揭秘菌核病的遗传基础头向日葵腐烂性

背景

菌核病sclerotiorum是一种导致向日葵菌核头腐病(SHR)的坏死营养真菌，流行病会导致严重的产量损失。在这项工作中，我们提出了一种关联作图(AM)的方法来研究栽培向日葵对SHR的自然抗性的遗传基础。向日葵是世界上种植最广泛的油料作物。

结果

我们的关联作图群体（AMP），它包括135个自交系育种品系（ILS），使用27个候选基因，9简单重复序列（SSR）预先用经由双向亲映射SHR抗性相关的标记物的一组，以及一组的基因型的位于基因与涉及应激反应分子功能384组的SNP。此外，考虑到性状的复杂性，我们评估了4个疾病描述符（即，发病率，疾病的严重程度，对疾病的发病率，并且潜伏期病情进展曲线下面积）。因此，这项工作是最为详尽的AM抗病性向日葵迄今为止已进行研究。

混合线性模型占人口结构和亲属关联被用于表型 - 基因型关联的统计分析，从而允许与疾病相关联降低13个标记的鉴定。有利的等位基因数呈负相关，发病率，疾病严重程度和区域发病率病情进展曲线下的相关性，而这是positevily相关的潜伏期。

结论

其中与SHR抗性相关的4个标记(HA1848, HaCOI_1, G33和G34)验证了之前的研究结果，而其他4个新标记(SNP117, SNP136, SNP44, SNP128)与SHR抗性一致，有望成为标记辅助育种的候选标记。从种质资源的角度来看，这5个携带抗病等位基因组合最多的ILs为全世界向日葵育种提供了宝贵的资源。

向日葵(向日葵L。）是世界上增长的第四种最广泛的油籽作物，年生产估计为3600万公吨（www.sunflowerns.com）。与其他植物油不同，葵花籽油总产量的约90％用于人类消费，只有10％用于生物柴油和工业应用[1，2，3.]．

菌核病sclerotiorum导致肠炎头腐（SHR），这是欧洲，阿根廷和美国向日葵种植区的主要疾病之一，具有流行病导致严重的产量损失[4]．这种坏死性子囊菌对农业造成了相当大的问题，因为它攻击400多种植物，包括许多重要的经济作物，如油菜籽、大豆和番茄。

安全性是一种复杂的特征，因为它由多基因结构控制（即，具有卓越的添加剂基因作用的定量遗传）并且具有中等的遗传性，受到不同环境条件的温度，湿度和降雨的不同环境影响[5，6，7，8，9]．在过去的二十年中，双重父母QTL映射的强化努力导致了CA的识别。用于安全性的50个定量性状基因座（QTL），具有在连杆组（LG）10中鉴定的最稳健的区域，其次是LGS 1和15 [7，9，10.，11.，12.，13.，14.]．然而，这些区域的大尺寸通常跨越五个或更多个厘米，这排除了个体基因的解剖，但是典型短发型方法的主要缺点之一。相比之下，依赖于使用多样化种质的关联映射（AM）可以提供更高分辨率，同时具有评估更广泛的自然变化的可能性，而不经常开发映射群体[15，16]．在AM的最早实现中，候选基因方法，基于对控制兴趣特征的途径的先验知识，主导文献。已经成功地应用了这些方法来研究向日葵抵抗力S. sclerotiorum.在这两个SHR [17]和茎腐[18]．最近，新的基因组工具使候选基因策略的演变成为基因组扫描，允许同时查询许多SNP。虽然许多基因组关联研究导致鉴定向日葵中与开花时间和工厂建筑有关的基因座[19，20.，21[尚未被利用，他们检测更多复杂性状的关联的权力，尚未被利用。在这种情况下，通过培养基到高通量技术使用更多数量的候选基因可以用作适合的踩踏石，以便对未来对真菌病原体的防御反应进行大规模探索。尽管物种的参考基因组的可用性[22]但仍然仍然了解与抗病抗性相关的基因的丰富和分布知识。根据Neupane等人。[23]，向日葵13号染色体，随后染色体9,4和2，包含核苷酸结合位点，富含亮氨酸的重复（NBS-LRR）的基因，其参与植物防御编码疾病抗性的蛋白质的最高数目。

本研究的目的是鉴定与SHR抗性相关的遗传变异。为此，我们扩展了最初的AM研究[17]包括较大的种质集，四种额外的田间试验，三种额外的抗性代理（即疾病严重程度，疾病发生率和潜伏期的疾病进化曲线）和420个新的应力相关分子标记。

候选基因筛选、SNP鉴定和基因分型

用于安全性的候选基因（CGS）选自四种不同的数据来源（表1,请参阅方法细节部分)。在作为核心集(CS)的8个向日葵ILs中，共有27个CGs适合进行扩增和直接测序，用于初始多态性发现。这些CGs每个个体包含16,441 bp的对齐序列(编码区9,760 bp，非编码区6,681 bp)。每个CG的片段大小在189 ~ 1762 bp之间，包括intrintrs。检查S表1显示在CS中总共有228个核苷酸变化，在27个CGs中评估的25个CGs中至少有一个多态性位置。平均snp /CG数为8.33，平均频率为1SNP/ 73 bp(不含插入)。同义替换(85)与非同义替换(50)之比为1.7。

27个CG的有20个成功分型的AMP：八一的羧基被的dHPLC（G22，G26，G30，G34，HACP，HaDRP，HaPAL和HaGLP3），两个通过酶促裂解（CEL1CH）（HeAn_315和HaGLP5），七基因型通过荧光毛细管电泳（G33，HaGLP4，HaTRP，HAWP，HaWRKY5，HaWRKY7，和HaRhoBp）和三个通过直接测序（HeAn_41021，HeAn_12562，和HaCOI_1）（表S =为代表1）.单倍型数量在2 ~ 8个之间，平均每个基因有3.29个单倍型。

从Filippi等人检索到的384-SNP向日葵寡糖池分析（SOPA）基质[22过滤过滤以除去单数症的标记，或显示超过10％的缺失数据，得到总共139个双等SNP。

最后，在AMP中成功扩增了先前与SHR抗性相关的九个SSR，从三到八个等位基因范围内，平均值为五个（表S.2）.

轻微的等位基因频率的滤波器(加)< 0.05应用作为CG和标记选择的最后一步,呈现168标记测试与疾病的发病率(DI),疾病发病率疾病进展曲线下的面积(AUDPCI), 168 (DS)和疾病严重程度潜伏期(IP):20个CGs, 384-SNPs SOPA的139个双等位SNPs和9个SSR。最终数据矩阵如表S所示3.．

amp - il基因结构、亲缘关系及与疾病反应的关系

贝叶斯群体结构和亲属关系分析基于Filippi等人使用的42个SSR [24]．135AMP ILS的人口结构估计与原作者报告的原作者为原始137 ILS [24]同样，AMP由三个不同的遗传群体组成，保持者/恢复者状态是与群体划分相关的最普遍特征（表S）4)。分配给特定人群的个体（即推断祖先高于0.70的个体）的百分比为68.15%。

根据所有个体对之间共享等位基因的数量估计的遗传距离矩阵D如表S所示5，而派生的分层聚类树形图在图1中示出1．基于所述赤池信息量准则（AIC），我们确定了所需的亲属结构建模（图S60中嵌套随机效应1红线)。

关于表型数据，评估的135AMP-ILS（DI），（AUDPCI）和（DS）和（IP）在所有疾病描述符中表现出大量变化，排名与Filippi等人报告的排名相似。[24]对于137 ILS的原始面板（表S4）.

在基于标准化的SHR-表型变量的遗传距离估计和欧几里德距离之间没有观察到显着相关性（R.²= 0.028;壁炉架测试,P.= 0.18)。此外，在结构推断的祖先和shri表型变量之间没有观察到显著的相关性(表S6）.此外，对于由结构推导出的三组SHR-表型变量的调整装置的箱形图的目视检查表明组间图无明显差异（。1)经方差分析（DI，P. = 0.5771; AUDPCI,P. = 0.8159; DS,P. = 0.2428; IP,P. = 0.7178).

关联分析

测试的四个AM模型几乎是等效的，即它们在观测和预期之间显示出相似的形状和均方差异(MSD)P-值（在没有标记效应的假设下）（图S2和表S.7）.

在QK模型下(包括群体(Q)和亲属关系结构(K))， 86个与SHR抗性相关的标记经过多次检测校正(P. < 0.05) (Table S8)考虑到q值阈值为0.2，统计上显著的标记-性状关联数减少到53（DI为32，AUDPCI为6，DS为12，IP为3；P. < 0.05;核反应能量< 0.2，表S8).采用更严格的标准(P.≤0.01,核反应能量 < 0.20), a total of 23 marker-trait associations were detected (nine for DI, six for AUDPCI, five for DS and three for IP), encompassing 13 different genes (Table2）.标记物SNP117，HACOI_1，HA1848和SNP136与三个SHR-表型变量有关;SNP144和SNP128与两个变量相关;虽然G33，G34，SNP125，SNP80，SNP60，SNP23和SNP44与单个变量相关联。每个标记解释的变异百分比平均为13.98％，范围从6.79到25.31％（表S8）.标记物SNP117，HacoI_1和HA1848显示出与抗病抗性最显着的关联（P. < 0.01,问：-价值<0.10）。

13个相关基因（P.≤0.01,核反应能量 < 0.2) were mapped against the sunflower reference genome and localised on chromosomes 2, 6, 7, 9, 10, 14, and 15. The GO-terms of the genes harbouring the associated markers are detailed in Table2．此外，我们还调查了所有相关标记的上游和下游位于±1 MB侧翼区域的所有基因的注释，以便构建可参与SHR抗性的所有基因的目录。在这些区域内鉴定了总共124个基因，其范围为每种关联标记的一至39个。在表S中给出了与关联标记的描述和距离9．

为了研究相关标记的变化模式，我们根据有利等位基因的数量排名ILS（表S4）.排在前4位的ILs分别为51084/C820、RHA801、HA441和51084，有利等位基因数为11 ~ 9个(表)3.）.对于这些盲降，DI、DS和AUDPCI的调整平均值在所有情况下都在前四分位数内(DI的IL 51084/C820和DS的IL 51084/C820和RHA801除外)，而IP值在最后四分位数内，即最具抗性。这些细菌在田间试验中也显示出持续的抗性水平。与这些发现一致的是，DI、AUDPCI、DS与有利等位基因数量(Spearman、P.< 0.01，表S10.），虽然观察到IP和有利等位基因数量的正相关（Spearman，P.< 0.01，表S10.）.

菌核病sclerotiorum抗性是一种复杂的性状，中遗传到低遗传性和大部分未知的遗传基础．在本研究中，以135个向日葵ILs为研究对象，对参与SHR抗性的基因进行了AM研究。尽管全基因组方法受到越来越多的关注，CG AM仍然是一种探索表型-基因型关联的强大策略。仔细选择CGs可以大大提高成功率，特别是在对感兴趣特征的分子机制知之甚少的情况下。在这里，我们使用不同的信息源作为起点，检测了13个与SHR抗性相关的标记。不像以前的AM方法对SHR的研究，从8到16个CGs [17，18],我们评估27厘米克秒,九个小组SSRs之前与月阻力通过bi-parental映射和一组384个snp位于生物和非生物胁迫响应相关的基因,如过敏的反应,茉莉酸和生长素信号通路介导的氧化应激反应,钙相关的基因,类芽胞蛋白等[9]．此外，特征的复杂性导致我们得分四种疾病描述符，使这项研究迄今为止迄今为止迄今为华的抗病性抗病抗性。

了解人口结构对兴趣特质的影响至关重要，避免了避免在AM研究中的虚假协会。如果人口结构占变差太大，则结构化关联分析将具有低功率来检测个别标记的效果[25]．在我们的AMP中，既没有发现基于shri表型变量的欧氏距离与遗传距离矩阵之间的相关性，也没有发现个体变量与贝叶斯分析的分配分数之间的相关性。这表明群体结构对标记-性状关联的检测影响不大。

在映射研究中的另一个关键方面是包含在亚群内和之间的个体内部和之间的相关性的衡量标准，作为由谱系记录或基于标记的亲属估计计算的共训练系数[26]．亲属关系结构意味着在统计模型框架内观察到的相关结构。将亲属关系结构建模为一组嵌套的随机因素，正如我们在这里所做的，是将亲属关系矩阵作为白细胞介素随机效应的相关矩阵纳入的另一种方法。这种方法允许使用标准统计软件进行混合模型拟合。

为了检验相关性，我们首先应用了naïve方法，该方法不包括对ILs之间相关性水平或结构的任何校正(模型)SM）.观察到的与预期的曲线P.-值(在无标记效应假设下)及两者之间的均方差[26，显示了考虑到人口结构(模型问）没有有助于明确减少显着的标志性状协会的数量（P. < 0.05). The same result was obtained by including the kinship structure (modelK)和结构的来源(模型QK.)这些结果与SHR表型变量均未显示与潜在群体结构相关的事实相一致，从而最大限度地降低了标记性状协方差产生虚假关联的风险[27]．

一个问：-计算了整个数据集的值P.-值建立合理的虚假发现率[28，29]．三个标记，HA1848，HACOI_I和SNP117分别位于染色体7,10和14中，具有最重要的疾病抗性关联（P.< 0.01;问：-价值< 0.10)。此外，这些标记都与四个SHR表型变量中的三个相关。其中两个相关标记验证了之前的双亲本定位研究sclerotinia.向日葵的抗性[9]．据报道，SSR标记HA1848与QTL共定为SHR DI的QTL [9]而CG HaCOI_1似乎与sclerotinia.茎腐蚀性[18]．HaCOI_1 CG与拟南芥蒂利亚纳COI1基因编码茉莉酸(JA)信号通路所必需的富含亮氨酸重复序列(LRR)蛋白。JA在植物抵御生物和非生物胁迫中起着关键作用[30.]．事实上，坏死性真菌病原体，比如S. sclerotiorum.，被认为是通过COI1受体作为ja依赖防御的主要激活物[31]．

含有SNP117的基因被归为GO类黄体酮5β-还原酶（P5βR）．尽管是在动物中首先描述的家庭，但刺激（孕酮5β- REDUCTEAS酶和/或虹膜合酶样1,4-烯烃还原酶）在植物中普遍存在，并且在许多物种中涉及Cardenolide和虹膜生物合成[32]．具有这些酶但不产生心胸素或虹膜的物种的发生可能表明在活性羰基化合物的清除和解毒中具有更大的作用[32]．谈到这项提案，该家族的成员对非生物和机械压力源敏感，它们的表达受到过乙烯和过氧化氢的调节33]．

在不太严格的阈值（P. ≤ 0.01; 0.10 < 核反应能量 < 0.20), ten additional markers, distributed across eight different chromosomes were associated with resistance. The orthologs of two of these genes, G33 and G34, were previously identified as differentially expressed in response tosclerotinia.感染甘蓝型油菜[34]．G34编码ABC转运并具有农业重要性的几个已知的功能，具有解毒和生长素运输是最重要的之一[35]．辅助介导的信号传导不仅与植物的生长和发育有关，还与病原体抗性有关，主要针对Necrofophic真菌[36，37]．

G33编码一个自由基SAM超家族的成员，该家族包含超过100,000种同源酶，催化生命所需的广泛反应[38]，包括抗病能力[39]．

的remaining eight markers include a germin-like protein (GLP, SNP128), a β-hexosaminidase (SNP136), a putative rho-associated protein kinase (SNP23), and five genes with diverse annotations (i.e. Tyrosine transaminase, Embryonic flower 2, Xylulose kinase, Serine-threonine/tyrosine kinase, GRAS family transcription factor). Germins and GLPs are encoded by gene families with multiple members, and a wealth of evidence supports their involvement in plant defense. Many germins possess oxalate oxidase (OXO) activity, i.e. can degrade oxalic acid to H₂O₂和co.₂[40，41.]，而Glps显示超氧化物歧化酶（SOD），磷酸二酯酶，多酚氧化酶，蛋白酶抑制或蛋白水解活性[42.]．特别是S. sclerotiorum.，Rietz等人。[43.报告了GLP在辩护响应中的作用B. Napus.对抗病原体。最近，向日葵Haglp1的过度表达A. Thaliana.也能促进活性氧(ROS)的积累，增强对S. sclerotiorum.和Rhizoctonia solani.[44.]．

SNP136标记特别有趣，因为它属于β-n乙酰氨基催化壳多糖寡糖的水解。甲壳素（β-1,4-联n -乙酰氨基葡萄糖聚合物)通常存在于真菌细胞壁，其片段被认为在植物防御中作为有效的激发子信号[45.]．

Fusari等人。[17]发现一个假定的Rop相互作用的含有蛋白质的婴儿床基序（rhoBP_B//RIC）的一个等位基因与SHR DI的降低相关。这种关联在我们的AMP中无法评估，因为有益的等位基因频率非常低(< 然而，我们能够确定另一种与SHR耐药性增加相关的假定Rho相关蛋白激酶（SNP23），进一步表明该家族在防御过程中发挥作用。

QTL的因果多态性可能与被研究的标记相距很远，特别是在连锁不平衡水平高的物种中，如向日葵[20.，46.，47.]．符合此概念，我们工作中发现的几个相关标记显示出导致同义替换的等位基因差异。最近可用的向日葵基因组的开采[22]确定了相当多有前途的候选人供今后评价。与防御过程相关的基因位于相关标记附近，包括蛋白磷酸酶2C、核苷酸结合位点-富亮氨酸重复序列(NBS-LRR) R蛋白、乙酰转移酶、GRAS蛋白和各种glp。总之，我们生成了124个可能参与SHR抗性过程的候选基因的目录。

总体而言，我们发现，与ARR抗性相关的大多数基因都具有涉及ROS和JA介导的信号通路的积累和降解的分子功能，这是植物 - 病原体相互作用中的主要方法。与这些发现一致，Na等人。[48.]报告抗性向日葵品种中涉及SA和JA途径的标记基因的高记录性丰度，致力于病原体S. sclerotiorum.．此外，H₂O₂水平和ROS清除剂酶活性也增加，以及在细胞壁和可溶性蛋白质含量上的调用沉积。

基因分型成本的不断降低，表型分型努力成为最关键的问题为AM接近。虽然四个检查表型变量之间观察到高度相关性[6[只有几个关联，只有一种疾病描述符，暗示，尽管有一些重叠，但所有这些都对抗不同方面的洞察力。在统计分析的结果方面，AMP的ILS中相关标志物的有利等位基因的分布与其血统和现场试验中的前提行为一致。在DI，AUDPCI，DS和良好等位基因之间发现显着和负相关性，而IP和有利等位基因的数量观察到阳性相关性，这表明具有较高数量有利等位基因的IL往往具有更低的DI，AUDPCI和DS虽然是最长的IP。实际上，最多有利的紫杉鸟对应于ILS，其横跨生长季节的稳定反应[6]并在DI，DS，Audpci和IP值方面排名最具抵抗力。此外，最近的场景观察表明，这些ILS也具有增强的头部和茎溃疡造成的抗性向日葵(Corro Molas A.， pers。通讯)。总之，我们的研究结果突出表明，采用和应用适度数量的标记与之前的基因组信息相结合的策略，如CG-association mapping，可以识别与农艺重要性状相关的强基因组信号，即使是遗传力较低的性状，如SHR抗性。在这方面，这项工作为向日葵抗SHR基因的特性提供了初步的线索，同时有助于作物改良的标记辅助育种。

本研究中鉴定的四个SHR抗性相关标记HA1848, HaCOI_1, G33和G34验证了之前的研究，并有望成为标记辅助育种的候选标记。此外，我们的工作使新的标记，如SNP117, SNP136, SNP144和SNP128，能够通过使用不同的疾病描述确定与SHR抗性相关的标记。目前正在进行进一步的研究，以确认它们利用诱变人群对耐药性的影响。从种质资源的角度看，抗性等位基因组合最多的向日葵属植物也为世界向日葵育种提供了宝贵的资源。

植物材料和表型数据来源

向日葵关联作图群体这里使用（AMP）的发展在菲利皮巴莱等进行说明。[24]．简单地说，阿根廷国家农业研究所(INTA)的向日葵育种家选择了137个栽培向日葵自交系(ILs)，并保存在INTA Manfredi的活性种质库(BAG-IM)。所有的ILs都是在机构和国家指导方针下获得的育种资源(见Filippi等人[24]，以了解植物原料的来源详情)。利用42个SSR标记和384个SNPs对这些ILs进行了遗传多样性分析，结果表明，我们的AMP显示了栽培向日葵基因库中较高比例的等位基因多样性[24]．

原137 AMP il对S. sclerotiorum.通过菲利皮巴莱等人评估。[62009 - 2014年在阿根廷布宜诺斯艾利斯Balcarce实验站(37°50 ' 0″S, 58°15 ' 33″W)连续5次田间试验(FTs)。FTs采用两个区组的随机完全区组设计。用于替代SHR抗性的变量为疾病发病率(DI)、疾病严重程度(DS)、疾病进展曲线下疾病发病率的面积(AUDPCI)和潜伏期(IP)。

Filippi等人对所有shri表型变量调整平均估计相关的实验场地设计、真菌分离、接种剂制备和统计方法进行了完整的描述[6]．

在本研究中，由于其中2个AMP IL被污染，AMP IL的数量减少到135个，因此我们对这一减少的IL群体进行了重复的遗传和表型统计分析，以获得具体值。种子由INTA Manfredi活性种质库提供。

DNA提取和基因分型

按照制造商的说明，使用NucleoSpin Plant II试剂盒(machery - nagel，德国)从三个IL个体的叶子组织中提取总DNA。使用电泳分析和Picogreen®技术(Invitrogen公司，圣地亚哥，CA)评估基因组DNA的质量和浓度。

三种类型的分子标记物被用来试验用于与SHR电阻关联：1）的PCR扩增子：从Zhao等选择27个候选基因（CGS）的面板。[34]，Ehrenbolger等人[49.]，Fusari等人[17]和Talukder等。[18)(表1）;2) SNPs:来自自定义Illumina Oligo Pool Assay的384个SNPs(向日葵Oligo Pool Assay, SOPA， [9，24]）;3）SSRS：通过向日葵中的双父母QTL映射最近与ShR阻力相关的一组9个SSR标记[9]．

PCR扩增子

桌子1提供有关CGs和用于扩增的引物的一般信息。对于从转录分析中选择的CGsA. Thaliana.回应S. sclerotiorum.[34[我们首先使用Fusari等人的系统发育方法。[17]鉴定向日葵中相应的正非基因。我们对所有CG的多态性评估进行了初步步骤，因为不可用多样性水平的知识。27cgs的直接Sanger测序在八根近红细的核心组（Cs）中进行，以鉴定单倍型并选择放大器的最佳基因分型方法。模拟退火算法，在软件PowerMarker V. 3.51 [50.]（Liu＆Muse 2005），用于CS施工，1000分复制分析[51.]．CS包括ILs 2091、2121、51084/5429、B99、C154B、C625U、R419和R449。如Fusari等人所述，使用变性高压液相色谱(dHPLC)或CEL1内切酶进行基因分型。[52.]．片段大小不同的单倍型通过荧光毛细管电泳（FCE）进行基因分型。最后，通过直接测序，具有两种以上单倍型的CGS是基因分型。如Fusari等人所述进行所有测序反应和分析。[46.]．

向日葵寡核苷酸池分析(SOPA)

384 Illumina SOPA的设计目标是in-silicoest数据库的搜索重点是与应激反应相关的分子功能基因组区域[9]．在阵列上的384个SNP的初始面板中，在我们的放大器中发现182个是可变的[24]，139通过用于本研究的次要等位基因频率过滤器。AMP的SNP多态性数据可用于Filippi等。[24]．

SSR标记

从法国公共ILs PAC2 x RHA266杂交衍生的双亲本向日葵群体的SHR抗性QTL定位研究中筛选出9个SSR标记[9]．如Filippi等人所述进行基因分型。[24]．表S中给出了SSR标记的一般特征2．

人口结构与相关性

如前所述，由于与我们之前的分析相比，由于ILS的数量的减少，使用结构中实施的贝叶斯方法重新估计人口结构[53.[基于Filippi等人的42 SSR。[24]．还测试了两种SSR（HA77和HA1848），用于表型基因型关联。

亲属关系结构(K)被建模为一组嵌套的随机效应。为此，我们从上述42个SSR中生成共享等位基因比例矩阵(S)，作为距离矩阵估计的输入\（d = \ SQRT {1-S} \）．凝聚的均质集群是用的病房。D聚集方法。在不同的水平（节点）下切割得到的树状图，结果，将ILS分组成2至134个簇。Akaike信息标准用于确定模拟血缘关系结构所需的最佳分组因子数。

为了评估疾病反应和AMP遗传结构之间的关系，我们进行了Mantel检验，比较了基于表型变量标准化调整平均值的欧几里德距离矩阵和遗传距离矩阵D。此外，我们还进行了疾病反应变量和遗传距离矩阵D之间的相关性分析d每个自交系的结构祖先系数。最后，使用单向方差分析测试结构簇之间疾病反应变量的显著差异；当推断祖先> 0.70.

协会映射

根据Stich等人所描述的两步方法进行统计分析[26]．简单地说，它的目的是在考虑年份、接种日期和试验设计的小区结构的影响下，获得每一IL的调整手段。在第二步中，使用从第一步得到的调整后的均值作为响应变量，每次对一个标记点进行拟合。我们考虑了以下四个模型:

1. 1）

   一个简单的线性模型（SM），它仅包括标记的固定效果（米_一世），在假设错误的独立性之下。

1. 2）

   的问模型，其通过将群体结构包括与结构祖先分配矩阵对应的一组回归变量，扩展了广义线性模型（GLM）问．

1. 3）

   的K模型，它不包括人口结构，而是一系列由该术语代表的嵌套随机因子Zk,在那里Z.关联矩阵和K.是一个随机效果矢量（参见上一节中的亲属结构的表示）。

1. 4）

   该模型QK.，包括人口和亲属关系结构。

使用Spearman的等级相关性估计ShR-表型变量和有利等位基因数量的相关性。

R环境[54.]用于大多数统计分析。图书馆LME4.[55.]用于模型拟合。这个函数hclust用方法Ward.d.应用聚类分析，函数娇嫩用于切割生成用于建立亲缘关系模型的分组因素的树状图。利用InfoStat进行补充统计分析[56.]和infogen [57.]．

使用QValue封装确定假发现率（FDR）阈值[58.]和A.核反应能量如Iquira等人所建议的，截止为0.2。[28]．

相关标记的注释和基因组背景

鉴于我们的大多数SNP标记位于CGS中，我们检索了使用BLASTN搜索的相关标记的基因的注释进行针对参考基因组Helianthus Annuus.（可用的http://www.heliagene.org).我们还搜索了相关标记周围的基因。以确保物理连锁[47.]，我们从兴趣标记扫描到±1兆峰（XRQ版本1.0，[22])。

本研究中产生或分析的所有数据均包含在本文[及其补充信息文件]中。序列数据可在GenBank获得:MT593377至MT593867。可根据要求提供与中间统计处理步骤相关的其他信息。

AMP:

协会映射人口

AUDPCI:

疾病发生率疾病进展曲线下的面积

CGS：

候选基因

CS：

芯组

迪:

疾病发病率

DS：

疾病严重程度

FCE考试:

荧光毛细管电泳

ILS：

自交系

IP：

潜伏期

月:

Sclerotinia头腐烂

SOPA:

向日葵oligo池测定

我们感谢胡安·何塞·费雷拉·费尔南德斯博士和三个匿名评审，其意见和建议，极大地提高了我们的手稿。我们也感谢西尔维娅Pietrokovsky博士亲切修改草稿的英语。

该研究得到了庭院Nacional deTecnologíaAgropecuaria（Pnbio-1131042,1131043）和Agencia Nacional dePromociónCientíficaYTécnica（Pict2011 1365）。这些补助金用于涵盖基因分型和表型实验的成本。

作者指出

1. N. B.Paniego和V.V. Lia同样为这项工作进行了贡献。

隶属关系

1. 生物技术研究所、兽医和农业科学研究中心（CICVyA）、国家农业技术研究所（INTA）；农业生物技术和生物分子研究所（IABIMO），INTA-CONICET Nicolas Repetto y Los Reseros s/n（1686），阿根廷布宜诺斯艾利斯赫尔林厄姆

   C. V.Filippi，J.E.Zubrzycki，A.F.Puebla，H. E.Hopp，R. A. Heinz，N.B.Paniego＆V.L.LIA

2. 阿根廷国家调查委员会Científicas y Técnicas-CONICET, Ciudad Autónoma de Buenos Aires

   C. V.Filippi，R. A. Heinz，N.B.Paniego＆V.L.LIA

3. 现任地址：阿根廷布宜诺斯艾利斯圣马丁生物科技公司

   J. E. Zubrzycki

4. 法国国立大学农产学院。Felix Aldo Marrone 746 (5000)， Córdoba，阿根廷

   迪里恩佐

5. Estación实验Agropecuaria Inta Balcarce，Ruta 226公里73.5（7620），Balcarce，布宜诺斯艾利斯，阿根廷

   F. J. Quiroz, C. A. Maringolo & A. R. Escande

6. Estación实验Agropecuaria Inta Manfredi，Ruta 9公里636（5988），Manfredi，Córdoba，阿根廷

   d·阿尔瓦雷斯

7. 布宜诺斯艾利斯大学科学与自然科学学院，阿根廷布宜诺斯艾利斯自治城市Güiraldes 2160（1428）管理学院

   H. E. Hopp, R. A. Heinz & V. V. Lia

贡献

CVF进行DNA提取和基因分型试验。CVF、JADR和VVL对数据进行分析和解释。CVF, VVL和NBP起草和编辑了手稿。VVL和NBP构思和设计了这项研究。DA对拟纳入研究的材料进行筛选，协调种子增殖和样本采集。JEZ和AFP为SNP OPA检测提供了技术支持(Illumina BeadXpress)。HEH、RAH、EAR、FJQ和CAM发起了该项目，并通过对数据的解释和讨论对工作做出了贡献。所有作者审查并批准了最终的手稿。

通讯作者

对应到V. L. Lia.．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版物

不适用。

相互竞争的利益

提交人声明他们没有竞争利益。

出版商的注意事项

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