的减少的表达GydF4y2BaAtNUP62GydF4y2Ba核孔蛋白基因影响生长素反应GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

植物核孔复合体在过去的几年里引起了科学界的广泛关注，特别是因为它参与了激素和病原体/共生信号的传递。在GydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳GydF4y2Ba在美国，已鉴定出的核孔蛋白有30多种，但只有少数得到了鉴定。其中，AtNUP160、AtNUP96、AtNUP58和AtTPR已被报道调控生长素信号，因为相应的突变体是抑制生长素抗性的突变体GydF4y2Baaxr1GydF4y2Ba(auxin-resistant)突变。AtNUP62在胚胎和植物发育中起重要作用。该蛋白是核孔复合体中央通道的三种核孔蛋白之一(与AtNUP54和AtNUP58一起)。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

AtNUP62GydF4y2Ba在许多器官中检测到启动子活性，特别是在胚胎囊，年轻发芽幼苗和甲鱼叶的级别的成人阶段。这GydF4y2Baatnup62-1GydF4y2Ba在内含子5中插入T-DNA的突变体被鉴定为敲除突变体。它表现出的发育表型表明生长素运输或响应的缺陷。GydF4y2BaATNUP62GydF4y2Ba突变植株在子叶和根水平对生长素异常敏感。的表型GydF4y2BaAtNUP62-GFPGydF4y2Ba过表达线进一步支持AtNUP62与生长素信号通路之间存在联系。此外,GydF4y2Baatnup62GydF4y2Ba突变导致了GydF4y2BaDR5GydF4y2Ba生长素响应性启动子，和抑制的抗性植物生长素根系生长和表型的锯齿GydF4y2Baaxr1GydF4y2Ba突变体。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

AtNUP62似乎是生长素信号转导的主要负调控因子。生长素过敏GydF4y2Baatnup6GydF4y2Ba2突变体，提醒的是的GydF4y2Baatnup58GydF4y2Ba(在其他核孔蛋白突变体中未观察到)，与报道的AtNUP62和AtNUP58蛋白相互作用一致，提示功能密切相关。AtNUP62对生长素信号的影响可能与核孔复合物支架蛋白(AtNUP160、AtNUP96和AtTPR)有关。GydF4y2Ba

核孔复合体(NPC)是一个巨大的多蛋白复合体，控制着真核生物细胞核和细胞质之间大分子(rna和蛋白质)的交换。它形成了一个甜甜圈形状，八重对称结构组成的核孔组装在不同种类的复合物，形成一个辐条/环结构排列在中央通道[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba-GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba］．而大分子在分子量低于约30 kDa时容易通过NPC扩散[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba]，当分子量大于40-50 kDa时，它们需要与核孔蛋白相关受体(importins和exportins)相互作用，从一侧被携带到另一侧[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba］．全国人大是由相互联系、功能鲜明的子综合体组成的。一些核孔蛋白形成NPC结构的支架，而FG核孔蛋白，它显示了包含多个苯丙氨酸-甘氨酸重复序列的大结构域，通过与受体-货物复合物结合，参与了大分子在隧道中的运输[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

植物NPC最近引起了科学界的兴趣，因为发现其对几种信号通路的贡献，到目前为止，已经确定了30个核偶GydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳GydF4y2Ba[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba］．植物核孔蛋白参与细胞应答不同激素信号以及以生物或非生物环境刺激，诸如生长素，共生和病原体侵袭[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba］．生长素抗性抑制因子(GydF4y2Basar1GydF4y2Ba和GydF4y2Basar3GydF4y2Ba)拟南芥突变体GydF4y2Baaxr1GydF4y2Ba（生长素抗性1），发生在核孔蛋白的基因将被无效（拟南芥GydF4y2BaNUP160GydF4y2Ba和GydF4y2BaNUP96 / MOS3GydF4y2Ba， 分别） [GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba］．GydF4y2BaSar1 sar3GydF4y2Ba双突变体缺乏mRNA出口。此外，关于植物素信令，GydF4y2Basar3GydF4y2Ba和双GydF4y2Basar1 sar3GydF4y2Ba突变体显示AXR3 / IAA17的改变定位，这是来自AUX / IAA家族的植物素反应压缩机。在这些突变体中，AXR3 / IAA17未按预期局限于核，但在整个细胞中发现，表明Aux / IAA阻遏物未正确进口或保留在核内部[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba］．核篮子内细丝的核孔蛋白，命名为AtTPR或NUA，也参与生长素信号[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba),GydF4y2BanuaGydF4y2Ba突变体缺乏mRNA输出样GydF4y2Basar1GydF4y2Ba和GydF4y2Basar3GydF4y2Ba[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba］．基于双杂交和遗传相互作用，功能性关系也有人建议AtNUP58和激素（生长素/赤霉素）和光信号之间。GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

这项工作是集中在与FG核孔蛋白AtNUP62GydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳GydF4y2Ba，这被认为是酵母Nsp1p和脊椎动物Nup62核孔蛋白[的直向同源物GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba］．它与AtNUP54和AtNUP58一起位于核孔的中央通道，这也是FG核孔蛋白[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba］．AtNUP62与其他的不同源GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2BaFG核孔蛋白，是唯一具有酵母和脊椎动物Nup62 Nsp1-C结构域特征的蛋白[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba］．拟南芥GydF4y2BaAtNUP62GydF4y2Ba共抑制子和突变体被报道显示矮化、早开花表型，这表明在植物发育中起重要作用[GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba］．过度的GydF4y2BaAtNUP62GydF4y2Ba导致烟叶组织严重腐烂[GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba］．对胚胎缺陷突变体的系统研究也发现了两种GydF4y2Baatnup62GydF4y2BaT-DNA插入突变体[GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba］．在本研究中，我们从生长素反应的角度探讨AtNUP62的作用。GydF4y2Ba

变化GydF4y2BaAtNUP62GydF4y2Ba启动子表达GydF4y2Ba

AtNUP62GydF4y2Ba是不存在的GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba微阵列芯片（GydF4y2Bahttps://genevestigator.com/GydF4y2Ba拟南芥EFP浏览器：GydF4y2Bahttp://bar.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgiGydF4y2Ba)，因此我们无法获得传统的微阵列数据。然而，有一些耕耘数组数据(GydF4y2Bahttps://genevestigator.com/GydF4y2Ba），这表明该基因在花，幼苗和幼叶中表达，并且在成年叶程度较轻。为了得到更精确的基因的组织特异性表达，转基因植物表达GydF4y2BaAtNUP62子:: GUSGydF4y2Ba融合了。该基因包含8个小内含子，均位于ORF的后三分之一，与ATG的距离最小为1.47 kb。这个距离，加上这些内含子的负IMEter评分(GydF4y2Bahttp://korflab.ucdavis.edu/cgi-bin/web-imeter.plGydF4y2Ba)，使它们不可能具有转录激活功能[GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba］．活动的活动GydF4y2Ba格斯GydF4y2Ba受控制的基因GydF4y2BaAtNUP62GydF4y2Ba启动子区允许检测特定表达模式（图GydF4y2Ba1GydF4y2Ba)．事实上，在成年植株中，除了茎生叶基部的托叶，花芽下面的GUS染色通常较低(图2)。GydF4y2Ba1 a和bGydF4y2Ba)．在其他组织中，它是弥漫性的，最好局限于发育器官，如幼叶(图。GydF4y2Ba1C.GydF4y2Ba(图),鲜花。GydF4y2Ba1DGydF4y2Ba），以及根尖（图GydF4y2Ba1EGydF4y2Ba)．在幼苗中，子叶顶端的叶脉区域可以检测到低水平的表达(图。GydF4y2Ba1FGydF4y2Ba)．在早期阶段，表达可以在胚囊（图中找到。GydF4y2Ba1 g和hGydF4y2Ba)．在种子萌发期(播种后2天，在植株离开种子包膜之前)，下胚轴和子叶交界处(图2)，GUS酶活性最高。GydF4y2Ba1IGydF4y2Ba)．在亚细胞水平，如预期，AtNUP62-GFP融合蛋白分布在核外周[GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba，并有清晰的标点符号(见图)。GydF4y2Ba1JGydF4y2Ba)．相同的GydF4y2BaAtNUP62-GFPGydF4y2Ba允许检测胞质醇中的荧光荧光（图。GydF4y2Ba1K.GydF4y2Ba），这可能是由于过度表达。GydF4y2Ba

的分子表征GydF4y2Baatnup62-1GydF4y2Ba突变体GydF4y2Ba

这GydF4y2BaAtNUP62GydF4y2Ba基因显示了一个具有两个完全不同区域的特定组织。第一个区域是无内含子的，代表了ORF的前三分之二，并编码了蛋白质的FG重复结构域(图)。GydF4y2Ba2AGydF4y2Ba)．相反，第二个区域含有多个小内含子。编码序列显示许多酸性和碱性氨基酸形成了与酵母Nsp1p核孔蛋白同源的Nsp1-C结构域。GydF4y2Ba

我们试图分离两个不同等位基因SALK_071950和SALK_037337的纯合子株系，这两个等位基因在5GydF4y2Ba^TH.GydF4y2Ba基因内区。我们只能从SALK_037337 (GydF4y2Baatnup62-1GydF4y2Ba)，与先前观察到的SALK_071950 (GydF4y2Baatnup62-3GydF4y2Ba)突变GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba］．第3突变，SAIL_127_F01或GydF4y2Baatnup62-2GydF4y2Ba，显示了53个氨基酸的缺失，与GydF4y2Baatnup62-1GydF4y2Ba[GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba]，本研究未使用。rt - pcr(无花果。GydF4y2Ba2AGydF4y2Ba)和实时荧光定量PCR结果(图。GydF4y2Ba2BGydF4y2Ba)表明GydF4y2Baatnup62-1GydF4y2Ba突变体不是真正的敲除植物，而是一种突变体，其成绩单水平降低。测序PCR产物（用图1中的引物“B”获得。GydF4y2Ba2AGydF4y2Ba）在外显子5外显子6结区域显示，在野生型和突变体之间的序列没有差异（数据未显示）。因此，在突变植物，5GydF4y2Ba^TH.GydF4y2Ba包含T-DNA的内含子可以完全拼接为5GydF4y2Ba^TH.GydF4y2Ba野生型基因内含子(在TAIR网站显示的位置，GydF4y2Bawww.arabidopsis.orgGydF4y2Ba），尽管效率降低。实时定量PCR结果（图GydF4y2Ba2BGydF4y2Ba)可以得出结论GydF4y2Baatnup62GydF4y2Ba突变体显示的剪接转录物的强烈降低。GydF4y2Ba

发育缺陷GydF4y2Baatnup62GydF4y2Ba生殖器官和萌发幼苗T-DNA插入突变体GydF4y2Ba

的抑制突变体以前的分析GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba]和两个T-DNA插入突变体[GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba]揭示了相同的表型的缺陷。所有的植物受损GydF4y2BaAtNUP62GydF4y2Ba功能小，叶片减少，抽薹早于野生型。GydF4y2Ba

我们检查GydF4y2Baatnup62-1GydF4y2Ba植物在不同的生长阶段。体外生长的突变体幼苗（MS / 2培养基）显示小子叶（图GydF4y2Ba2CGydF4y2Ba，低级图像）和频繁异常如子叶畸形，稠合的子叶和polycotyly（3或甚至（很少）4个子叶图。GydF4y2Ba2CGydF4y2Ba和表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba)．这种子叶数量的变化在野生col0植株中是罕见的(约为1‰)。突变植株的子叶也变成上胚轴(图。GydF4y2Ba2CGydF4y2Ba，第二和第三底部图片）。在堆肥温室中，在莲座和后续阶段，突变植物具有较小的叶片比野生型植物和如先前所描述开花更早发生，[GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba］．此外，还检测到其他异常。花通常是异常的，角果比野生型植物小得多。GydF4y2Ba2CGydF4y2Ba)，干燥时间较长。我们每株收获603±15 mg野生型种子，而每株收获270±38 mg突变型种子。这GydF4y2BaAtNUP62GydF4y2BacDNA在GydF4y2BaAtNUP62GydF4y2Ba基因启动子补充了萌发和成体植株的表型(图。GydF4y2Ba2b和c.GydF4y2Ba)以及子叶表型。GydF4y2Ba

有趣的是，GydF4y2Ba35 s:: AtNUP62-GFPGydF4y2Ba转化后的植株表现出较高的生长水平GydF4y2BaAtNUP62GydF4y2Ba成绩单（图GydF4y2Ba2BGydF4y2Ba)，这是一个显著的表型，在成虫阶段生长减少(图。GydF4y2Ba2CGydF4y2Ba)和子叶中间表型(没有或弱上生，但有少数三子叶植物)(表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

这GydF4y2Baatnup62GydF4y2Ba突变和GydF4y2Ba35 s:: AtNUP62-GFPGydF4y2Ba转化植物对生长素过敏GydF4y2Ba

通过2,4-二硝基氧基乙酸（2,4-D）的生长，稳定的制氮类似物的生长检查野生型和突变植物的植物素敏感性。在100和200nm 2,4-d中，野生型和辅助植物的空中部位受到治疗的适度影响，主要抑制根生长（图。GydF4y2Ba3AGydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

比较了不同激素浓度下垂直琼脂板上的根生长情况。而Col的根，GydF4y2Baatnup62GydF4y2Ba、补充和GydF4y2Ba35 s:: AtNUP62-GFPGydF4y2Ba转基因植物在2,4-D存在下都受到影响，突变体中的效果更强，并且在GydF4y2Ba35 s:: AtNUP62-GFPGydF4y2Ba基因型在50 nM 2,4- d培养基上的残余根生长量仅为对照培养基的21和16 %，而其他两种基因型的残余根生长量约为对照培养基的40 %。GydF4y2Ba3B.GydF4y2Ba)．还所观察到的表型GydF4y2Baatnup62GydF4y2Ba子叶的突变植株。在没有生长素类似物处理的情况下，这些器官已经减少和外延，在100nm 2,4- d上变得微小和严重扭曲(图。GydF4y2Ba3AGydF4y2Ba和额外的文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S1)。尽管他们的根表型相似的突变体中，GydF4y2Ba35 s:: AtNUP62-GFPGydF4y2Ba植株不显示小上胚轴子叶的表型(图。GydF4y2Ba3AGydF4y2Ba)．这一悖论可以通过AtNUP62-GFP融合蛋白的分布来解释。GydF4y2Ba3CGydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

这GydF4y2BaDR5GydF4y2Ba合成启动子是常用来检测生长素活性GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba］．在野生型的遗传背景，GydF4y2Ba格斯GydF4y2Ba表达在控制之下GydF4y2BaDR5GydF4y2Ba可以在根尖、水囊和叶缘发现([GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba),和无花果。GydF4y2Ba3dGydF4y2Ba)．在子叶中，强烈的蓝色染色总是局限于叶缘(图。GydF4y2Ba3dGydF4y2Ba(左)。纯合子GydF4y2Baatnup62GydF4y2Ba突变体苗期GydF4y2BaDR5:格斯GydF4y2Ba构建体，相比于同基因GydF4y2BaDR5:格斯GydF4y2Ba在幼苗中，子叶中显示出更高的GUS活性，其中染色向这些器官的中心延伸(图。GydF4y2Ba3dGydF4y2Ba(左)。这表明生长素活性在GydF4y2Baatnup62GydF4y2Ba植物。在年轻发芽的幼苗，GydF4y2BaDR5:格斯GydF4y2Ba活性仅限于子叶，根尖端和胚轴子叶旁边的内边缘，在与以前的报告〔协议GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba］．这GydF4y2Baatnup62GydF4y2Ba突变导致染色的染色胶片延伸到下杆基的外部上部，其中GydF4y2BaAtNUP62GydF4y2Ba表达(无花果。GydF4y2Ba3dGydF4y2Ba,对吧)。GydF4y2Ba

AtNUP62是由赋予生长素电阻的抑制GydF4y2Baaxr1GydF4y2Ba突变GydF4y2Ba

这GydF4y2BaAXR1GydF4y2Ba(生长素抗性1)基因编码rubc激活酶的一个亚基，这是AUX/IAA转录抑制因子依赖生长素降解所必需的。GydF4y2BaAxr1GydF4y2Ba突变体对生长素具有抗性，在标准生长条件下也表现出特定的表型。这包括高度降低、根向地性缺陷、花序异常、育性低[GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba和锯齿叶[GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba］．与此相反GydF4y2Baaxr1GydF4y2Ba,GydF4y2Baatnup62GydF4y2Ba突变使生长素变得敏感。因此，我们创建了GydF4y2Baatnup62 axr1GydF4y2Ba双突变体。该突变体失去了叶片锯齿的表型（图。GydF4y2Ba4GydF4y2Ba)．叶子也经常压花和有些变形，这表明不存在于亲本系图额外发育问题（。GydF4y2Ba4GydF4y2Ba)．最重要的是，的生长素阻力GydF4y2Baaxr1GydF4y2Ba突变体被GydF4y2Baatnup62GydF4y2Ba突变。的确,GydF4y2Baaxr1GydF4y2Ba植株在200 nM 2,4- d上没有明显的生长缺陷，而双突变体植株对生长素类似物处理很敏感(图2)。GydF4y2Ba4 b, cGydF4y2Ba和额外的文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S1)。根敏感性在50 nM 2,4- d上部分恢复，在100 nM上完全恢复。GydF4y2Ba4摄氏度GydF4y2Ba)．Q-PCR分析也显示双突变体的数量减少较少GydF4y2BaAtNUP62GydF4y2Ba与GydF4y2Baatnup62GydF4y2Ba单突变体(无花果。GydF4y2Ba4 dGydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

AXR1通过激活SCF E3泛素连接酶复合物介导生长素反应，该复合物靶向生长素反应的AUX/IAA抑制因子进行泛素化和降解[GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba］．在生长素信号级联中，这个SCF复合物由SKP1/ASK1、cullin CUL1和TIR1 F-box蛋白组成，它专门识别被蛋白酶体泛素化和降解的AUX/IAA蛋白。通过对NPC中央通道的另外两个FG核孔蛋白之一AtNUP58的双杂交筛选，鉴定出AtNUP62 (c端Nsp1结构域)、SKP1和它的一个同源物(SKP1B) [GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba］．SKP1发现的8倍在筛选，总是与GAL4激活结构域框架，从在其序列中（不同的位置从7GydF4y2Ba^TH.GydF4y2Ba89年GydF4y2Ba^TH.GydF4y2Ba氨基酸)。因此，我们测试了AtNUP62和SKP1之间相互作用的假设(附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba(图S2b)，在两种诱饵/猎物组合中。AtNUP62表现出强烈的内在转录活性，导致在缺乏组氨酸的培养基上生长(附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba:图S2，右)。SKP1融合到Gal4激活域(之前用另一个诱饵进行双杂交筛选获得的全长克隆)的存在并没有增加信号。在交互试验中，SKP1表现出弱的转录活性，而AtNUP62并没有增强SKP1的转录活性(Additional file)GydF4y2Ba2GydF4y2Ba:图S2)。GydF4y2Ba

AtNUP62表达和植物表型GydF4y2Ba

AtNUP62GydF4y2Ba是必需基因，由两个出四T-DNA插入[的致死率作为显示出GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba］．我们观察到的发育表型GydF4y2Baatnup62-1GydF4y2Ba突变体(子叶形状和数量异常，棱角小)是符合定位的GydF4y2BaAtNUP62GydF4y2Ba启动子在胚囊中的表达和由Seedgenes项目证明的“胚胎缺陷”表型[GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba］．另一个突变体,GydF4y2Baatnup62-3GydF4y2Ba， T-DNA插入到与GydF4y2Baatnup62-1GydF4y2Ba，显示更严重的“胚胎缺陷”表型[GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba]，导致致死率([GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba),本研究)。剪接第五个内含子的残留能力的存在GydF4y2Baatnup62-1GydF4y2Ba也许可以解释这两个突变体的表型差异。GydF4y2Ba

似乎也很难获得深度过表达AtNUP62蛋白的植物。赵和迈耶[GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba的共抑制子，而不是过表达子GydF4y2Ba35 s:: FLAG-AtNUP62GydF4y2Ba构造。过度的GydF4y2BaAtNUP62GydF4y2Ba通过接种烟叶导致非常严重的坏死[GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba］．尽管水平很高GydF4y2BaAtNUP62-GFPGydF4y2Ba成绩单（图GydF4y2Ba2BGydF4y2Ba)，表型的相似性GydF4y2Baatnup62GydF4y2Ba和GydF4y2Ba35 s:: AtNUP62-GFPGydF4y2Ba这些线表明后者是功能损失线而不是强功能增益线(图)。GydF4y2Ba2CGydF4y2Ba和GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba)，表明存在主要的负面影响。GydF4y2Ba

的本地化GydF4y2BaAtNUP62GydF4y2Ba在胚囊囊和幼苗中的表达（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）是与胚胎缺陷表型，子叶和小植株的发育缺陷是一致的。有趣的是，GydF4y2BaAtNUP62GydF4y2Ba启动子活性集中在生长素合成、积累或运输的组织中。子叶尖端和胚是表达的特异位点GydF4y2Ba丝兰GydF4y2Ba在生长素合成途径中编码酶的基因[GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba］．在根尖[GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba]及正在发芽的幼苗[GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba),GydF4y2BaAtNUP62 :: GUSGydF4y2Ba活动不匹配GydF4y2BaDR5-GUSGydF4y2Ba但包括生长素活跃的运输区(子叶脉、根尖和幼苗的顶端钩)。莲座叶的托叶已被报道，从活性GydF4y2BaDR5GydF4y2Ba生长素响应启动子，积累游离生长素[GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba]，和已经假定调节相邻的器官发育[GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba］．生长素在花器官产生的，尤其是雄蕊[GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba，但不排除茎生叶的托叶在花发育中的作用。GydF4y2Ba

AtNUP62和生长素信号GydF4y2Ba

此前已有报道，一些支架核孔蛋白或npc相关蛋白，AtNUP160/SAR1, AtNup96/SAR3 [GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba], AtNUP58 [GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba]， AtTPR [GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba，参与生长素的反应。这些基因中的所有突变都有一个共同之处，即局部抑制GydF4y2Baaxr1GydF4y2Ba生长素耐药表型。目前的结果提供了一些证据支持这一假设AtNUP62还在生长素信号的作用。发育缺陷，诸如减小的尺寸，小叶片[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba，异常的花[GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba]和开花早[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba提示AtNUP62可能干扰生长素的分布或信号转导。胚和子叶的表型GydF4y2Baatnup62GydF4y2Ba变种人让人想起GydF4y2Ba凋亡GydF4y2Ba和GydF4y2Bapin1GydF4y2Ba生长素极性运输受损突变体[GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba),GydF4y2Bayucca.GydF4y2Ba生长素合成受损突变体[GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba］．子叶上生是生长素过量的症状之一[GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba，也显示为GydF4y2Baatnup58GydF4y2Ba突变体(GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba]，而额外的子叶的外观是功能障碍生长素分布的符号[GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba］．实际上，在胚胎发育的三角阶段（球状和心脏阶段）形成的子叶，从三角形的两侧穴位的植物穴积聚的斑点出现[GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba］．这GydF4y2Baatnup62GydF4y2Ba突变抑制表型特征GydF4y2Baaxr1GydF4y2Ba突变体，主要是生长素抗性，但也有生长素依赖的典型锯齿叶表型[GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba］．最后，两者GydF4y2Baatnup62GydF4y2Ba突变的植物和GydF4y2Ba35 s:: AtNUP62-GFPGydF4y2Ba植物对生长素非常敏感。这种表现型似乎相当特异。的确,GydF4y2Baatnup160 / sar1GydF4y2Ba和GydF4y2Baatnup96 / SAR3GydF4y2Ba不要表现出生长素过敏[GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba］．仅在核孔蛋白基因突变体中GydF4y2Baatnup58GydF4y2Ba据报道，比野生型更敏感[GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba］．有趣的是，AtNUP58是唯一已知的与AtNUP62结合的核孔蛋白，并且相互作用[GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba］．在生长素膜分泌受损的突变植物中也观察到对生长素的超敏反应[GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba]或AUX / IAA降解的控制[GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

一种额外的表型GydF4y2Baatnup160GydF4y2Ba/GydF4y2Basar1GydF4y2Ba和GydF4y2Baatnup96GydF4y2Ba/GydF4y2Basar3GydF4y2Ba突变体是核内mrna的积累[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba］．然而,GydF4y2Baatnup62-1GydF4y2Ba突变体不积累核信使rna [GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba］．这同样适用于真正的GydF4y2Baatnup62-2GydF4y2Ba缺乏编码NPC中央通道其他核磁素的基因的突变体[GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba］．这表明在细胞核中的mRNA和生长素相关表型的积累是独立的现象。GydF4y2Ba

AtNUP62与生长素信号转导之间关系的分子基础有待进一步研究。基本基因在统计上容易在基因网络中高度相连[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba］．GydF4y2BaAtNUP62GydF4y2Ba与编码核孔蛋白的基因，以及那些参与胚胎发育和蛋白质泛素化的基因(Aranet server， [GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba])。的减少GydF4y2BaAtNUP62GydF4y2Ba因此，转录本可能影响几个网络。为了研究核孔蛋白突变体的分子机制，Parry [GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba发表了一篇关于GydF4y2Baatnup160-4GydF4y2Ba和GydF4y2Baatnup62-2GydF4y2Ba．令人惊讶的是，与野生型相比，只有少数基因表现出两倍以上的基因表达变化。其中，在两个突变体中上调的18个基因中，5个与核运输有关，2个(GydF4y2BaSAUR9GydF4y2Ba和GydF4y2BaACS4GydF4y2Baauxin-responsive)。其他靶点的鉴定可能需要组织特异性rna或在早期阶段(胚胎发育和萌发)取样。GydF4y2Ba

我们认为AtNUP62可能作为一些生长素反应的负调控因子，如核孔蛋白AtNUP160/SAR1和AtNUP96/SAR3 [GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba］．这两种核孔蛋白在生长素信号转导中的负作用归因于这两种蛋白参与了细胞核内转录调控因子AUX/IAA17的保留。抑制GydF4y2Baaxr1GydF4y2Ba表型的GydF4y2Baatnup62GydF4y2Ba突变表明AtNUP62还充当AXR1的下游。可能背后这样的控制需求的机制，以得到更好的解决，但双杂交相互作用实验与AtNUP58 [GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba]和不存在的证据AtNUP62与SKP1的直接相互作用（附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba图S2)提示AtNUP62可能部分调节SKP1的活性或核保留GydF4y2Ba通过GydF4y2Ba它与AtNUP58的相互作用。这是由植物表型的相似性(子叶向外生长和根对生长素过敏)所证实的。不排除AtNUP62也可能干扰skp1样蛋白(家族中21个成员)GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba）[GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba]、TIR/AFB受体(拟南芥中6个成员)、AUX/IAA抑制因子(29个成员)和ARF转录因子(23个成员)组成一个复杂的组合网络，显示特定的表达模式，参与不同类型的响应[GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

我们的数据为击倒致死提供了第一种解释GydF4y2Baatnup62GydF4y2Ba突变体，通过突出其在生长素依赖的发育，特别是在早期阶段的作用。在生长素信号通路中，AtNUP62作用于AXR1的下游。这也表明,这种植物FG nucleoporin与AtNUP58密切联系和与核孔支架组件(AtNUP160 / SAR1 AtNUP96 / S,和AtTPR),能够参与其他SKP1-dependent监管的控制途径,在需要的时间和地方法规。GydF4y2Ba

拟南芥GydF4y2Ba突变体行GydF4y2Ba

这GydF4y2Baatnup62-1GydF4y2Ba和GydF4y2Baatnup62-3GydF4y2Ba突变株col0, SALK_037337和SALK_071950从诺丁汉拟南芥砧木中心获得[GydF4y2Ba44.GydF4y2Ba］．通过PCR选择用于T-DNA插入纯合子（在T-DNA引物左边界和在GydF4y2BaAtNUP62GydF4y2Ba基因)和破坏GydF4y2BaAtNUP62GydF4y2Ba基因（上插入位点两侧的引物）。这GydF4y2Baaxr1GydF4y2Ba突变体是GydF4y2Baaxr1-3GydF4y2Ba[GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba］．为互补的GydF4y2Baatnup62GydF4y2Ba突变体，GydF4y2BaAtNUP62GydF4y2Ba通过PCR使用寡核苷酸5'-TTGTAGGTGTCACCTC-3'和5'-ACCCGCTGCATGCGGGGGTTTCATTTGGTCAATCC-3'通过PCR扩增cDNA，用寡核苷酸和5'-ACCCGCTGGTCAATCC-3'GydF4y2Ba以区域GydF4y2Ba我和GydF4y2BaBSTGydF4y2BaEII，并引入了以前掺入的1.8kb上游区域从向量的pCAMBIAGydF4y2BaAtNUP62GydF4y2Ba基因与GydF4y2Ba以区域GydF4y2Ba我在3'结束时网站。GydF4y2Ba

植物生长条件GydF4y2Ba

植物在温室中生长(8 h/16 h 21°C /23°C暗/光，必要时补充光，提供150 μE.m钠蒸气灯GydF4y2Ba^-2GydF4y2Ba．s^-1GydF4y2Ba(16 h光周期，140 μM光子GydF4y2Ba^-2GydF4y2Ba．s^-1GydF4y2Ba在半强度的Murashige和Skoog (MS/2)培养基上，必要时添加卡那霉素(50 mg。lGydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba)、湿霉素(30mg。lGydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba）或2,4-d。GydF4y2Ba

本地化GydF4y2BaAtNUP62GydF4y2Ba启动子活性GydF4y2Ba在植物GydF4y2Ba

甲1.8kb的区域从的所述ATG上游GydF4y2BaAtNUP62GydF4y2Ba引物5 ' -GGTTACATTGTCGTGGTCGAGGTACG-3 '和5 ' -CCCCGCCATGGCGGGTTATTGATTG-3 '通过PCR扩增At2g45000基因，并克隆到pBI-320X (GydF4y2Ba萨尔GydF4y2Ba我/GydF4y2Ba以区域GydF4y2Ba一世）。将扩增的启动子区域融合至β葡萄糖醛酸酶基因（GydF4y2BaEcoRGydF4y2Ba我/GydF4y2Ba囊GydF4y2BaI片段)并插入到二进制载体pMOG406中。GydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳GydF4y2Ba植物(Ws生态型)利用花浸法转化[GydF4y2Ba45.GydF4y2Ba］．在卡那霉素上筛选转化子，并在下一代回收纯合子。-葡醛酸酶活性根据[GydF4y2Ba46.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

通过GFP融合原生质体和植物蛋白AtNUP62本地化GydF4y2Ba

AtNUP62GydF4y2Ba(At2g45000) cDNA用寡核苷酸5 ' - caccatgtcggggtttccattggtc -3 '和5 ' -AGACATCCAGTGCTTTGGAGCCA-3 '(无终止密码子的orf5 '端和3 '端)扩增，克隆到pENTR/D-TOPO (Invitrogen)中。将该cDNA序列通过LR重组(Gateway LR克隆酶mix, Invitrogen)引入到pGWB5 (Tsuyoshi Nakagawa, Shimane University, Japan)中，使GFP融合到AtNUP62蛋白的c端(pGWB5-)GydF4y2BaAtNUP62GydF4y2Ba质粒用于植物转化）。Col-0中的植物根据转化[GydF4y2Ba45.GydF4y2Ba］．用于原生质体中的瞬时表达，GydF4y2Ba欣GydF4y2BaDIII /GydF4y2Ba斯图GydF4y2Ba从pGWB5-AtNUP62中提取I盒(包括35S启动子和gfp编码序列)，插入pGreen 0179，酶切GydF4y2Ba欣GydF4y2BaDIII和GydF4y2Ba生态GydF4y2Ba房车。在Zeiss共聚焦显微镜(LSM510 AX70 Zeiss, Göttingen，德国)下检测荧光。用分束器HFT 488获得激励，用BP 505-530 nm滤波器选择发射辐射。GydF4y2Ba

rt - pcr实验GydF4y2Ba

花序(包括花蕾和幼小的角果)在液氮中聚集和研磨。从同一粉末样品中提取RNA和基因组DNA。RNeasy mini kit (Qiagen)提取RNA。2.5 μg RNA采用上标法(Invitrogen)进行逆转录。用两对引物A和B进行PCR。(A): 5 ' -ACTCCGGCTAGCTCCGCTGCTAC-3 '和5 ' -TTAGATCTTCAAGACATCCAGTGCTTTGGAGCC-3 ' (STOP引物)。(B): 5 ' -CTAGCTTGGAACGACAGCTGGA-3 '和5 ' -TCTCTTTCTACTAGCTCAGACTG-3 '。GydF4y2BaEF1 -αGydF4y2Ba引物s5 ' -CCACCACTGGTGGTTTTGAGGCTGGTATC-3 '和5 ' -CATTGAACCCAACGTTGTCACCTGGAAG-3 '作为对照基因。为了确保在RNA提取和后续步骤中突变样本没有发生野生型样本污染，我们进行了完全独立的RNA/DNA提取和RT-/基因组DNA pcr(引物B)重复，结果完全相同。GydF4y2Ba

基因表达分析GydF4y2Ba

使用RNeasy Plant Minikit (Qiagen)在半强度Murashige和Skoog (MS/2)培养基上生长8天，提取植株总rna，并在DNase I处理(Invitrogen)后用纳米滴进行定量。根据生产说明书，用SuperScript III逆转录酶(Invitrogen)合成第一链cdna。利用PRIMER3软件设计基因特异性扩增的寡核苷酸(GydF4y2Bahttp://frodo.wi.mit.edu/primer3/GydF4y2Ba)．引物对AtNUP62-F (5 ' - gcagagtgggataagcggat -3 ')和对反向引物对B (5 ' - TCTCTTTCTACTAGCTCAGACTG-3 ')分别连接内含子IV和VGydF4y2BaAtNUP62GydF4y2Ba基因结构（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba），5个GydF4y2Ba^TH.GydF4y2Ba内含子含有T-DNA插入（图GydF4y2Ba2AGydF4y2Ba)．对于标准化的GydF4y2BaPDF2.GydF4y2Ba内参基因(At1g13320)是根据其在根和叶中的表达稳定性(引物)选择的GydF4y2BaPDF2-FGydF4y2Ba(5‘-TAACGTGGCCAAAATGATGC-3’GydF4y2Ba）GydF4y2Ba和GydF4y2BaPDF2-RGydF4y2Ba（5'-GTTCTCCACAACCGCTTGGT-3'））。PCR反应用两个独立的生物样品上的的LightCycler 480（罗氏应用科学）一式三份进行。基因组DNA和引物二聚体的不存在是通过减去-RT的分析和水对照样品得到证实，并通过熔化曲线的检查。周期3个15.所有扩增图与0.2的RN（归一化的报道分子）的阈值，以获得CT值进行分析之间收集基线数据。使用罗氏公司的LightCycler软件分析数据，并推导相对表达水平，如在德奎利亚尔等人所述，使用比较CT法（DDCT）。[GydF4y2Ba47.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

选择GydF4y2Baatnup62GydF4y2Ba突变的植物含有GydF4y2BaDR5:格斯GydF4y2Ba构造GydF4y2Ba

Atnup62-1GydF4y2Ba将纯合突变植株与纯合植株进行杂交GydF4y2BaDR5:格斯GydF4y2Ba插入(GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba］．SALK T-DNA插入GydF4y2BaAtNUP62GydF4y2Ba基因和GydF4y2BaDR5:格斯GydF4y2Ba分别通过PCR和ß-glucuronidase活性确认整合，并通过检查缺失在下一代选择纯合子GydF4y2BaAtNUP62GydF4y2BaPCR产物和后代(100% GUS阳性植株)中GUS活性的存在。GydF4y2Ba

双杂交实验GydF4y2Ba

部分GydF4y2BaAtNUP62GydF4y2Ba编码NSP1 c端结构域(从S266到多肽序列的末端)和全长的cDNAGydF4y2BaSKP1GydF4y2Ba通过FL4000AB cDNA文库(Clontech)的双杂交筛选获得cDNA。的长篇GydF4y2BaAtNUP62GydF4y2Ba通过PCR获得，并插入到pGBT9 [cDNA克隆GydF4y2Ba48.GydF4y2Ba]和pGAD10(克隆技术)。这GydF4y2BaBglGydF4y2Ba图书馆的片段GydF4y2BaSKP1GydF4y2Ba将cDNA克隆插入以前消化的PGBT9中GydF4y2BaBamGydF4y2BaH1。酵母转化(AH109菌株)按[GydF4y2Ba49.GydF4y2Ba］．酵母转化体在缺乏色氨酸和亮氨酸的液体培养基中生长，细胞用水洗涤，并在缺乏色氨酸，亮氨酸和组氨酸的培养基上滴加三倍的连续稀释（对应于0.066的OD 0.066的稀释液[GydF4y2Ba50.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

可获得的支持数据GydF4y2Ba

所有支持数据都包含在附加文件中。GydF4y2Ba

全国人大:GydF4y2Ba

核孔复合体GydF4y2Ba

2,4 - d:GydF4y2Ba

2, 4-Dinitrophenoxyacetic酸GydF4y2Ba

我们要感谢Rémy Gibrat提供的垂直板上的植物图片，Nadine Paris提供的Fig。GydF4y2Ba3CGydF4y2Ba杰弗里迪比用于图。GydF4y2Ba1K.GydF4y2Ba、Hugues Baudot、Thierry Dessup和José Garcia感谢他们对温室植物的照顾。我们还感谢Salk研究所基因组分析实验室提供的序列索引拟南芥T-DNA插入突变体，以及诺丁汉拟南芥砧木中心(NASC)提供的这些突变体。这项工作得到了gabi基因plante项目的部分资助。”GydF4y2Ba膜转运体功能基因组学GydF4y2Ba”(AF2001065)。GydF4y2Ba

作者指出GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

1. Biochimie et physiology e Moléculaire des Plantes, CNRS/INRA/SupAgro/UM2, 2 place Viala, 34060，蒙彼利埃cedex，法国GydF4y2Ba

   马丁Boeglin，安雅THOE Fuglsang，杜安 - 忠琉，埃尔韦Sentenac，伊莎贝尔盖拉德和伊莎贝尔ChérelGydF4y2Ba

2. 目前地址:哥本哈根大学运输生物学植物与环境科学学部，thorvaldssenvej 40, 1871，丹麦，Frederiksberg CGydF4y2Ba

   Anja Thoe FuglsangGydF4y2Ba

通讯作者GydF4y2Ba

对应到GydF4y2Ba伊莎贝尔ChérelGydF4y2Ba．GydF4y2Ba

相互竞争的利益GydF4y2Ba

没有竞争的利益。GydF4y2Ba

作者的贡献GydF4y2Ba

ATF和MB进行了分子生物学实验，DTL获得了根的共聚焦显微镜图像，IC参与了分子生物学实验，建立了植物品系并进行了分析，并撰写了论文。IG进行Q-PCR实验。ATF, DTL, HS和IG对结果的分析和手稿的批判性阅读做出了贡献。所有作者都已阅读并批准了手稿的最终版本。GydF4y2Ba

马丁布莱格林和安贾·哈福·菲格尔康同样贡献了这项工作。GydF4y2Ba

开放访问GydF4y2Ba本文根据创意公约署署署的条款分发了4.0国际许可证（GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba)，它允许在任何媒体上无限制地使用、分发和复制，前提是你给予原作者和来源适当的荣誉，提供一个到知识共享许可协议的链接，并指出是否作出了更改。创作共用及公共领域专用豁免书(GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba）除非另有说明，否则适用于本文中提供的数据。GydF4y2Ba

再版和权限GydF4y2Ba