冻融、酸沉降和除冰盐复合胁迫对紫花苜蓿幼苗的生理效应

背景

我国东北地区冻融现象频繁，融冰盐使用广泛，酸性降水强烈，对植物的生物膜通透性、渗透调节、光系统等方面都造成了危害。本研究旨在探讨紫花苜蓿对冻融(F)、酸沉淀(A)和除冰盐(D)的抗性紫花苜蓿简历。以东木-70为试验材料，测定丙二醛(MDA)、可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸和叶绿素含量。

结果

随着温度降低，组合应力（A-D-F）下组的幼苗中的MDA含量增加，并且显着高于F组（69.48〜136.40％）。与对照（CK）组的那些相比，治疗组中可溶性糖和脯氨酸等渗透物质较高，而可溶性蛋白质含量较低。治疗组幼苗中的叶绿素含量低于CK组;然而，在自由解冻周期期间叶绿素含量显示出非显着变化。

结论

紫花苜蓿生物膜和光系统渗透性的损伤是由胁迫引起的。此外，苜蓿通过适应性地增加渗透物质（如可溶性糖和脯氨酸）的潜力来维持渗透平衡。此外，冻融和除冰盐胁迫对植物的影响很大，但酸沉降和上述两种因素的联合胁迫对植物的影响不大。

冻融是指土层冻结和融化的物理地质现象冬末初春，发生在中国东北[中1]，和可能损害植物[2]。据报道，草型植物通过调节脯氨酸含量来抵御低温伤害[3.]．此外，考虑到冬季频繁和大雪，融雪剂被广泛使用，因为其成本低，不管它会导致植物路边在任何径流或飞溅[形式的严重损害的4.那5.]．此外，煤炭和石油的广泛使用，以及中国北方冬季燃煤产生的二氧化硫，都可能导致酸雨[6.]．此外，北美和欧洲后，中国是世界上遭受酸雨的第三大区[7.]．

紫花苜蓿具有抗寒、抗热、抗旱等逆境的特点，在我国高纬度地区广泛种植[8.在那里，酸液沉积和除冰盐常常伴随着冻融同时发生。以前的一些研究调查了苜蓿在单个因素下的抗性[9.那10.];然而，在实际环境中，植物往往受到多种因素的影响。因此，研究紫花苜蓿对复合胁迫的生理响应十分必要。在这个实验中,紫花苜蓿简历。以东武-70为实验材料，研究了复合胁迫下的生理反应。丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的最终产物，MDA含量可指示细胞膜损伤程度[11.]．可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸是渗透调节物质，可促进细胞结合水分含量[12.]．此外，叶绿素含量可以反映光合强度和物质合成速率，反映了破坏程度[13.]．通过对上述指标的测定，探讨紫花苜蓿对酸雨、融冰盐和冻融循环的抗性，为改进栽培技术，减轻对植物的伤害提供理论依据。

在MDA含量的变化

数字1shows that the MDA content in the seedlings of groups under combined stresses (A-F, D-F and A-D-F) was higher than that of the group under freeze-thaw (F) stress alone by 7.87 ~ 62.60%, 63.40 ~ 120.96% and 69.48 ~ 136.40%, respectively (see Additional file1）.这说明综合胁迫造成了更强的胁迫条件，导致紫花苜蓿植株中MDA的积累。在解冻期(8 ~ 14 h)，无论是联合胁迫还是单独冻融胁迫，各组幼苗MDA含量均有所下降。当温度升高至10℃(14 h)时，A-F组、D-F组和A-D-F组幼苗MDA含量分别降低57.58、42.10和40.20%(见附加文件)1）.它也可以从图观察。1冻融胁迫下，A-D-F组幼苗MDA含量显著高于A-F组(P.< 0.05)，与D-F组比较差异无统计学意义(P.> 0.05)。上述结果表明，组合应力对幼苗的MDA含量具有比单独的冷冻 - 解冻应力的MDA含量更大，并且除冰盐胁迫对MDA含量产生更大的影响，而不是酸性沉淀和冷冻解冻应力。

可溶性蛋白质含量的变化

根据图。2在组合应力组的苗的可溶性蛋白含量趋于增加最初但随后在整个冻融循环减少，而该冻融应力单独组的呈动态降低。When the temperature decreased to 0 °C (6 h), the soluble protein content in the seedlings of groups under the combined stresses peaked. At the thawing stage (8 ~ 14 h), the soluble protein content in the seedlings of groups under freeze-thaw stress was significantly lower than that of the control (CK) group (P.< 0.05)（see Additional file2），这可能归因于添加冻融应激。然而，与单独的冷冻 - 解冻应力下的基团相比，组复方应力下组幼苗中可溶性蛋白质的含量没有显着差异，表明酸沉淀应力或除冰胁迫对可溶性蛋白质的影响较低内容。此外，在此期间，在冻土组中检测到更高的可溶性蛋白质含量，而不是组合应力组，表明组合应力对植物造成更多损害而不是单个应力。

可溶性糖含量变化

数字3.表明，在冻融循环期间，每个试验组的可溶性糖含量显着高于CK组。当温度降低时，除了CK组外，所有组的幼苗中的可溶性糖含量增加，达到-5℃（8小时）。这些结果表明，在低温环境中，植物中可溶性糖含量显着增加，并且通过积累大量可溶性糖来保护植物。在经受冻融的结合应力，除冰盐和酸沉淀的植物中测量了最高可溶性糖含量。在解冻时期（8〜14小时）期间，除CK的所有组的幼苗中的可溶性糖含量随着温度的增加而降低。Notably, when the temperature rose from − 5 °C (8 h) to 0 °C (10 h), the soluble sugar content in the seedlings of group F was significantly lower than that of group A-D-F (by 17.13% (8 h) and 14.79% (10 h)) (see Additional file3.）（P.< 0.05)那but the soluble sugar content in the seedlings of groups A-F and D-F did not differ significantly from that of group F (P.> 0.05)。这些结果表明，三种胁迫因子共同作用的条件导致了植物可溶性糖的最大积累。

脯氨酸含量的变化

如图所示。4.，试验组幼苗中脯氨酸含量在整个冻融期均高于CK组，说明酸雨和除冰盐的胁迫导致植株中脯氨酸含量增加。冻结期间，F、A-F、D-F和A-D-F组幼苗脯氨酸含量增加，在−5℃(8 h)达到峰值;含量分别比10℃(2 h)高91.34、86.24、96.59和96.40%(见补充文件)4.）.在解冻期(8 ~ 14 h)，−5℃(8 h) F、A-F、D-F和A-D-F组的脯氨酸含量分别比0℃(10 h)降低了19.97、18.46、19.80和8.38%(见附加文件)4.）.数字4.还表明，脯氨酸含量显著高于组A-d-F比仅经受冻融组中（P. < 0.05). 除对照组外，酸雨胁迫组幼苗脯氨酸含量显著高于非酸雨胁迫组(P. < 0.05），这表明冻融胁迫伴随着酸沉降胁迫导致植物产生更多的脯氨酸以保护自身。

叶绿素含量变化

在冻融期，各试验组幼苗的叶绿素含量均呈现先下降后上升的趋势(图4)。5.）.At the freezing stage, the chlorophyll content in groups F, A-F, D-F and A-D-F tended to decrease and reached the minimum value at − 5 °C (8 h), which were 22.38, 12.73, 11.11 and 17.79% lower than those measured at 10 °C (2 h), respectively (see Additional file5.).在解冻期间（8 ~ 14 h） ，并与在− 5. 摄氏度（8 h） ，在10℃时测得的含量 摄氏度（14 h） 在F组中，A-F、D-F和A-D-F组的幼苗分别显著增加了42.32%、25.60%、25.77%和20.65%(P.< 0.05)（see Additional file5.）.但在整个冻融期，各试验组间叶绿素含量无显著差异(P.> 0.05)。

指数之间的相关性分析

桌子1表明在冻融条件下，MDA与脯氨酸呈极显著正相关(P. < 0.01), each of which was positively correlated with soluble sugars (P.< 0.05)。叶绿素与MDA，脯氨酸和可溶性糖负相关。但是，蛋白质与其他指标之间没有显着相关性。冻融+酸沉淀+除冰盐基的指标与冻融组的相关性相似，但在前组中所有相关性都是非常重要的（P. < 0.01). 这些结果表明，脯氨酸和可溶性糖含量在外界胁迫下随着丙二醛的积累而增加，而叶绿素含量则下降。

复合应力对膜系统的影响

丙二醛是植物在逆境条件下膜过氧化的主要产物之一，能与细胞内各种成分发生强烈反应，引起蛋白质、核酸等大分子交联聚合[14.]，导致膜结构受损及生理功能受损[15.那16.]．已经指出，造成引起的冻融，酸沉淀和融雪剂复杂应力环境膜损伤的程度可通过在MDA含量的变化[来表征17.]．在本实验中，3种胁迫因子对细胞膜的损伤导致−5℃时MDA含量的增加最为明显，说明联合胁迫对幼苗膜脂过氧化的损伤比单独胁迫更严重。这与已发表的低温胁迫对植物生理指标影响的结果一致[18.那19.]．类似的研究结果m .漂白亚麻纤维卷L.在盐胁迫下[20.]，在该实验中，有人指出加重对膜的损伤，并导致增加MDA含量盐胁迫。

复合应力对渗透调节物质的影响

蛋白质是生命的物质基础，是植物细胞中最丰富的有机大分子，是构成细胞的有机物的基本单位，是参与细胞内化学反应的酶的主要成分[21.]．可以看出,幼苗的可溶性蛋白质含量的团体压力低于CK组下冻融压力,可以解释为减少蛋白质合成酶或其他酶的活性植物在不良条件下,导致可溶性蛋白质含量下降。这一结果与Mao和Xu提出的结果相似，他们报告说盐处理导致植物幼苗蛋白质含量下降[11.]．本实验中幼苗可溶性蛋白含量随温度降低而升高，这是由于相关基因表达增强，可有效刺激保护物质的积累，降低细胞代谢，促进抗低温[22.]．可溶性蛋白在温度降低至-5℃并增加至10°C期间的原因可能是当植物适应不良条件和维持生长的植物时消耗蛋白质，类似于弗雷克的结果等人。，他在冬小麦叶子中调查了蛋白质含量及其冷冻抗性[23.]．

自由脯氨酸是植物中重要的渗透调节剂。据报道，在应力条件下，植物细胞中的脯氨酸质量比大大增加，这减少了细胞渗透势并帮助细胞吸收水，从而防止原生质和蛋白质分子从脱水中脱水[24.]．因此，脯氨酸含量的变化可作为植物抗寒性的指标[3.]．这个实验的结果表明，所有组的脯氨酸含量在低温环境显著上升。这与研究结果是一致的兔等，谁分析胁迫条件下渗透压的累积效应，并建议脯氨酸提高到低温胁迫抗性[25.]．Li等人不仅发现脯氨酸等渗透调节物质的积累可以降低细胞水势，维持渗透平衡，而且在一定程度上证明植物的抗寒能力越强，脯氨酸含量的变化越显著[26.]．酸沉淀会导致急性损伤叶，并且可以限制生长。因此，在该实验中，在A-D-F组中，脯氨酸含量比其他组更强烈地影响。

可溶性糖在植物的生长周期中起着重要的作用。有人指出，在盐胁迫下，植物可以积累大量的渗透调节因子，如可溶性糖和其他无机盐离子[27.]，可以降低细胞内的渗透势，增强细胞的吸水和持水能力，维持细胞生长，从而增强细胞的抗应激能力[28.那29.]．其结果是，在本研究中检测到的在幼苗可溶性糖含量呈上升趋势，这表明植物可以通过累积的可溶性糖[保护自己在不利条件下30.]．这可能是由于受低温胁迫的植物细胞液浓度增加，冰点降低，减少细胞过度脱水;因此，原生质胶体对低温诱导的凝固具有保护作用，增强了对低温胁迫的适应性[31.]．此外，A-D-F组的可溶性糖含量远高于对照组，这是由于更多的可溶性糖激活了植物的渗透压调节机制，以抵抗胁迫组合[32.]．

复合胁迫对叶绿素含量的影响

叶片中的色素被设计成吸收光能，为植物生长提供能量;因此，叶绿素含量对不利环境的响应可以反映光合作用的能力[25.那33.]．与该实验的结果一致，通过该实验的结果减少，Xin和浏览指出，低温是影响营养组织光合作用的主要因素之一[34.]．但其他胁迫因子对叶绿素及其他指标的影响也不同。周教授的研究结果表明，叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量等光合指标均可用于冬小麦胡杨叶片在NaCl胁迫下保持相对稳定[35.]，与本研究结果相似，A-F组、D-F组、A-D-F组间无显著差异。

以紫花苜蓿幼苗为试验材料，通过测定植物体内丙二醛、可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸和叶绿素含量，研究了紫花苜蓿对人工酸沉淀、除冰盐和冻融的响应。紫花苜蓿中MDA含量的积累表明细胞膜系统受到了破坏。此外，可溶性糖和脯氨酸含量的增加维持了渗透平衡，有助于植物抵御不利条件的损害。但在胁迫因子的组合下，植物叶绿素含量并没有发生规律性的变化。综上所述，冻融盐胁迫和除冰盐胁迫对植物的影响较大，而酸雨结合上述两种胁迫对植物的影响较小。

植物材料

由中国东北师范大学的生命科学提供约1000种Dongmu-70，浸泡在0.1％酸性KMno中_4.溶液浸泡2小时，然后用蒸馏水冲洗。然后将种子放置在托盘上，用两层滤纸覆盖，并加入100 ml霍格兰营养液。在mfc - 450bp光照培养箱(上海亿恒科学仪器有限公司)中，种子在20℃黑暗条件下萌发24 h后，选择饱满和大小相近的幼苗，置于长×宽26 × 18 cm的托盘上;23个株系×每株系40粒种子)，转入mmc - 450bp光培养箱(上海亿恒科学仪器有限公司)，光照12小时(16,500 lx;25°C)/12小时暗(0 lx;15°C)条件下1周。每天给予8毫升营养液-每天早晚40毫升。

压力应用

制备除冰盐溶液(0.1 M, 1000 ml)和酸沉淀溶液(pH = 4.5(硫酸:硝酸= 3:1)，1000 ml)。然后将幼苗平均分为8组:A-D-F, A-F, D-F, A-D, A, D, F和CK(表1)2）.Seven millilitres of acid precipitation solution and 18 ml of deicing salt solution were added to groups A-D-F and A-D, respectively, 7 ml of acid precipitation solution and 18 ml of distilled water were added to groups A and A-F, respectively, and 18 ml of deicing salt and 7 ml of distilled water were added to groups D and D-F, respectively. Twenty-five millilitres of distilled water was added to the F and CK groups. After the reagents were added, all the test group plants were placed in a light incubator under 12-h light (16,500 lx; 25 °C)/12-h dark (0 lx; 15 °C) conditions for 2 d and then were removed for the freeze-thaw treatment.

对A-D-F、D-F、A-F和F组进行冻融处理，并将幼苗放入BPHJ-120A高低温试验箱（上海亿恒科学仪器有限公司）进行为期14天的冻融循环 h、 恒温曲线包括10,5,0，− 5、0、5和10 摄氏度（2 ~ 14 h） BPHJ-120A高低温生长箱（上海一恒科学仪器有限公司）的初始温度为15℃ °C，夜间接近室温。温度稳定下降至− 5. 0.5℃时的温度 每12°C 最小值（约0.04 °C/min），然后温度从− 5至10 0.5℃时的温度 每12°C 最小值（约0.04 °C/min）。A-D组、D组、A组和CK组保存在MGC-450BP光照培养箱（上海亿恒科学仪器有限公司）中，光照条件稳定。在每个温度下，根据测量所需的量，从每个治疗组随机抽取9-D龄样品，即0.5 g用于测量丙二醛（MDA）和可溶性糖含量，0.1 g表示可溶性蛋白质含量，0.5 g表示脯氨酸含量。

生化特性

用硫代巴比妥酸（TBA）比色法测定丙二醛（MDA）和可溶性糖含量[36.].叶样本（0.5 g） 将其研磨成5%的匀浆 ml 10%三氯乙酸（TCA）溶液。在4000℃离心（上海安亭科学仪器厂TDL-40B） 每分钟10分钟 min，2 将ml上清液转移到试管中，并与2 ml 0.6%TBA溶液。混合物在沸水中浸泡15分钟 分钟，然后迅速冷却至室温。在450、532和600处的吸光度 然后使用UV-6100紫外-可见分光光度计（梅塔什有限公司）测量nm。

采用考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白含量[24.]．将叶（0.1g）研磨成与去离子水（5ml）的匀浆，随后将（TDL-40B，Snating Scientific仪器工厂，上海）以3000rpm离心10分钟。将一个毫升的上清液转移到试管中并用去离子水（4mL）稀释5次。将一毫升稀释的溶液与5毫升Coomassie辉煌的蓝色G-250（上海惠狮生物化学试剂有限公司）混合。2分钟后用UV-6100 uV-Vis分光光度计（Metash Co. Ltd）在2分钟后测量吸光度，通过标准曲线测定蛋白质含量[25.]．

脯氨酸含量用酸茚三酮比色方法测定[37.]．随后，将0.5 g样品在5 ml 3%磺基水杨酸溶液中研磨成匀浆。将混合物(TDL-40B，上海安亭科学仪器厂)在沸水浴中提取10分钟，冷却至室温，4000rpm离心10分钟。取2毫升上清，加入2毫升冰醋酸和3毫升显色剂(2.5%酸性茚三酮)。然后将混合物浸入沸水中40分钟。然后加入5 ml甲苯进行提取，在520 nm波长处测量吸光度。

用SPAD-502 Plus叶绿素仪(柯尼卡美能达公司)直接测定植物幼苗叶片中的叶绿素含量;一片叶子被测量了三次[38.]．

数据处理

采用spss16.0统计软件(IBM SPSS Statistics, USA)进行统计分析，采用单因素方差分析(ANOVA)，采用最小显著性差异(LSD)法进行多重比较。显著性水平为0.05，所有实验数据用Origin 8.0软件(OriginLab Corp.)绘制。实验重复三次，所有结果均以平均值±SEs表示。

本研究期间生成或分析的所有数据都包含在本发布的文章及其补充信息文件中。

MDA:

丙二醛

稍后通知:

硫代巴比妥酸

柠檬酸:

三氯乙酸

不适用。

基金资助:国家自然科学基金面上项目(No. 31772669)。资助机构没有参与研究的设计、数据的收集、分析和解释以及手稿的撰写。

隶属关系

1. 地下水资源和教育，新能源与环境，吉林大学学院，长春，130012中国部的环境实验室

   国羊宝，文义堂，邱瑞安，八鑫刘，嘉琪田，南赵舞朱

贡献

GB，WT和QA设计了实验;QA和YL的大部分实验;NZ表现了部分实验;JT和SZ分析了数据;和wt，nz和JT写了稿件。所有作者都同意稿件内容并提交。所有作者阅读并认可的终稿。

通讯作者

通信Guozhang保。

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版物

不适用。

利益争夺

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意事项

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。

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