表征gydF4y2BaPopulus rab.gydF4y2Ba家族基因的功能gydF4y2Baptrabe1b.gydF4y2Ba在耐盐性gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

Rab蛋白形成了Ras超家族中最大的小型gtp结合蛋白家族，并调节细胞内运输途径。然而，Rab蛋白在木本植物中的功能仍然是一个悬而未决的问题。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

这里，共有67个gydF4y2BaPtRabsgydF4y2Ba被确定在gydF4y2BaPopulus Trichocarpa.gydF4y2Ba并分为八个亚科(RabA-RabH)。根据它们的染色体分布和复制块gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba基因组，共27岁gydF4y2BaPtRabgydF4y2Ba通过全基因组重复事件鉴定出多对同源基因。结合表达式相关性和复制数据，实现了gydF4y2BaPtRabgydF4y2Ba在最近的大规模复制(~ 13 MYA)附近产生了仍保持高度相似表达模式的同源对。当gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba-元素和共表达网络的独特扩展gydF4y2BaPtRabsgydF4y2Ba建议他们在杨树发展和环境反应中的潜在作用。来自每个子类的PTRABS的亚细胞定位表示每个子类显示与揭示内容类似的本地化模式gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba但RabC显示的本地化与其他同类产品不同。此外,我们的特点gydF4y2Baptrabe1b.gydF4y2Ba通过在杨树中过表达其组成型活性突变体ptrab1b (Q74L)，发现ptrab1b (Q74L)增强了杨树的耐盐性。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

这些调查结果为功能分歧提供了新的洞察力gydF4y2BaPtRabsgydF4y2Ba树种抗基因工程育种资源。gydF4y2Ba

植物细胞分为几种生物化学上不同的膜结合细胞器，其具有允许维持各种化学反应的专业环境的特定功能[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．这些膜隔室之间的通信和运输不仅至关重要，不仅是基本的细胞活动，而且也是开发和环境反应。通过复杂和精确的调节途径保持这种运输，包括运输囊泡和靶细胞器之间的膜融合[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．囊泡融合是由两个重要的基团蛋白介导的:可溶性n -乙基马来酰亚胺敏感因子附着受体(SNARE)和Rab GTPases [gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

Rab GTP酶参与囊泡转运的整个过程，包括来自供体细胞器，对接，束缚和用靶膜熔断的萌芽[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．与其他小的gtpase类似，Rabs可以在gtp结合的活性形式和gtp结合的形式之间循环;这种循环机制在所有真核生物中都是保守的[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．在Rab蛋白中有四个保守的基序参与核苷酸结合和水解。突变特定残基可以产生显性的阴性或组成型活性形式，其表现出改变的核苷酸结合或水解特性，其可用于研究RAB功能[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在植物中的拉布家庭分为八个亚科（拉巴-RabH）gydF4y2Ba6GydF4y2Ba］．每种类型的RAB在细胞石膜上具有特征性分布。换句话说，每个细胞器在其细胞骨表面上具有至少一种类型的RAB蛋白[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2BaRaba1 GTP酶参与运输gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba-GOLGI网络（TGN）和等离子体膜（PM）[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．烟草NtRab2 (RabB)调节内质网(ER)和高尔基体之间的囊泡运输[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．RabD参与ER-高尔基交通[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．Rabe具有Golgi设备和PM定位[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．Rabf / Rab5和Rabg / Rab7是Eucararyotes内体/真空贩运的主要调节因子。Rabh位于Golgi设备中[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．Rab蛋白的高变C末端结构域（HVD）由异戊二烯基部分翻译后改性，这对于膜结构是重要的。但是需要完整的机制来阐明本地化[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

植物Rab蛋白是细胞活动的关键分子，参与植物发育和胁迫反应的各种调控过程。例如，rabb蛋白与花粉管的生长有关[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，叶的形态[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，木质部发育[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba),自噬gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]盐度压力[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba和病原体防御[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．真核细胞主要通过PM上的蛋白质来识别环境，包括受体和传感器，引起细胞内信号转导以响应环境信号。到目前为止，在酵母、哺乳动物和哺乳动物中，膜传输及其相关成员已经得到了很好的研究gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba细胞。然而，关于木质植物中的RAB GTP酶功能表征有限的研究。与年度植物不同，多年生木质物种不仅经常进行季节性环境变化，而且还具有特定的发展过程，如强大的二次生长。因此，研究gydF4y2BaRabgydF4y2Ba基因家族对于了解木本植物在这些特定环境反应或发育过程中贩运的调控具有重要意义。杨树作为多年生木本模式植物，是分布广泛的经济树种群，具有生长快、产量高的植物生物量特征[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．基因家族的扩展以及全基因组重复事件gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba基因组还提供基因功能分歧的可能性。gydF4y2Ba

在本研究中，我们综合分析了gydF4y2BaPopulus Rab GTP酶gydF4y2Ba基因家族。总共67gydF4y2BaPtRabgydF4y2Ba基因被鉴定为8个亚家族gydF4y2BaP. Trichocarpa.gydF4y2Ba．共鉴定出27对副同源基因对，均为全基因组复制(WGD)事件产生的同源基因对gydF4y2BaPtRabgydF4y2Ba家庭扩张。当gydF4y2BaPtRabgydF4y2Ba在最新的WGD事件（〜13 mya）周围产生具有高度相似的表达模式的递倒钩对。此外，不同的本地化差异gydF4y2BaPtRabgydF4y2Ba亚科是它们功能分化的基础。基于gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba-作用元素和共表达网络，几个gydF4y2BaRabgydF4y2Ba基因与应激反应有关。其中,gydF4y2Baptrabe1b.gydF4y2Ba被盐胁迫显着诱导。最后，我们在杨树中过表达的组成型活性突变PTRABE1B（Q74L）并发现PTRABE1B（Q74L）增强了杨树的耐盐性。这些调查结果为功能分歧提供了新的洞察力gydF4y2BaPtRabgydF4y2Ba树种抗基因工程育种的基因及资源。gydF4y2Ba

鉴定和系统发育分析gydF4y2BaRabgydF4y2Ba基因家族在gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba

识别gydF4y2Barab gtpase.gydF4y2Ba基因gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba，56名已知gydF4y2Ba拟南芥RabgydF4y2Ba序列(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba在针对的BLAST搜索中用作查询gydF4y2BaP. Trichocarpa.gydF4y2Ba基因组（版本V3.0）。共有67推定的gydF4y2Barab gtpase.gydF4y2Ba基因在gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：表S1）。要检查的亲缘关系gydF4y2BaPtRabgydF4y2Ba基因家族，使用PTRABS和ATRAB的全长蛋白质序列进行多序列对齐，构建系统发育树。如图1所示。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，这gydF4y2BaPtRabgydF4y2Ba科被分为八个分支(gydF4y2Baraba-rabh.gydF4y2Ba为基础）的序列相似性和gydF4y2BaPtRabsgydF4y2Ba是根据其同源的ingydF4y2Ba拟南芥。gydF4y2Ba与此相比gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba四(gydF4y2BaRabAgydF4y2Ba，gydF4y2BaRabCgydF4y2Ba，gydF4y2BaRabDgydF4y2Ba和gydF4y2BaRabFgydF4y2Ba)的八gydF4y2BaRabgydF4y2Ba亚科扩展到gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba．当gydF4y2BaPopulus Rabb.gydF4y2Ba和gydF4y2BaRabGgydF4y2BaSubfamilies的大小相同gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba， 尽管gydF4y2BaPopulus Rabe.gydF4y2Ba和gydF4y2BaRabHgydF4y2Ba亚属小于gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

结构的结构gydF4y2BaRabgydF4y2Ba基因和Rab蛋白的保守基序gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba

进一步调查结构特征gydF4y2BaPopulus rab.gydF4y2Ba分析基因及其外显子-内含子结构和蛋白质基序组成。外显子-内含子的结构差异在进化过程中起着关键作用。一般来说，副同源基因在基因结构上是高度转换的，这种保守性足以揭示它们的进化关系[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．在gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba，gydF4y2Barabs.gydF4y2Ba在同一亚家族中共享类似的基因结构（内含子数和外显子长度），尤其是成员gydF4y2BaRabAgydF4y2Ba，gydF4y2BaRabCgydF4y2Ba和gydF4y2BaRabHgydF4y2Ba亚科。与其他多内含子相比gydF4y2BaRabgydF4y2Ba基因，成员在gydF4y2BaRabAgydF4y2Ba亚家族只有一个内含子（附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S1)。尽管各成员的基因长度和基因结构有所不同gydF4y2BaRabgydF4y2Ba亚家族中，大多数Rabs的蛋白长度均为~ 200 aagydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba和gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

经典的Rab蛋白包括四个保守的基序，涉及核苷酸结合和水解。然后我们分析了PtRabs中的保守基序。与许多其他物种的Rabs一样，几乎所有的PtRabs包括四个保守的基序(基序1-4;额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图印地)。虽然四个基序在不同的Rab亚家族间存在一定的序列偏倚，但在PtRabs中四个基序的基本框架相对保守。根据以往的研究，Rabs保守基序中的几个特定氨基酸参与了核苷酸结合和水解[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．在PtRab家族中，有三个残基(S在基序-1,Q在基序-2,N在基序-3;附加文件中的星号gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba：图S2）可用于通过改变核苷酸结合或水解特性来产生显性的阴性或组成型活性突变体进行功能调查。gydF4y2Ba

由当前可用的注解限制gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba基因组，几种基因的结构并不具备很好的表征。当gydF4y2BaPtRabgydF4y2Ba家庭，四个基因（gydF4y2BaPtRabA1bgydF4y2Ba，gydF4y2BaPtRabD1bgydF4y2Ba，gydF4y2BaPtRabF2agydF4y2Ba和gydF4y2BaPtRabG3 ggydF4y2Ba)不是完整的(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S1)。gydF4y2Baptrabh1a.gydF4y2Bahad a complete open reading frame, while it lost ~ 50 aa including the conserved motif-1 in the N-terminus, and the distance between motif-3 and motif-4 was much closer than the other PtRabs. Furthermore, a pseudogenePtRabA1gψ。gydF4y2Ba鉴定了哪种编码蛋白，仅保留92AA在N-末端，包括MOTIF-1。gydF4y2Ba

染色体分布和重复gydF4y2BaPtRabgydF4y2Ba基因gydF4y2Ba

探讨我国农村农村发展的发展机制gydF4y2BaPtRabgydF4y2Ba家庭，我们分析了重复模式。所有67gydF4y2BaPtRabsgydF4y2Ba在19中的18条中分发不均匀gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba染色体（CHR）。CHR1和CHR2最多包含gydF4y2BaRabgydF4y2Ba基因（每次七个），而CHR17则不包含任何gydF4y2BaRabgydF4y2Ba基因（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.的gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba基因组经历了至少两次全基因组复制(WGD)事件和一系列染色体重组[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．在gydF4y2BaPtRabgydF4y2Ba共鉴定出27对WGD副同源基因，未发现串联复制事件(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.非同义替换率与同义替换率之比(gydF4y2BaKgydF4y2BaA /gydF4y2BaKgydF4y2Ba计算出了测试是否参与了达尔文阳性选择gydF4y2BaPtRabgydF4y2Ba复制后的基因分化[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．所有的gydF4y2BaKgydF4y2Ba一个gydF4y2Ba/ KgydF4y2BaS比值明显小于0.5，说明在复制中起主导作用的是纯化选择gydF4y2BaPtRabgydF4y2Baparalogous双(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.基于发散率λ = 9.1 × 10gydF4y2Ba^{−9gydF4y2Ba}对于gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba［gydF4y2Ba23gydF4y2Ba),gydF4y2BaPtRabgydF4y2Ba估计旁系对已经发生年9.96之间，以2814万年前（MYA;表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.最近大规模的基因组复制事件gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba发生在〜13 mya [gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]，所有的gydF4y2BaPtRabgydF4y2Ba五个亚属的副骨对（gydF4y2BaRabDgydF4y2Ba-gydF4y2BaRabHgydF4y2Ba)是围绕这个阶段生成的，而gydF4y2BaPtRabB1agydF4y2Ba/gydF4y2BaB1cgydF4y2Ba和gydF4y2BaPtRabC2bgydF4y2Ba/gydF4y2BaC2cgydF4y2Ba分别于28.14和27.32 mya生成（表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和图。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

各种各样的gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba启动子区域中的元素gydF4y2BaPtRabsgydF4y2Ba

作为转录因子（TFS）结合位点，gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba位于基因启动子区域中的元素涉及基因表达的控制[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．翻译起始位点(TSS)上游1.5 kb序列gydF4y2BaPtRabgydF4y2Ba基因进行了分析和激素的响应和/或数量与压力有关的gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba-作用元件被鉴定在启动子区域gydF4y2BaPtRabsgydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:图S3)。在67gydF4y2BaPtRabsgydF4y2Ba， 46(68.7%)和37(55.2%)分别含有sa -响应元件(TCA-element)和meja -响应元件(TGACG-motif或CGTCA-motif);和24gydF4y2BaPtRabsgydF4y2Ba包括他们两个。此外，在36,30,28和25的启动子区域发现了GA-、ABA-、乙烯-和生长素响应元件gydF4y2BaPtRabsgydF4y2Ba,分别。此外，在启动子中存在丰富的胁迫响应元件gydF4y2BaPtRabsgydF4y2Ba．前三名应力响应元素是防御，热和缺氧响应元素，其呈现在54,53和52的启动子中gydF4y2BaPtRabsgydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:图S3和附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba：图S4）。这些结果表明gydF4y2BaPtRabgydF4y2Ba基因可能参与多种激素和压力反应。gydF4y2Ba

差异表达概况gydF4y2BaPtRabsgydF4y2Ba横跨组织和各种压力gydF4y2Ba

探讨…的潜在作用gydF4y2BaPtRabsgydF4y2Ba在各种组织或发育阶段，可公开获得的微阵列数据是用来分析它们的表达模式。在各种组织中，大部分gydF4y2BaPtRabgydF4y2Ba成员在Phloem和Xylem中高度表达，特别是gydF4y2BaPtRabCgydF4y2Ba亚家族。相比之下，大多数gydF4y2BaPtRabsgydF4y2Ba在生殖器官中表达相对较低（附加档案gydF4y2Ba6GydF4y2Ba:图S5A及附加文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:表S2)。在茎的发育过程中，一半以上gydF4y2BaPtRabsgydF4y2Ba在第5和第9个间的资源中高度表达，这在初级增长转变为二次增长（附加档案）gydF4y2Ba6GydF4y2Ba：图S5B）。这些结果建议gydF4y2BaPtRabgydF4y2Ba基因可能参与与干发发有关的生物过程。gydF4y2Ba

然后，我们调查的表达谱gydF4y2BaPtRabsgydF4y2Ba在各种非生物胁迫下，包括低氮、伤害、干旱、热、冷、盐胁迫。在低氮处理下，只有两种gydF4y2BaPtRabsgydF4y2Ba（gydF4y2BaA3bgydF4y2Ba和gydF4y2BaG3F.gydF4y2Ba在8周的处理下，膨大叶片的叶绿素含量略有降低。对机械伤害的反应，11gydF4y2BaPtRabsgydF4y2Ba（gydF4y2BaA3agydF4y2Ba，gydF4y2BaA3bgydF4y2Ba，gydF4y2BaA4B.gydF4y2Ba，gydF4y2BaA4D.gydF4y2Ba，gydF4y2BaA5A.gydF4y2Ba，gydF4y2BaA5B.gydF4y2Ba，gydF4y2BaA5D.gydF4y2Ba，gydF4y2BaC2agydF4y2Ba，gydF4y2Bad1a.gydF4y2Ba，gydF4y2BaG3E.gydF4y2Ba和gydF4y2BaG3F.gydF4y2Ba)上调，7gydF4y2BaPtRabsgydF4y2Ba（gydF4y2BaA4AgydF4y2Ba，gydF4y2BaA6gydF4y2Ba，gydF4y2BaB1agydF4y2Ba，gydF4y2BaC1agydF4y2Ba，gydF4y2BaF1B.gydF4y2Ba，gydF4y2BaF2C.gydF4y2Ba和gydF4y2BaH1D.gydF4y2Ba)在扩张叶处理1周后下调。的表达gydF4y2BaPtRabsgydF4y2BaSoligo和Carpacio基因型对干旱胁迫不敏感。共14个gydF4y2BaPtRabsgydF4y2Ba受热应激影响，包括7gydF4y2BaPtRabsgydF4y2Ba（gydF4y2BaA2cgydF4y2Ba，gydF4y2BaA4AgydF4y2Ba，gydF4y2BaA6gydF4y2Ba，gydF4y2BaB1bgydF4y2Ba，gydF4y2BaC1agydF4y2Ba，gydF4y2BaG3F.gydF4y2Ba和gydF4y2BaH1D.gydF4y2Ba)上调，7gydF4y2BaPtRabsgydF4y2Ba（gydF4y2BaA3agydF4y2Ba，gydF4y2BaA5E.gydF4y2Ba，gydF4y2BaC2agydF4y2Ba，gydF4y2Bad1a.gydF4y2Ba，gydF4y2BaE1bgydF4y2Ba，gydF4y2BaE1dgydF4y2Ba和gydF4y2BaG3E.gydF4y2Ba）被调节了。在冷压力下，两个gydF4y2BaPtRabsgydF4y2Ba（gydF4y2BaA6gydF4y2Ba和gydF4y2BaH1D.gydF4y2Ba）和三gydF4y2BaPtRabsgydF4y2Ba（gydF4y2BaA3agydF4y2Ba，gydF4y2BaC2agydF4y2Ba和gydF4y2BaG3E.gydF4y2Ba）显着上调（额外文件）gydF4y2Ba6GydF4y2Ba:图S5)。gydF4y2Ba

揭示之间的分歧gydF4y2BaPtRabgydF4y2Ba副骨头，表达27gydF4y2BaPtRabgydF4y2Ba在24种组织中比较寄生对对。只有七个gydF4y2BaPtRabgydF4y2Ba对（gydF4y2BaA1i / A1jgydF4y2Ba，gydF4y2BaA2d / A2egydF4y2Ba，gydF4y2BaA4c / A4egydF4y2Ba，gydF4y2BaD2B / D2D.gydF4y2Ba，gydF4y2BaD2c / D2egydF4y2Ba，gydF4y2BaE1a / E1cgydF4y2Ba和gydF4y2BaF2B / F2C.gydF4y2Ba)显示出高度相似的模式gydF4y2BaRgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba > 0.6 across various tissues (Fig.3gydF4y2Ba和附加文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba：表S3）。这表明了大部分gydF4y2BaPtRabgydF4y2Ba副舌对在进化过程中是发散的。值得注意的是,四gydF4y2BaPtRabgydF4y2Ba副骨头（gydF4y2Baaib / A1egydF4y2Ba，gydF4y2BaF1a / F1bgydF4y2Ba，gydF4y2BaH1a / H1cgydF4y2Ba和gydF4y2Bag3e / g3 ggydF4y2Ba）显示出显着的差异（gydF4y2BaRgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba < 0.1) in expression abundance between two genes in each pair - one has high abundance while another one was extremely low expressed in detected tissues (Fig.3gydF4y2Ba）.表达式gydF4y2BaRgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba同源对的基因间差异与复制日期呈负相关。值得注意的是，这七对表情都很高gydF4y2BaRgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba在9.98〜16.25 mya（图2中的红色点圈）重复。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

然后，我们选择了10gydF4y2BaPtRabgydF4y2Ba来自八个亚属的副骨对，使用QRT-PCR在各种非生物应激下验证它们的响应性。与微阵列数据的结果类似（附加文件gydF4y2Ba6GydF4y2Ba：图S5），大多数基因在10gydF4y2BaPtRabgydF4y2Ba寄生对对干旱胁迫不敏感（图。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba）.在盐，冷或氧化胁迫下，大多数gydF4y2BaPtRabgydF4y2Ba在应激后2和12小时下，基因下调。尽管gydF4y2Baptrabe1b.gydF4y2Ba和gydF4y2Baptrabh1c.gydF4y2Ba尤其是在盐胁迫下，它们的基因表达上调了吗gydF4y2Baptrabe1b.gydF4y2Ba在第2和12小时都被迅速诱导。这意味着gydF4y2Baptrabe1b.gydF4y2Ba可能在盐胁迫耐受性中发挥作用。总的来说，所选的10个表达式gydF4y2BaPtRabgydF4y2Ba在不同的非生物胁迫下，副舌对之间存在差异。gydF4y2Ba

Co-expression网络gydF4y2BaPtRabsgydF4y2Ba

进一步揭示。的功能差异gydF4y2BaPtRabsgydF4y2Ba在不同的亚科属中，我们构建了一个共同表达网络gydF4y2BaPtRabsgydF4y2Ba．67人中的61人gydF4y2BaPtRabsgydF4y2Ba和411个TFS被确定在gydF4y2BaPtRabsgydF4y2Baco-expression网络(图。gydF4y2Ba4AgydF4y2Ba和表S4）。在6151个基因中gydF4y2BaPtRabsgydF4y2Ba共表达网络，gydF4y2BaRabAgydF4y2Ba子网络表示为最大的子网络，包括共4387个基因（71.32％）和24gydF4y2BaRabAgydF4y2Ba成员;而凡gydF4y2BaRabFgydF4y2Ba和gydF4y2BaRabGgydF4y2Ba子网仅包括整个网络中的6.15和7.79％（附加文件gydF4y2Ba9gydF4y2Ba:图S6)。筛选后的TF基因编号(附加文件gydF4y2Ba9gydF4y2Ba：图S6）及其丰富（附加文件gydF4y2Ba10gydF4y2Ba：图S7），每个子网络中，我们发现了四个gydF4y2Ba慧聪一gydF4y2Ba（gydF4y2BaHSFA4agydF4y2Ba，gydF4y2BaHSFA5agydF4y2Ba，gydF4y2BaHSFA5bgydF4y2Ba和gydF4y2BaHSFB3bgydF4y2Ba)富集了7.697倍gydF4y2Ba瑞芭gydF4y2Ba子。gydF4y2Ba

然后，在不同的子网络的基因gydF4y2BaPtRabgydF4y2BaSubfamilies用于进行富集分析。明显，所有的八个（gydF4y2BaPtRabA-HgydF4y2Ba）子网络中的“细胞内信号传导级联”和“小GTP酶介导的信号转导”（图中富集。gydF4y2Ba4B.gydF4y2Ba，附加文件gydF4y2Ba11gydF4y2Ba:表S4和附加文件gydF4y2Ba12gydF4y2Ba:表S5)。gydF4y2BaPtRabEgydF4y2Ba和gydF4y2BaPtRabFgydF4y2Ba子网络在“信号处理”方面得到了丰富gydF4y2BaPtRabBgydF4y2Ba和gydF4y2BaPtRabEgydF4y2Ba亚网络富集在“GTP酶活性调节”中。对于子网特定的丰富GO条款，gydF4y2BaPtRabAgydF4y2Ba子网富集在“细胞墙组织”中，gydF4y2BaPtRabDgydF4y2Ba亚网络富集在“肌动蛋白细胞骨架组织”中，gydF4y2BaPtRabFgydF4y2Ba亚网络在“细胞内运输”中富集，而gydF4y2BaPtRabGgydF4y2Ba子网络在“基于微管的过程”（图富集。gydF4y2Ba4B.gydF4y2Ba）.此外，该基因主要与之共同表达gydF4y2Baptrabe1b.gydF4y2Ba根据他们的注释进行功能分类。共表达24个运输-、11个胁迫-、10个信号-、5个蛋白-、7个代谢-、6个发育-、4个细胞骨架-和2个自噬相关基因gydF4y2Baptrabe1b.gydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba13gydF4y2Ba：图S8）。gydF4y2Ba

不同亚属蛋白的PTRAB蛋白的亚细胞定位gydF4y2Ba

Plant Rab蛋白协调内膜运输的不同步骤，并显示出特定的亚细胞定位[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．随后，选择代表不同亚壳的八个PTRAB用于亚细胞定位分析gydF4y2Ba烟草benthamianagydF4y2Ba叶表皮细胞。八种融合蛋白(gydF4y2Ba35个年代gydF4y2Ba::在PM上检测到YFP-PTRABS），如通过与PM标记FM4-64共同定位的（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba右侧小组）。另外，进行包括GFP-SYP43（TGN），ST-GFP（GOLGI），ARA7（内体）和GFP-HDEL（ER）的众所周知的细胞器标记，以确认它们在细胞器中的精确定位。PTRABA1C本地化在TGN中，四个PTRABS（B1C，D2A，E1B和H1C）局部化在GOLGI装置中，而PTRABF2C和PTRABG3C局部局部化（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba左面板)。但PtRabC1c定位于小泡中，与本研究中使用的任何细胞器标记物均未共定位，其精确定位有待进一步确定。gydF4y2Ba

自然变化gydF4y2Baptrabe1b.gydF4y2Ba

基于表达分析，gydF4y2Baptrabe1b.gydF4y2Ba在暴露于盐胁迫后在2小时内诱导，并且当曝光延伸至12小时时，诱导增强（图。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba）.此外，11个应激相关基因主要与gydF4y2Baptrabe1b.gydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba13gydF4y2Ba：图S8）。然后我们使用了gydF4y2Baptrabe1b.gydF4y2Ba用于进一步的功能分析。已知在基因中的单核苷酸多态性（SNP）的自然变化在基因中引入功能性分歧。为了检测PtraBe1b的保守结构域是否受到自然条件的影响，整个基因组重新测序数据为549gydF4y2BaP. Trichocarpa.gydF4y2Ba分析了北美的自然个体。如附加文件所示gydF4y2Ba14gydF4y2Ba：图S9，共识别了总共227个SNPgydF4y2Baptrabe1b.gydF4y2Ba基因体（包括UTR，外显子和内含子）和四个SNP影响非同义编码（I45N，E100V，E168V和S201P）。明显的是，四个非同义SNP不位于PtraBe1b的保守基板中（附加文件gydF4y2Ba14gydF4y2Ba：图S9c）。gydF4y2Ba

过表达构成型激活突变体PtRabE1b(Q74L)可增强杨树的耐盐性gydF4y2Ba

进一步调查的功能gydF4y2Baptrabe1b.gydF4y2Ba中，组成性激活突变型PtRabE1b（Q74L）通过Q74的点突变构建到L在基序2（图gydF4y2Ba6AgydF4y2Ba和附加文件gydF4y2Ba14gydF4y2Ba：图S9c）。包含由CAMV驱动的PTRABE1B（Q74L）的植物二元构造gydF4y2Ba35个年代gydF4y2Ba在杂交杨树(gydF4y2BaP. Alba.gydF4y2Ba×gydF4y2Bap . glandulosagydF4y2Ba）克隆84k.得到总共25条具有潮霉素抗性的型株，并使用QRT-PCR确认阳性转化体。选择具有高转录水平的两个独立的转基因系（＃11和＃13）以进一步分析。在正常情况下，比野生型（WT）在两种转基因系中分化更不定位的根（ARS），但转基因系和WT植物之间的平均根长度并不显着差异。当幼苗暴露于盐胁迫（50和100mM NaCl）时，在WT杨树中抑制了根分化（根数）和根生长（根长）。相比之下，即使在盐胁迫下，两个转基因系即使在盐胁迫下也会保持较大的根生长状态（图。gydF4y2Ba6GydF4y2Ba）.这说明过表达构成性激活物RabE1b(Q74L)增强了杨树的耐盐性。然后我们选择了10个不同的基因gydF4y2Baptrabe1b.gydF4y2Ba共表达网络验证PtraBe1B（Q74L）过表达杨树中的表达式。七种贩运相关基因（gydF4y2BaGot1就是这样的gydF4y2Ba，gydF4y2BaKEUgydF4y2Ba，gydF4y2BaP24.gydF4y2Ba，gydF4y2Baphf1.gydF4y2Ba，gydF4y2BaSEC14gydF4y2Ba，gydF4y2BaSKD1.gydF4y2Ba和gydF4y2BaSYP61gydF4y2Ba)，一种与压力有关的TF (gydF4y2BabZIP60gydF4y2Ba)，自噬相关基因(gydF4y2BaATG18a-1gydF4y2Ba）和发展相关的基因（gydF4y2BaEPC1gydF4y2Ba）在两个PTRABE1B（Q74L）过表达线中上调（图。gydF4y2Ba6GgydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

Rab GTPase作为囊泡运输的重要蛋白，参与囊泡运输的整个过程，包括从供体细胞器出芽、对接、栓系和与靶膜融合[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．rabb家族在酵母、哺乳动物和高等植物中高度保守[gydF4y2Ba6GydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]，因此它为生物体中的囊泡输送提供了一致的基础。这里，总共67个非冗余gydF4y2BaRabgydF4y2Ba基因在gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba，它比这更折叠了gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba（56.gydF4y2Baatrabs.gydF4y2Ba）和相对低于1.4〜1.6推定的杨树同源物的比率gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba基因(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．似乎多种子糖生物体与酵母中的7-11 rab相比具有较大的rab gtpase家族成员。可能是多细胞生物面临复杂的情况并适应复杂的代谢。gydF4y2Ba

Raba Subfamily是杨树和杨树最大的亚家族gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.然而，酵母和动物只有少数成员对应RabA亚群[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．RAB2亚组与人Rab11和Rab25密切相关，rab25通常认为与PM蛋白质的偏振回收相关联。对豌豆和番茄的研究表明Rabas在细胞 - 壁组分的靶向分泌中发挥作用，以限制细胞表面的区域[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．在杨树中，鉴定了四名RABA成员gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，但其在整个Rab家族中的比例(41.8%;28gydF4y2BaPtRabAsgydF4y2Ba67年gydF4y2BaPtRabsgydF4y2Ba)相对低于在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba(42.9%;24 56)。值得注意的是，RabA6的成员在杨树比gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，类似于大米[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba];这意味着Raba6可能不会在不同物种上播放节约功能。在扩大过程中gydF4y2BaRabgydF4y2Ba家庭在gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba基因组，未观察到串联复制事件。但Chr4上有两个RabA簇(PtRabA1b、PtRabA1c和PtRabA1d)和Chr11上有两个RabA簇(PtRabA1e、PtRabA1f和PtRabA1h)，这两个簇可能在最新的WGD之前已经进行了串接复制。相比之下，在杨树中RabC亚科扩展到7个，而在杨树中只有3个gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba功能不明确。在哺乳动物细胞中，其正原状RAB18主要参与ER中的脂质液滴形成，并且可能用于压力条件下的细胞代谢[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．杨树RabC的扩展可能与特定的应激反应或发育有关，但其功能尚需进一步研究。根据相关分析，27人中只有7人gydF4y2BaPtRabsgydF4y2Ba副骨对保持高相关性gydF4y2BaRgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba > 0.6, and about half (13 of 27) pairs showed significant divergence withRgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba < 0.3 (Fig.3.gydF4y2Ba）.另外，表达gydF4y2BaRgydF4y2Ba^2gydF4y2BaofgydF4y2BaPtRabgydF4y2Ba平行配对与重复数据呈负相关。七个gydF4y2BaPtRabgydF4y2Ba仍然保持高表达相似性的副骨头主要是围绕最近的大规模基因组重复事件产生的gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba(~ 13米娅;无花果。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba) ［gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在对保守的Rab motif的调查中，我们发现几乎所有的PtRab成员都有四个保守的motif，除了几个在最新发布的PtRab中没有很好注释的PtRabsgydF4y2BaP. Trichocarpa.gydF4y2Ba基因组。四个保守的主题为其核苷酸结合和水解功能发挥关键作用[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．三个残基（在图案2中的图案1，q中的q在附加文件中标记的图案3中的n和ngydF4y2Ba2gydF4y2Ba图S1)可用于生成显性阴性或构成性活性突变体，用于基因功能研究。在本研究中，我们通过基序2中Q74对L的点突变构建了ptrab1b的活性突变，并在杨树中过表达ptrab1b (Q74L)。正常条件下和盐胁迫下过表达PtRabE1b(Q74L)的杨树表型表明，PtRabE1b Q74位点突变可引入构成性活性，该突变可用于基因功能研究。gydF4y2Ba

Rab蛋白表现出限制和特定的亚细胞局部。哺乳动物Rab11在再循环内体并调节对特定PM结构域的交通和不同细胞类型的TGN [gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．Rab11直系同源的功能可以或者在哺乳动物或植物是保守的。由于植物中的同源Rab11的，拉巴亚家族成员具有相同的定位。在根[划分区RabA1a，RabA1b和RabA1c共定位与TGN标记gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．此外，Raba Subfamily的成员在亚细胞贩运的不同步骤中已经进化了不同的功能。在杨树，gydF4y2BaPtRabA1cgydF4y2Ba精确地位于TGN和PM，这暗示了Raba Subfamily的功能保护。烟草表皮细胞或稳定表达中的瞬时表达gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba在GOLGI设备和PM中指出ATRABE1D [gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]，这与我们的PtraBe1b的发现一致。对于其他亚属的成员，他们中的大多数显示出与其他植物物种中报告的直言数相似的本地化[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．然而，RabC的本地化证据仍然缺乏。一项使用哺乳动物细胞的研究显示，Rab18, RabC的同源物，通过抗体染色定位于核内体。此外，在ER和高尔基体中也存在[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．在我们的研究中，PTRABC1C本地化在小囊泡中，但除PM之外没有任何标记重叠。应进行进一步的研究以调查RAB蛋白的各种定位。gydF4y2Ba

Rab GTPases在发育中有多种作用。gydF4y2Barabidopsis rabe.gydF4y2Ba下调导致叶片形态和降低的植物尺寸发生了急剧改变[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．烟草gydF4y2BaNbRabE1gydF4y2Ba沉默导致生长停滞、早衰和叶片发育异常。的显性阴性突变体gydF4y2BaNbRabE1gydF4y2Bain.gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba导致枝和根生长迟缓，并伴有根毛形成缺陷[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．除了成员gydF4y2Ba瑞芭gydF4y2Ba亚家族，gydF4y2BaRabgydF4y2Ba其他亚家族的基因也起着重要作用。过度表达是一种结构性的活跃形式gydF4y2Barabidopsis rabg3b.gydF4y2Ba通过在转基因杨树中的自噬激活来促进Xylem发展[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．在树木生物学的独特过程中，最明显的一个是不同于草本植物的维管形成层的次生木质部的年生发育。从我们的结果来看，几乎所有的gydF4y2BaRabgydF4y2Ba基因在木质部和韧皮部高度表达。的表达水平gydF4y2BaRabgydF4y2Ba随着节间成熟期的到来，基因数量增加gydF4y2Ba6GydF4y2Ba:图S5)。它可以解释在这一发育过程中大量物质在细胞内的运输。一般来说，木材是植物细胞壁聚合物的产物，木材的形成是植物细胞壁沉积的结果。各种植物细胞壁合成相关的酶和代谢物已经被证明是由膜运输介导的。例如，纤维素合酶、半纤维素、果胶和其他多糖从高尔基体转运到细胞膜或分泌到细胞外空间[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

作为固着生物，植物获得了不同的策略来应对周围环境中的各种生物和非生物胁迫[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．在应激反应中，gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba- 通过控制TF结合位点和启动子效率来调节基因表达中的枢转作用[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．我们的结果表明gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba- 为...的元素gydF4y2BaPtRabgydF4y2Ba基因参与多种激素和应激反应。大部分的gydF4y2BaPtRabgydF4y2Ba促销者包含暗示的SA和MEJA响应元件gydF4y2BaPtRabgydF4y2Ba基因可能与病原体抗性有关。在番茄中，两个RabE成员Api2和Api3可以与gydF4y2BaPst DC3000gydF4y2BaTTSS效应器AvrPto [gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．过表达构成活性RabE1d(Q74L)gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba抵抗gydF4y2BaP. inringae.gydF4y2Ba感染(gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．此外,gydF4y2BaRabgydF4y2Ba基因参与了植物对非生物胁迫的耐受。例如，两者gydF4y2Barabidopsis raba1gydF4y2Ba四重突变体（完全被淘汰表达gydF4y2BaRabA1agydF4y2Ba，gydF4y2Ba达到此gydF4y2Ba，gydF4y2Ba糖化血红蛋白gydF4y2Ba和gydF4y2BaA1dgydF4y2Ba)和显性阴性突变体RabA1b(S27b)在15mm NaCl浓度下表现出对盐胁迫的超敏性[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．损失gydF4y2BaARA6gydF4y2Ba(也称为gydF4y2BaRabF1gydF4y2Ba）授予gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba盐超敏;但ARA6（Q93L）-GFP的过度表达赋予高盐胁迫的耐受性，在没有其他PM蛋白质的盐胁迫后在PM后形成的离散斑点[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．此外,过度的gydF4y2BaPennisetum glaucum pgrab7.gydF4y2Ba或者gydF4y2BaProsopis Juliflora PJRAB7.gydF4y2Ba的同系物gydF4y2Ba拟南芥RabG3egydF4y2Ba，胙盐耐受性的转基因烟草[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．在植物中，Rabs被大大扩展，但其中许多的功能是未知的。这可能反映了rabs扩大以应对我们的普遍环境条件的事实，这是我们的支持gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba-Acting元素，共表达网络和表达配置文件分析。在我们的研究中，在转基因杨树中的组成型活性Rabe1B（Q74L）的过表达赋予耐盐性（图。gydF4y2Ba6GydF4y2Ba）.来自共表达网络，四个gydF4y2BaHSFgydF4y2Ba包括gydF4y2BaHSFA4agydF4y2Ba都富含gydF4y2Ba瑞芭gydF4y2Ba子网（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和附加文件gydF4y2Ba10gydF4y2Ba：图S7）。在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，gydF4y2BaHSFA4agydF4y2Ba具有耐盐性，并受氧化应激和MPK3/MPK6调控[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．它的同源物gydF4y2Ba菊花gydF4y2Ba，gydF4y2BaCmHSFA4gydF4y2Ba，也被证明通过维持Na正常调节耐盐性gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba离子平衡gydF4y2BaSOS1.gydF4y2Ba和gydF4y2BaHKT2gydF4y2Ba及规管活性氧清道夫的活动[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．在直接共同表达的基因中gydF4y2Baptrabe1b.gydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba13gydF4y2Ba：图S8），gydF4y2BaSOS2.gydF4y2Ba，gydF4y2BaMPK19gydF4y2Ba和CagydF4y2Ba^{２＋gydF4y2Ba}信号传导相关基因（gydF4y2BaCAM7gydF4y2Ba，gydF4y2BaCKL6gydF4y2Ba和gydF4y2Ba钙离子交换器gydF4y2Ba）是与植物耐盐这些研究是一致的。当gydF4y2BaSOS2.gydF4y2Ba用氨基末端催化结构域和羧基末端调节结构域编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。SOS2可以物理地与SOS3，MyRistoylated钙结合蛋白激活，形成SOS3-SOS2激酶复合物，用于转录调节gydF4y2BaSOS1.gydF4y2Ba．并且该途径由钙信号介导[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联是真核生物中普遍存在的信号转导模块。据报道，MPK家族的一些成员参与了盐胁迫反应，如MPK3、MPK4和MPK6在NaCl胁迫下被激活，激活的MKK9通过激活内源性的MPK3和MPK6表达增强了对盐的敏感性gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba42gydF4y2Ba］．此外，MPK6可以将SOS1的C末端片段磷酸化以排除NAgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba来自细胞[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

总之，我们综合分析了进化关系gydF4y2BaRabgydF4y2Ba基因家族在gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba和功能表征gydF4y2Baptrabe1b.gydF4y2Ba，赋予转基因杨树的耐盐性。我们的调查结果提供了深入识别的囊泡传输基因的结构 - 定位功能关系和基因工程丰富资源，以改善树木的应力耐受性。gydF4y2Ba

序列检索和系统发育重建gydF4y2Ba

发表gydF4y2Ba拟南芥RabgydF4y2Ba序列(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba检索并用作爆炸搜查的疑问gydF4y2BaP. Trichocarpa.gydF4y2Ba基因组数据库（gydF4y2Bahttp://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_PtrichocarpagydF4y2Ba)识别潜在的gydF4y2BaPtRabgydF4y2Ba基因。如果他们对期望满足（以前），则接受了预测的RAB家族成员的所有同源蛋白序列（gydF4y2BaEgydF4y2Ba)值< 10gydF4y2Ba^{−10gydF4y2Ba}．Rab蛋白的多重对准gydF4y2BaP. Trichocarpa.gydF4y2Ba和gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba使用Clustal X2.1进行手术[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．使用Mega 7.0.26构建最大可能性（ml）系统发育树[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba在Jones-Taylor-Thornton (JTT)氨基酸替代模型下，采用1000个bootstrap。gydF4y2Ba

生物信息学分析gydF4y2BaPopulus rab.gydF4y2Ba基因gydF4y2Ba

使用基因结构显示服务器（GSD）来说明外显子和内含子结构[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba］．染色体位置和重复gydF4y2BaRabgydF4y2Ba基因是用Circos软件绘制的[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．分析假设gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba-作用调控元件，翻译起始位点(TSS)上游1500bp使用PlantCARE数据库[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．PAL2NAL程序(gydF4y2Bahttp://www.bork.embl.de/pal2nal/gydF4y2Ba）被用来估计同义（gydF4y2BaKgydF4y2Bas）和非同义词（gydF4y2BaKgydF4y2Baa）替代利率。根据T =计算分歧时间（t） KgydF4y2BaS /（2×9.1×10gydF4y2Ba^{−9gydF4y2Ba}）万年前（Mya）gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba［gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．对于共表达网络的构建，表达数据在gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba植物群落基因图谱研究(gydF4y2Bahttps://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.htmlgydF4y2Ba#)。平行计算所有基因表达载体之间的Pearson相关性。对产生的相关性应用大于或等于0.85的阈值，其余相关性由Cytoscape可视化[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．每个子网络的氧化石墨烯富集使用agriGO [gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

公开可用的微阵列数据分析gydF4y2Ba

使用加入号GSE21481，GSE21485和GSE13043，从NCBI基因表达式omnibus（Geo）数据库获得各种组织和发育阶段的微阵列数据。对于非生物应力，Affymetrix微阵列数据具有串联登录号GSE14893和GSE148515（氮气限制），GSE16783和GSE16785（伤口），GSE17225（干旱），GSE41557（热，42°C 6 H）和GSE43872（冷，4°C）分析了10 h）。对应于gydF4y2BaPtRabsgydF4y2Ba基因使用在线探头匹配工具POParray（标识gydF4y2Bahttp://aspendb.uga.edu.gydF4y2Ba)，并列于附加档案gydF4y2Ba3.gydF4y2BaS2:表。采用基因芯片鲁棒多阵列分析(GCRMA)算法对数据进行归一化，然后进行对数变换和平均计算。进行相关性分析gydF4y2BaPtRabgydF4y2Ba递倒钩，表达数据gydF4y2BaPtRabsgydF4y2Ba在24gydF4y2BaP. Trichocarpa.gydF4y2Ba在获得组织gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba植物群落基因图谱研究(gydF4y2Bahttps://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.htmlgydF4y2Ba#)。Pearson相关性是在每对的副骨基因之间计算的。gydF4y2Ba

质粒和构建体gydF4y2Ba

全长CDgydF4y2BaPtRabA1cgydF4y2Ba，gydF4y2BaRabB1cgydF4y2Ba，gydF4y2BaRabC1cgydF4y2Ba，gydF4y2Barabd2a.gydF4y2Ba，gydF4y2Barabf2c.gydF4y2Ba，gydF4y2Barabg3c.gydF4y2Ba和gydF4y2Barabh1c.gydF4y2Ba从cDNA中扩增gydF4y2BaP. Trichocarpa.gydF4y2Ba并被引入PDNor222.1（Life Technologies，Carlsbad，California，美国）生产PENTR载体。随后，通过测序验证PELR载体中的基因，然后亚克隆到PearleyGate104（Abrc Stock DB3-686）中进行验证以产生gydF4y2Ba35个年代gydF4y2Ba:: yfp-gydF4y2BaPtRabgydF4y2Ba■使用Gateway克隆系统（Invitrogen）的构建体。为了产生PtRabE1b的Q74L取代，定点诱变是通过重叠PCR进行。使用含有所期望的改变（下划线）四种引物：PtRabE1b-QL-1，5'-ATGGCTGCACCGCCAG-3';PtRabE1b-QL-2，5'-AGTTCGGAAACGTTCCgydF4y2Ba一个gydF4y2Baggcctgctgtatcca-3';Ptrabe1b-ql-3,5'-tgggatacagcaggccgydF4y2BaTgydF4y2Baggaacgtttcgaact-3';Ptrabe1b-ql-4,5'-ttatgaaccacagcaagctgact-3'。通过221 bp的变化gydF4y2Baptrabe1b.gydF4y2BaCDS (A to T)， ptrab1b (Q74L)。将ptrab1b (Q74L)编码序列导入pDNOR222.1，利用Gateway克隆系统(Invitrogen公司)将其亚克隆到pMDC32中。将表达载体转入gydF4y2Ba根癌土壤杆菌gydF4y2Ba通过电穿孔GV3101。gydF4y2Ba

植物材料、生长条件及转化gydF4y2Ba

一岁的gydF4y2BaP. Trichocarpa.gydF4y2Ba在23-25℃下生长在生长室中，长日照条件下（16/8小时光照/黑暗）下。植物材料的qRT-PCR在不同组织（YL，幼叶; ML，成熟叶; PS，主茎; SS，辅助阀杆; R，根。）从杂交白杨收集（gydF4y2BaP. Alba.gydF4y2Ba×gydF4y2Bap . glandulosagydF4y2Ba）克隆84k.样品立即在液氮中冷冻，并在-80℃下储存以进一步分析。进行三种生物重复。gydF4y2Ba

对于非生物应激和激素治疗，gydF4y2BaP. Trichocarpa.gydF4y2Ba在的Hoagland营养液的秧苗水培养传代培养后的15天1/2 MS固体培养基。然后将幼苗用10％聚乙二醇（PEG，干旱应力），150mM NaCl的（盐应力），37℃（热应力），4℃（对于冷应力），10μM甲基紫精（处理过MV，用于分别氧化应激）或100μM的脱落酸（ABA）。控制植物在正常条件下的Hoagland营养液中生长。在处理中，三个时间点（0,2和12小时）被选择用于样品收集。当一个bove samples were immediately frozen in liquid nitrogen after harvest and stored at − 80 °C for further analysis.

PTRABE1B（Q74L）的杨树稳定变换是通过Liu等人所述的叶盘方法。［gydF4y2Ba50gydF4y2Ba］．共有25条独立的转基因线携带gydF4y2Ba35个年代gydF4y2Ba::获得耐潮霉素PtRabE1b(Q74L)结构体。使用ptrab1b (Q74L)高转录组的2个株系(#11和#13)进行进一步分析。gydF4y2Ba

PtRabs的亚细胞定位gydF4y2Ba

Co-expression的gydF4y2Ba35个年代gydF4y2Ba:: yfp-gydF4y2BaPtRabgydF4y2BaS构建体和荧光标记gydF4y2Ba烟草benthamianagydF4y2Ba使用叶片下表皮细胞使用gydF4y2Ba农杆菌gydF4y2Ba变换由Zhang等人所描述的。［gydF4y2Ba51gydF4y2Ba］．使用LSM 510共焦激光扫描显微镜观察渗透烟叶的荧光。对于YFP / FM4-64样品的荧光成像，使用488/543-NM激发和505-530 / 585nm过滤器。对于GFP / YFP样品，使用458/514-NM励磁和475-525 / 520-555 NM过滤器。gydF4y2Ba

RNA分离和实时qRT-PCRgydF4y2Ba

使用RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen)提取总RNA，并在柱上用RNase-free DNase I (Qiagen)去除基因组DNA。根据制造商的程序，使用SuperScript III逆转录试剂盒(Invitrogen公司)，用大约1 μg RNA合成第一链cDNA。采用Primer3软件设计引物，引物熔化温度为58 ~ 60℃，扩增长度为100 ~ 250 bp (gydF4y2Bahttp://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htmgydF4y2Ba）.所有底漆序列都列在附加文件中gydF4y2Ba15gydF4y2Ba：表S6。根据制造商的说明，使用Sybr Premix ExTaq™II套件（Takara，大连，中国）（Roche Applied Scients，德国普兹贝格，德国上巴伐利亚州上巴伐利亚，德国）的Sybr Premix extaq™II套件（Takara，大连）进行了实时QRT-PCR。所有实验均以三种生物重复和四种技术重复进行。当gydF4y2BaPtactin.gydF4y2Ba和gydF4y2BaPtTubulingydF4y2Ba基因被用作内部对照。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

所有数据以至少三次重复的平均值±标准误差(SE)表示。学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba- 最低用于测试对照植物和转基因系之间的差异的重要性。星号（*或**）表示控制和转基因植物之间的显着差异gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05或0.01。gydF4y2Ba

阿坝:gydF4y2Ba

脱盐酸gydF4y2Ba

呃：gydF4y2Ba

内质网gydF4y2Ba

HVD:gydF4y2Ba

高变C-末端结构域gydF4y2Ba

KgydF4y2Ba答：gydF4y2Ba

非同义替代率gydF4y2Ba

KgydF4y2Ba史:gydF4y2Ba

同义替换率gydF4y2Ba

MV:gydF4y2Ba

甲基viologen.gydF4y2Ba

mya：gydF4y2Ba

百万年前gydF4y2Ba

挂钩:gydF4y2Ba

聚乙二醇gydF4y2Ba

圈套：gydF4y2Ba

可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着受体gydF4y2Ba

SNP:gydF4y2Ba

单核苷酸多态性gydF4y2Ba

TF：gydF4y2Ba

转录因子gydF4y2Ba

TGN:gydF4y2Ba

Trans-Golgi网络gydF4y2Ba

TSS：gydF4y2Ba

翻译开始网站gydF4y2Ba

UTR：gydF4y2Ba

翻译区gydF4y2Ba

WGD：gydF4y2Ba

全基因组重复gydF4y2Ba

yfp：gydF4y2Ba

黄色荧光蛋白gydF4y2Ba

我们要感谢审稿人和编辑对此手稿的仔细阅读和有用的评论。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

本文由国家自然科学基金[31270699]资助J.C.，江苏省高等学校协同创新计划资助M.L.资助。资助方未参与研究设计、数据收集与分析、决定发表或撰写论文。gydF4y2Ba

可用性数据和材料gydF4y2Ba

在本研究期间生成或分析的所有数据都包含在本文（及其补充信息文件）中，或者可以从合理的请求中获取相应的作者。蛋白质序列和包括对准的系统序列和系统序列数据已沉积在TreeBase储存库中（ID：22857）。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. 张晋和李宇对这项工作贡献相当。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 中国林业科学研究院林业研究所林木遗传育种国家重点实验室，国家林业局林木育种培育重点实验室，北京gydF4y2Ba

   金章，余丽，鲍宾刘，李娟王，李张，建军胡，君辰兼孟志鲁gydF4y2Ba

2. 美国田纳西州橡树岭国家实验室生物科学部gydF4y2Ba

   金张gydF4y2Ba

3. 发展生物学研究举措，生物系，麦吉尔大学，蒙特利尔，魁北克，加拿大gydF4y2Ba

   Huanquan郑gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

JZ和ML设计了这项研究。JZ、YL、BL和LZ进行了实验。JZ和YL分析数据并撰写手稿。LW, JH, JC和HZ参与了数据收集和数据分析。JZ, HZ和ML对手稿进行了修改。所有作者阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaLijuan王gydF4y2Ba或者gydF4y2BaMengzhu陆gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

竞争利益gydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

出版商的注意事项gydF4y2Ba

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开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba）如果您向原始作者和源给出适当的信用，则允许在任何介质中进行不受限制的使用，分发和再现，提供指向Creative Commons许可证的链接，并指示是否进行了更改。Creative Commons公共领域奉献豁免（gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba）除非另有说明，否则适用于本文中提供的数据。gydF4y2Ba

再版和权限gydF4y2Ba