种，其同源特异性基因组组装可用作参考。在此应用程序中必须考虑的一个关键参数是同系词之间的平均同系词水平，因为这将影响惟一映射读的阈值的选择，从而影响区分同系词的能力。

来自RNA-SEQ研究的表达数据量增加代表了植物研究界的有价值的信息来源。我们开发了一种针对多倍体小麦定制的管道，以便快速处理和分析该数据，并描述WhatExp，一种数据库，允许在各种时间和空间转录型材上进行简单的小麦同源性序列的简单比较。我们的数据库管理是灵活的，允许在小麦基因组参考的覆盖范围内并入并加入第三方研究组释放的互补RNA-SEQ数据集。Wheatexp提供简单，可免费访问全面的表达数据，使小实验室和个人研究人员赋予挖掘复杂和有价值的表达数据集。

WheatExp是一个免费的数据库和可视化工具，对所有用户开放，无需登录要求，可以通过以下URL访问:http://wheat.pw.usda.gov/wheatexp/．这个网络工具在所有现代的网络浏览环境中都可以使用，包括谷歌Chrome, Mozilla Firefox和Safari。

用于为Wheatexp生成Proateded表达式数据的所有原始序列数据可从公共序列数据库访问，如表中所述1．已处理的计数和参考文件可用于通过Wheatexp网站下载。

AJAX:

异步javascript和XML

来:

二进制搜索树索引

ena：

欧洲核苷酸存档

FPKM:

每百万百万千兆齐键的碎片读物映射

地理：

基因表达综合

IWGSC:

国际小麦基因组测序联盟

MAPQ:

映射质量

PDO：

PHP数据对象

RPKM:

读取每千碱基的转录每百万读取映射

山姆:

序列对齐/地图

扫描电镜:

标准错误的意思

SRA：

序列读取存档

耕种：

针对基因组的诱导局部病变

该项目由美国农业部国家粮食和农业研究所和2011-68002-30029（Triticeae-Cap）支持的国家研究倡议竞争资助，以及霍华德休斯医学院和戈登和贝蒂摩尔基金会授予GBMF3031。我们感谢安迪菲利普斯和罗伯特国王在这个项目过程中有用的建议和建议。

作者指出

从属关系

1. 加州大学植物科学系，戴维斯，加利福尼亚州，95616，美国

   Stephen Pearce，Hans Vazquez-Gross＆Jorge Dubcovsky

2. 美国农业部农业研究服务，西部区域研究中心，阿尔巴尼，加州，94710，美国

   王毅，顾永强

3. 霍华德休斯医学研究所，美国医学博士20815

   Jorge Dubcovsky.

相应的作者

对应到Jorge Dubcovsky.．

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

SP、HVG和JD构思了这项研究。SP进行序列处理和映射，生成表达式数据。SH、DH、YW、YG和HVG在Graingenes上实现了在线数据库和web可视化工具。SP和JD生成了手稿的初稿。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

Stephen Pearce和Hans Vazquez-毛的庄重贡献了这项工作。

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