SMRT和Illumina RNA测序揭示了高羊茅热应激反应和叶片衰老的相互影响的新见解gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

作为一种冷季草，高羊茅(gydF4y2BaFestuca arundinacea.gydF4y2Ba)受到气温升高的挑战。热驯化或激活叶片衰老是高羊茅遭受热胁迫的两种主要策略。然而，由于缺乏基因组序列，六倍体性质的复杂性，以及二代测序的短读，阻碍了对其机制的全面理解。本研究旨在从转录和转录后水平研究热适应和热诱导衰老的分子机制。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

Transcriptome of heat-treated (1 h and 72 h) and senescent leaves of tall fescue were generated by combining single-molecular real-time and Illumina sequencing. In total, 4076; 6917, and 11,918 differentially expressed genes (DEGs) were induced by short- and long-term heat stress (HS), and senescence, respectively. Venn and bioinformatics analyses of DEGs showed that short-term HS strongly activated热休克蛋白gydF4y2Ba（gydF4y2Ba热休克gydF4y2Ba）和gydF4y2Ba热休克因子gydF4y2Ba（gydF4y2BahsfgydF4y2Ba），以及特异性地活化gydF4y2BaFK506-binding蛋白质gydF4y2Ba（gydF4y2BaFKBPS.gydF4y2Ba)、钙信号基因、谷胱甘肽s-转移酶基因、光合作用相关基因、植物激素信号基因。与此相反，长期HS与衰老的大多数deg共享，包括上调的叶绿素分解代谢基因、植物激素合成/降解基因、胁迫相关基因和衰老相关基因gydF4y2Ba北亚gydF4y2Ba和下调的光合作用相关基因，gydF4y2BaFKBPS.gydF4y2Ba，和gydF4y2Ba过氧化氢酶gydF4y2Ba．随后，烟草中的瞬时过度表达显示gydF4y2BaFaHsfA2agydF4y2Ba（由短期HS特别上调）由HS引起的细胞膜损坏降低，但是gydF4y2BaFANAC029.gydF4y2Ba和gydF4y2BaFaNAM-B1gydF4y2Ba（长期HS和衰老上调）提高了赔偿。此外，选择性剪接在HS和衰老应答基因，包括人们普遍观察gydF4y2Ba热休克gydF4y2Ba，gydF4y2BahsfgydF4y2Ba和植物激素信号/合成基因。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

短期HS可以刺激基因反应并改善热能，但长期HS是损伤，并且可以加速叶片衰老。这些结果有助于我们了解热适应和热诱导的衰老的分子机制。gydF4y2Ba

高羊茅（gydF4y2BaFestuca arundinacea.gydF4y2Ba)是世界上最重要和应用最广泛的冷季草坪草和饲料品种之一[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．高羊茅的最适生长温度为15 ~ 25℃。高温会影响其生长发育[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．热损害的主要症状之一是叶片过早衰老。草坪草叶片衰老不仅会影响牧草产量，而且会影响草坪的美观品质，因此草坪草叶片衰老是草坪草的重要问题。但由于全球气温升高，夏季超过35°C的极端高温现象更为频繁和广泛。热应激(HS)是高羊茅的主要威胁。gydF4y2Ba

作为固着生物，植物不得不开发不同的系统，以防止由高温的损害[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．热激蛋白(heat shock proteins, Hsps)的诱导，包括Hsp100s、Hsp90s、Hsp70s、Hsp60s以及热胁迫转录因子(heat stress transcription factors, Hsfs)控制下的小热激蛋白(small Hsps)，已被报道在植物的热胁迫反应(heat stress response, HSR)和获得性耐热性中发挥关键作用[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．在gydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳gydF4y2Ba， HS在hsfa1依赖或独立通路中的复杂转录网络已被阐明[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．活性氧物质（ROS）清除酶和植物激素也显示参与热应激反应[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．然而，对高铁期间监管网络的研究主要集中在模型工厂gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba和番茄。对于高羊茅，转录分析的研究多为全基因组或某些基因家族表达谱。的表达水平gydF4y2BaFaHsfsgydF4y2Ba,特别是gydF4y2BaFaHsfA2sgydF4y2Ba的目标基因gydF4y2BaFaHsfsgydF4y2Ba，包括gydF4y2Ba热休克gydF4y2Ba，gydF4y2Ba抗坏血酸过氧化物酶gydF4y2Ba（gydF4y2BaAPX型gydF4y2Ba），gydF4y2Bainositol-3-phosphate合酶gydF4y2Ba（gydF4y2BaIPS.gydF4y2Ba),gydF4y2Bagalactinol合酶gydF4y2Ba（gydF4y2BaGOLS1gydF4y2Ba）HS显着上调[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．此外，参与细胞分裂、细胞周期、细胞维持、光合作用、蛋白质合成、信号转导、代谢、激素代谢以及DNA、RNA和蛋白质降解的基因在耐热性相反或不同热处理的高羊茅中对HS有显著的响应[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．但是，由于复杂的基因组背景和难以开发转基因系统，功能分析gydF4y2BahsfgydF4y2Ba，gydF4y2Ba热休克gydF4y2Ba或高羊茅中与热相关的基因很少被报道[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．只有一个gydF4y2BaFaHsfA2cgydF4y2Ba结果表明，通过激活gydF4y2Ba热休克gydF4y2Ba［gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．虽然近年来高铁在高羊茅上的研究不断取得进展，但高羊茅短期高铁与长期高铁的相似性和差异性尚不清楚。gydF4y2Ba

冷季牧草叶片热致衰老作为热害的主要症状，受到广泛关注。热诱导的叶衰老与乙烯和脱落酸(ABA)呈正相关，与细胞分裂素合成负相关，可通过细胞分裂素合成基因的转化而被抑制gydF4y2BaIPT.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．代谢和蛋白质分析表明，某些酸、蔗糖和单糖、光合作用中的蛋白质和氨基酸代谢的含量与细胞分裂素和乙烯抑制剂缓解热诱导的衰老有关[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．然而，这些研究都是在Bentgrass中进行的，在转录水平上热胁迫反应与高羊茅叶片衰老之间的关系尚不清楚。gydF4y2Ba

除了转录变化外，由选择性剪接(AS)产生的转录后变化也在HSR和衰老中发挥重要作用[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．hs诱导的AS已被证实为三者的共同特征gydF4y2BahsfgydF4y2Bain.gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．HS的转录后调控gydF4y2BaHsfA2gydF4y2Ba通过。然而，关于AS在高羊茅热应激反应中的作用还没有研究。此外，AS在衰老反应中的作用目前仅在动物和人类中进行了研究，在植物中还未进行过研究。因此，AS对HS和HS诱导的高羊茅衰老的全基因组响应值得探讨。gydF4y2Ba

高羊茅是一种六倍体(2n = 42, PPG1G1G2G2)，基因组大小约550万Kb。P基因组来自gydF4y2Baf . pratensisgydF4y2BaG1G2基因组来自gydF4y2Baf .季gydF4y2Ba变青光眼auct [gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．Illumina测序的基因组结构高度复杂，缺乏参考基因组序列，且阅读长度较短，这对利用第二代测序技术探索高羊茅的HS和衰老反应提出了很大的挑战。单分子实时测序(SMRT)可以产生全长转录本并直接构建参考ungenes，而无需进一步组装，从而解决这些困难[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．此外，SMRT测序技术可以更准确地识别AS产生的其他亚型[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．本研究旨在研究高羊茅短期与长期高羊茅叶片衰老的相似性与差异性，并从转录和转录后水平探讨高羊茅叶片衰老与高羊茅叶片衰老的关系。因此，太平洋生物科学(PacBio) SMRT和基于illumina的' hound 5 '转录组测序在对照(Con)、热处理1h (HT_1h)、热处理72h (HT_72h)和自然衰老(Sen)条件下进行。本研究结果有助于阐明高羊茅高温抗寒和热加速叶片衰老的潜在机制，并为深入研究高羊茅耐热育种候选基因提供重要线索。gydF4y2Ba

热应激和衰老对生理指标的影响gydF4y2Ba

为了确定热应激和衰老引起的生理变化，分别在正常、短期HS、长期HS和自然衰老条件下测定电解质渗漏(EL)和Fv/Fm(图)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.EL表示细胞膜损伤。如预期的那样，EL随热处理时间的增加而增加。衰老叶片的EL也显著高于对照绿叶。Fv/Fm反映了光系统II (PSII)光化学的最大量子效率。经过长期热处理，Fv/Fm显著降低。衰老叶片Fv/Fm显著降低。gydF4y2Ba

全长度转录组的全局描述gydF4y2Ba

To comprehensively investigate variation in expression of genes responsive to HS and senescence in tall fescue, we sequenced 12 mRNA samples from leaves of ‘Houndog 5’ at different developmental stages or under different times of HS treatments using Illumina HiSeq platform (second-generation sequencing). To obtain a more comprehensive reference transcriptome in absence of a reference genome of tall fescue, full-length mRNA sequencing of mixed tall fescue RNA derived from above 12 mRNA samples was conducted on the PacBio RSII platform (Fig.2gydF4y2Ba）.总共318932聚合酶的读取产生（PRJNA647166）。After filtering adaptors and low-quality reads (less than 50 bp), 11,961,314 subreads with a mean length of 1355 bp were obtained. Then, all the subreads were processed into 286,049 circular consensus sequences (CCS) reads to further improve the data quality. Depending on whether 5′ primer, 3′ primer, and poly (A) sequences were detected, 235,889 full-length non-chimeric reads (FLNCs) were extracted from the CCS reads. These FLNCs were subsequently corrected using Iterative Clustering for Error Correction (ICE), LoRDEC and CD-HIT to eliminate up to 99.99% of sequencing errors. Finally, 62,443 unigenes with an average length of 2595 bp, N90 of 1282 bp were successfully identified, and 23,310 of the unigenes were longer than 3000 bp.

利用非冗余蛋白序列数据库(Nr)、核苷酸序列数据库(Nt)、Pfam、同源组蛋白簇(KOG/COG)、Swiss-prot、京都基因和基因组百科全书(KEGG)和基因本体论(GO)。在至少一个数据库中成功注释的unigenes共有55075个(88.20%)，在所有7个数据库中成功注释的unigenes共有19677个(31.51%)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

对于GO分析（附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)、涉及“代谢过程”(15300)、“细胞过程”(14564)和“单生物过程”(8587)的基因在生物过程中具有高度代表性。在细胞组分类别中，‘cell’(5842)、‘cell part’(5842)和‘organelle’(3875)富集程度较高。在分子功能范畴内，主要的子范畴是“结合”(19,433)、“催化活性”(14,076)和“转运活性”(1583)。gydF4y2Ba

用于KOG分析(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，共32,982个富集的unigenes被分为26个组。最大的一组是“仅一般性功能预测”(7157)，其次是“翻译后修饰、蛋白质转换、伴侣”(6310)和“信号转导机制”(3536)。gydF4y2Ba

用于Kegg分析（附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)， 50,614个unigenes被分为六个主要的生化途径:“细胞过程”、“环境信息处理”、“遗传信息处理”、“代谢”、“有机体系统”和“人类疾病”。在代谢途径中，“能量代谢”、“碳水化合物代谢”和“全局概览图”得到了突出的体现。与“有机体系统”相关的途径包括“内分泌系统”、“免疫系统”、“衰老”和“环境适应”。所有功能注释都为分析HSR和衰老的过程和途径提供了重要信息。gydF4y2Ba

热胁迫反应和衰老中的可变剪接分析gydF4y2Ba

PacBio测序最重要的特征之一是识别AS的能力。由于没有高羊茅的参考基因组信息，我们利用COGENT将非冗余转录本划分为假定的基因家族，并将每个家族重建为一个或几个全长UniTransModels，以进一步进行AS分析。在62443份转录本中，COGENT构建了6297个具有两种或两种以上亚型的基因家族。通过剪接分析，共鉴定出3537个AS基因，共产生8312个亚型。然后，用SUPPA检测了298个AS事件，包括跳跃外显子(SE)、互斥外显子(MX)、5 '可变剪接位点(A5)、3 '可变剪接位点(A3)、保留内含子(RI)、第一外显子(AF)和最后外显子(AL)。在高羊茅中，RI是最丰富的AS事件，其次是A3(图3)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa).随后分析AS事件的差分表达式。在HT_1h vs Con、HT_72h vs Con和Sen vs Con中分别鉴定出42、65和43个差异表达的AS事件(DEASE)(图)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab）。gydF4y2Ba

HS和衰老过程中差异表达基因及亚型分析gydF4y2Ba

通过HT_1h与Con、HT_72h与Con、Sen与Con的比较，发现差异基因至少有2倍的差异gydF4y2BapgydF4y2Ba-value小于0.05(|日志gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba|≥1，gydF4y2BapgydF4y2Ba ≤ 0.05). To reduce noise and improve the reliability of DEG analysis, the genes with below 10 FPKM in both control and treatment databases were all removed. As a result (Fig.4gydF4y2Baa），共4076（2863个上调基因和1213个下调基因），6917（2935个上调基因和3982个下调基因），11,918（6760个上调基因和5158个下调基因））分别在HT_1H VS CON中检测到DEG，HT_72H VS CON和SEN VS CON。使用Venn图进一步分析（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab)显示在每次比较中都检测到独特的和重叠的DEGs集合。在HT_72h与Con的比较中，大多数DEGs (3835;55.44%)属于V5 (HT_72h vs Con和Sen vs Con的交集，但HT_1h vs Con)。然而，大多数deg (2237;54.88%)在HT_1h与Con的比较中为HT_1h所特有。gydF4y2Ba

众所周知，转录后调控，包括选择性剪接也可以改变转录本的表达。因此，差异表达亚型(DEIs， |loggydF4y2Ba_2gydF4y2Ba|≥1，gydF4y2BapgydF4y2Ba-value≤0.05,FPKM≥10)在热胁迫和叶片衰老过程中也被检测到。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba与DEGs相似，HT_1h诱导的大部分DEIs(293/529, 55.39%)对短时间热胁迫特别敏感，而HT_72h诱导的大部分DEIs(465/900, 51.67%)对叶片衰老也特别敏感(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bad)。gydF4y2Ba

通过短期和长期的HS度的视角和DEIS的功能分析共调控gydF4y2Ba

DEG_V4 (HT_1h与Con、HT_72h与Con、Sen与Con比较的交集)中有413个DEGs，其中289个基因持续上调，101个基因持续下调。详细的代谢途径分析(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa)这些上调的基因中，大多数显著参与内质网蛋白加工(125个DEGs)和剪接体(17个DEGs)。进一步分析发现上述途径中上调的基因主要编码Hsps，包括Hsp20、HspA5、Hsp90A、Hsp90B和HspA1_8。在上调的基因中占43.60%(126/289)。热图(无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab,额外的文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）的所有诱导gydF4y2Ba热休克gydF4y2Ba显示,gydF4y2Ba热休克gydF4y2Ba通过HS强烈诱导，和的表达gydF4y2BaHspgydF4y2Ba短期热处理的基因总高于长期热处理的基因。谷胱甘肽s -转移酶(GSTs)在解毒和还原ROS中起着关键作用。总共有5个编码GSTs的基因被短期和长期HS上调(图)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac,额外的文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.此外，8个基因参与光合作用，包括gydF4y2BaPSADgydF4y2Ba，gydF4y2BaPSALgydF4y2Ba，gydF4y2Ba邮政储蓄银行gydF4y2Ba，gydF4y2BapsbRsgydF4y2Ba，gydF4y2BapsbWgydF4y2Ba，gydF4y2BaPETEgydF4y2Ba，和gydF4y2BaPETFgydF4y2Ba对短期和长期HS均有反应(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bad,额外的文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.在101个下调基因中，只有一个gydF4y2BaHspgydF4y2Ba基因(gydF4y2Bai0_LQ_TF3rd_c75113 / f1p27/835gydF4y2Ba)被确认。gydF4y2Ba

DEI分析中，在DEI_V4中共鉴定出50个DEI，包括28个持续上调的亚型和17个持续下调的亚型(HT_1h vs Con和HT_72h vs Con比较的交集，但Sen vs Con)。与DEG_V4中的deg相似，半数上调的DEIs编码Hsps。gydF4y2Ba

短期和长期HSR基因及其亚型编码不同的功能群gydF4y2Ba

尽管有重叠，但一组基因表现出对短期或长期HS特异的表达模式改变。共有2237个基因和293个亚型对HT_1h特异应答，其中大部分基因表达上调(2126/2237;265/293)。其中，1626个DEGs和193个DEIs发生了至少32倍的变化。KEGG分析显示HT_1h特异性诱导的基因显著参与内质网蛋白加工、内吞作用、植物-病原体代谢、剪接体和蛋白输出(Additional file)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)度。enriched in these pathways almost all encoded Hsps. A total of 658 differentially expressedHspgydF4y2Ba基因进行了鉴定，占30.95％（图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba一，附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.据报道，与HSP90相互作用的fk506结合蛋白(FKBPs)、肽基-脯氨酸顺/反式异构酶也被短期热应激特异性诱导(图)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bab,额外的文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba) ［gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．After 1 h of heat treatment, sixFKBP62gydF4y2Ba,一个gydF4y2BaFKBP65gydF4y2Ba和42gydF4y2BaFKBP70sgydF4y2Ba显着上调。此外，几个CAgydF4y2Ba^{２＋gydF4y2Ba}信号基因在热处理1 h后也显著上调gydF4y2Ba钙依赖性蛋白激酶4gydF4y2Ba（gydF4y2BaCPK4gydF4y2Ba),两个gydF4y2BaCalcyclin结合蛋白gydF4y2Ba（gydF4y2BaCacybpsgydF4y2Ba），一个gydF4y2Ba60 b Calmodulin-Binding蛋白质gydF4y2Ba（gydF4y2BaCBP60BgydF4y2Ba），一个gydF4y2Ba钙调素样蛋白15gydF4y2Ba（gydF4y2BaCML15gydF4y2Ba），一个gydF4y2BaCML16gydF4y2Ba,一个gydF4y2BaCML18gydF4y2Ba和一个人gydF4y2BaCML25/26gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2Bac,额外的文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.植物激素发挥非生物胁迫具有重要作用。四个基因参与了脱落酸（ABA），茉莉酸（JA）和细胞分裂素的信号转导，其中包括两个gydF4y2BaPYL4sgydF4y2Ba,一个gydF4y2Ba冠菌素钝感1gydF4y2Ba（gydF4y2BaCOI1gydF4y2Ba),和一个gydF4y2Ba组氨酸Phosphotransfer蛋白质gydF4y2Ba（gydF4y2BaAHP.gydF4y2Ba）特别响应于短期HS（图。gydF4y2Ba6gydF4y2Bad,额外的文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.然后对HT_1h特异性诱导的DEIs进行KEGG分析。内质网蛋白加工、植物与病原体的相互作用、角质、亚蜡质和蜡质生物合成以及剪接体均显著富集(附文件)gydF4y2Ba4gydF4y2Bab）。当gydF4y2Ba热休克gydF4y2Ba仍占DEIs的最大部分;但这一比例(20.38%，54/265)远低于DEGs。gydF4y2Ba

After 72 h of high-temperature treatment, a total of 1336 DEGs and 197 DEIs were specially activated. Among the up-regulated DEGs and DEIs, only 104 DEGs and nine DEIs showed more than 32-fold changes, the number of which was much less than that of DEGs specifically induced by HT_1h. Compared with genes induced by HT_1h, the molecular function of DEGs activated by HT_72h was dramatically different. The most enriched pathways were ribosome, ribosome biogenesis in eukaryotes, RNA polymerase, pyrimidine metabolism, and purine metabolism (Additional file6gydF4y2Ba),只有7个gydF4y2Ba热休克gydF4y2Ba是专门通过HT_72h诱导。大量的核糖体蛋白基因，特别是通过诱导HT_72h，包括23gydF4y2Ba小亚基核糖体蛋白gydF4y2Ba（gydF4y2BaPRS.gydF4y2Ba), 39gydF4y2Ba大亚基核糖体蛋白gydF4y2Ba（gydF4y2Ba的PRLgydF4y2Ba）（图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba一，附加文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.gydF4y2BaCYPgydF4y2Ba同样编码肽基-脯氨酸顺反式异构酶的基因在72 h热处理后被特异性诱导(图)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bab,额外的文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.此外，还有6个KT/HAK/KUP转运体，其中1个gydF4y2BaHK10gydF4y2Ba,两个gydF4y2BaHAK18sgydF4y2Ba,两个gydF4y2BaHAK23sgydF4y2Ba和一个人gydF4y2BaHak25.gydF4y2Ba在DEG_V2中鉴定（图。gydF4y2Ba7gydF4y2Bac,额外的文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.对于通过DEIS HT_72h特异性诱导，无gydF4y2Ba热休克gydF4y2Ba被确定了。差别拼接gydF4y2BaCYPS.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba在野阵营gydF4y2Ba，和gydF4y2Ba的PRLgydF4y2BaHT_72h也明显诱导。与1 h的热处理不同，72 h的热应激抑制了相对较多的DEGs和DEIs。HT_72h单独下调了735个DEGs和100个DEIs。最丰富的途径是植物激素信号转导(附加文件gydF4y2Ba6gydF4y2Bab).共鉴定出22个参与生长素、细胞分裂素、ABA、乙烯和JA信号转导的deg，如gydF4y2Ba斋月zim-域gydF4y2Ba（gydF4y2BaJAZgydF4y2Ba), EgydF4y2Bathylene麻木不仁的2gydF4y2Ba（gydF4y2BaEIN2gydF4y2Ba），gydF4y2Ba小生长素Up RNA 32gydF4y2Ba（gydF4y2BaSAUR32gydF4y2Ba），gydF4y2Ba等gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba7gydF4y2Bad,额外的文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.尽管一些CagydF4y2Ba^{２＋gydF4y2Ba}HT_1h、CagydF4y2Ba^{２＋gydF4y2Ba}related genes were mainly down-regulated after 72 h of heat treatment (Fig.7gydF4y2Bae,额外的文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.此外，糖转运体包括三种gydF4y2BaSweet13s.gydF4y2Ba和一个gydF4y2BaSWEET4gydF4y2Ba， HT_72h特别抑制(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Baf,额外的文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.有趣的是，七14-3-3蛋白（一个gydF4y2BaGF14AgydF4y2Ba四gydF4y2BaGF14BsgydF4y2Ba,两个gydF4y2BaGF14EsgydF4y2Ba)被鉴定为热处理72 h后唯一下调的DEGs(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Bag，附加文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.在DEIS方面特别是通过抑制HT_72h，几个DEIS参与植物激素信号转导和CagydF4y2Ba^{２＋gydF4y2Ba}通过选择性剪接产生的信令。gydF4y2Ba

衰老和HS共同调控的DEGs和DEIs分析gydF4y2Ba

如前所述，持续高温会加速树叶衰老[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．在这里，我们发现，大多数的基因（55.44％，6917分之3835）和亚型（51.67％，900分之465）响应HT_72h也回应森（图gydF4y2Ba4gydF4y2Bab).叶片衰老标记基因HT_72h和sen共诱导了1193个基因和164个亚型gydF4y2BaSAG12gydF4y2Ba显着诱导72小时的热应激和自然衰老。另外，该上调的次数列表含有四种叶生分解酵母相关基因（图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba一，附加文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba),包括七gydF4y2BastaygreensgydF4y2Ba（gydF4y2Ba岩石gydF4y2Ba），一个gydF4y2Ba脱镁叶绿加氧gydF4y2Ba（gydF4y2BaPAOgydF4y2Ba），一个gydF4y2Ba苯酚酶gydF4y2Ba（gydF4y2Ba产后大出血gydF4y2Ba),和一个gydF4y2Ba叶绿素b还原酶gydF4y2Ba（gydF4y2BaNOLgydF4y2Ba）.在这些上调的基因中，鉴定出5个乙烯和JA生物合成基因，以及1个细胞分裂素氧化酶基因。gydF4y2Ba8gydF4y2Bab,额外的文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba),包括一个gydF4y2Ba1-氨基环丙烷-1-羧酸酯氧化酶gydF4y2Ba（gydF4y2Ba华gydF4y2Ba),两个gydF4y2Ba12-氧植物二烯酸还原酶1sgydF4y2Ba（gydF4y2Baopr1s.gydF4y2Ba），一个gydF4y2Ba过氧物酶体缺陷1gydF4y2Ba（gydF4y2BaPED1gydF4y2Ba),和一个gydF4y2Ba细胞分裂素氧化酶/脱氢酶4gydF4y2Ba（gydF4y2BaCKX4gydF4y2Ba）.此外，还发现了与压力相关的基因，包括三个gydF4y2Ba应激增强蛋白质2sgydF4y2Ba（gydF4y2BaSEP2sgydF4y2Ba),两个gydF4y2Ba相关蛋白质gydF4y2Ba（gydF4y2BasrpgydF4y2Ba）和四种普遍应激蛋白质gydF4y2BaPHOS34sgydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba8gydF4y2Bac,额外的文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba）.DEIs的注释分析表明了这一点gydF4y2BaPAOgydF4y2Ba,两个gydF4y2Ba岩石gydF4y2Ba和一个gydF4y2BaPED1gydF4y2Ba通过AS产生。gydF4y2Ba

下调基因（2546）和同种型（299）的数量远远超过v5中的上调基因和同种型。Kegg分析表明，最多三种富集的途径是光合作用 - 天线蛋白（176℃），光合作用（205次）和光合生物中的碳固定（147次）（附加档案gydF4y2Ba9gydF4y2Ba）.参与这些途径的Degs包括大量的gydF4y2BaLHCAgydF4y2Ba，gydF4y2BaLHCb的gydF4y2Ba，gydF4y2BapsbA启动gydF4y2Ba，gydF4y2BaPSBPgydF4y2Ba，gydF4y2BapsbWgydF4y2Ba，gydF4y2BaPSBRgydF4y2Ba，gydF4y2Ba红细胞表面gydF4y2Ba等。有趣的是，gydF4y2BaFKBPS.gydF4y2BaHT_72h和Sen抑制HT_1h特异性诱导的细胞凋亡。gydF4y2Ba8gydF4y2Bad,额外的文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba）.另外，两个gydF4y2Ba过氧化氢酶1gydF4y2Ba年代（gydF4y2Bacat1gydF4y2Ba）和一个gydF4y2BaCAT2gydF4y2Ba被抑制(无花果。gydF4y2Ba8gydF4y2Bae,额外的文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba）.DEI注释结果显示，有18、11和8个DEIs分别参与光合生物的固碳、光合-天线蛋白和光合作用。gydF4y2Ba

中值得注意的是,621个基因在V6 (HT_1h vs Con的交集和森vs反对但HT_72h vs Con), 93度表现出相反的变化趋势之间HT_1h vs欺诈和森vs案子,表明有一个对抗衰老和短期商品之间的关系。HT_1h显著诱导的共有26个基因，但被sen抑制。相反，HT_1h显著抑制的共有67个基因，但被sen诱导的有67个基因。功能注释显示，热诱导的26个DEGs包含3个gydF4y2Ba热休克gydF4y2Ba,三个gydF4y2BapsbRsgydF4y2Ba,一个gydF4y2BaPSBPgydF4y2Ba,一个gydF4y2BaGST.gydF4y2Ba和一个人gydF4y2BaUxin / Indole-3-Acetic AcigydF4y2Bad 3 (gydF4y2BaIAA3gydF4y2Ba）.67个衰老诱导的DEGs中含有2个gydF4y2BaNRT1 / PTR家族6.4 S.gydF4y2Ba（gydF4y2BaNPF6.4 S.gydF4y2Ba),两个gydF4y2BaNDR1 / HIN1-like 10 sgydF4y2Ba（gydF4y2BaNHL10sgydF4y2Ba),和一个gydF4y2BaSTP1gydF4y2Ba．有趣的是，gydF4y2BaSAG12gydF4y2Ba是表征叶片衰老最常用的衰老相关内参基因，在被HT_1h抑制的基因中发现。gydF4y2Ba

DEGs和DEIs对自然衰老特别敏感的功能分析gydF4y2Ba

此外，还研究了对自然衰老特别敏感的基因和亚型。共鉴定出5119个上调的DEGs和633个上调的DEIs。KEGG分析显示，这些上调的DEGs在108条通路中富集。最显著富集的途径是缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、脂肪酸降解和半乳糖代谢gydF4y2Ba10gydF4y2Baa）。在108个途径中，92个与响应于HT_72H和SEN的人相同。对于DEI，一些衰老相关基因，包括三个gydF4y2Ba早花3秒gydF4y2Ba（gydF4y2Baelf3s.gydF4y2Ba），一个gydF4y2BaPAOgydF4y2Ba，和一个脱落醛氧化酶3 (gydF4y2BaAAO3gydF4y2Ba)由AS生成。gydF4y2Ba

然而，与响应既HT_72h和森度的视角，远远小于上调的DEGS下调是由参议员具体确定虽然很多下调的度的视角是在光合作用中光合生物固碳和乙醛酸和二羧酸依然丰富代谢，大部分下调的度的视角在核糖体富集（附加文件gydF4y2Ba10gydF4y2Bab）。gydF4y2Ba

主要转录因子（TFS）应对HS和衰老gydF4y2Ba

在HS和衰老期间，确定了一系列TF家族。主要的TF家族是Hsf和NAC家族(附加文件)gydF4y2Ba11gydF4y2Ba额外的文件gydF4y2Ba12gydF4y2Ba）.gydF4y2BahsfgydF4y2Ba是高度敏感的短期HS。一共有70gydF4y2BaHsfgydF4y2Bas由ht_1h具体诱导。另外，一个gydF4y2BaHsfgydF4y2BaHT_72h特异性上调，4gydF4y2BahsfgydF4y2BaHT_1h和HT_72h均上调gydF4y2BahsfgydF4y2BaHT_72和参议员都上调了监管gydF4y2BahsfgydF4y2Ba在HT_1h和HT_72h诱导下，HT_1h的表达丰度明显高于HT_72h。大多数诱发的gydF4y2BahsfgydF4y2Ba属于A类，其中包括gydF4y2BaHsfA2sgydF4y2Ba和gydF4y2BaHsfA6sgydF4y2Ba．但是，只有一个C类gydF4y2BaHsfgydF4y2Ba被鉴定出来，它被衰老所抑制。如附加文件所示gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba北亚gydF4y2Ba主要是由衰老引起的。完全，38gydF4y2Ba北亚gydF4y2Ba是专门由森诱导，并且16gydF4y2Ba北亚gydF4y2Ba共转诱导HT_72h和参议员只有一个gydF4y2BangydF4y2BaHT_1h特异性上调基因表达。相比之下,下调gydF4y2BangydF4y2Ba主要在热应激下鉴定基因。gydF4y2Ba

后续AS分析表明gydF4y2BahsfgydF4y2Ba只短期热胁迫过程中的选择性剪接，包括6个gydF4y2BaHsfA2asgydF4y2Ba,一个gydF4y2BaHsfA2dgydF4y2Ba,一个gydF4y2BaHsfA2egydF4y2Ba,两个gydF4y2BaHsfB2asgydF4y2Ba,两个gydF4y2BaHSFB2BS.gydF4y2Ba,一个gydF4y2BaHsfB2cgydF4y2Ba,八个gydF4y2BaHsfA6asgydF4y2Ba．然而，NAC基因的交替剪接不仅发生在衰老过程中，也发生在长期热应激过程中。例如,亚型gydF4y2Bai2_LQ_TF3rd_c10489 / f1p2/2143gydF4y2Ba（gydF4y2BaNAC071gydF4y2Ba）和gydF4y2Bai2_LQ_TF3rd_c8329 / f1p0/2237gydF4y2Ba（gydF4y2BaNAC074gydF4y2Ba)在sen - Isoforms中通过选择性剪接生成gydF4y2BaI1_LQ_TF3RD_C49009 / F1P0 / 1737gydF4y2Ba（gydF4y2BaNAC068gydF4y2Ba）和gydF4y2Bai1_HQ_TF3rd_c9464 / f2p0/1360gydF4y2Ba（gydF4y2BaNAC079gydF4y2Ba)通过Sen和HT_72h交替剪接产生。gydF4y2Ba

为了验证RNA测序结果，6个deg，包括3gydF4y2Ba北亚gydF4y2Ba和3gydF4y2BahsfgydF4y2Ba进行实时荧光定量PCR (qRT-PCR)(图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)度。gydF4y2Bai1_LQ_TF3rd_c8869 / f1p0/1379gydF4y2Ba（gydF4y2BaNAM-B2gydF4y2Ba），gydF4y2Bai1_HQ_TF3rd_c26766 / f2p2/1431gydF4y2Ba（gydF4y2BaNAC029gydF4y2Ba),gydF4y2Bai1_hq_tf3rd_c44692 / f2p0 / 1636gydF4y2Ba（gydF4y2BaNAM-B1gydF4y2Ba)均由Sen和HT_72h诱导。度gydF4y2Bai1_LQ_TF3rd_c31016 / f1p0/1406gydF4y2Ba（gydF4y2BaHSFA2D-1gydF4y2Ba）和gydF4y2Bai1_LQ_TF3rd_c80591 / f1p0/1429gydF4y2Ba（gydF4y2BaHSFA2D-2gydF4y2Ba）通过HT_1H和HT_72H诱导。degydF4y2Bai3_HQ_TF3rd_c12860 / f2p0/3466gydF4y2Ba标注为gydF4y2BaHsfA2agydF4y2Ba由ht_1h具体诱导。如图1所示。gydF4y2Ba9gydF4y2BaA，所有六个次数的QRT-PCR结果与RNA-SEQ获得的QRT-PCR结果一致，表明RNA-SEQ结果是可靠的。gydF4y2Ba

二的瞬态表达式gydF4y2Ba北亚gydF4y2Ba和一个gydF4y2BahsfgydF4y2Bain.gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba叶子gydF4y2Ba

三个转录因子，包括NAC029，NAM-B1和HsfA2a，功能进行了表征在进行瞬时表达实验gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba．用空载体渗透叶片的左半部分，用含有35S启动子和每个TF编码序列的二元结构渗透叶片的右半部分。45℃热处理24 h后，通过电解质渗漏检测各样品细胞膜损伤情况。结果表明(图。gydF4y2Ba9gydF4y2BaB)，植物涉农渗透与gydF4y2Ba35 s:: NAC029gydF4y2Ba或gydF4y2Ba35 s:: NAM-B1gydF4y2Ba与对照相比，两种结构体都表现出了更高水平的细胞膜损伤gydF4y2Ba35 s:: HsfA2agydF4y2Ba与对照相比，构造表现出显着较低的细胞膜损伤水平。gydF4y2Ba

HS是冷季草高羊茅生长发育的关键决定因子[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．高温会导致在转录组，蛋白质组，代谢组和变化显著。的全基因组基因HSR全面了解是第一个也是必不可少的步骤来研究高羊茅HS响应的转录调控网络。在这项研究中，SMRT测序与Illumina测序相结合的高羊茅为首次使用。所述SMRT测序显示在个Unigenes的平均长度有很大的改进，并与第二代RNA测序相比全长转录本的比[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．在高羊茅中共获得62,443个ungenes，平均长度为2595 bp(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.全长转录有助于向热响应基因的进一步克隆，以及功能分析的高比率。gydF4y2Ba

常见，在短期和长期的热应激明显的热响应的基因gydF4y2Ba

在这项研究中，通过短 - （1小时）和长期（72小时）热应激处理高的浮虫植物。与以前的高级杂草（2小时和12小时）和小麦（1小时和24小时）相比[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba在这里，有一小部分基因是由短时间和长时间的热处理共同调控的。这可能是两次热处理间隔很长时间的结果。这些通常上调的基因主要包括gydF4y2Ba热休克gydF4y2Ba，gydF4y2Ba消费税gydF4y2Ba和与光合作用相关的基因。HSP通过重新建立正常蛋白质构象并因此在细胞稳态中对抗HS来保护植物对HS进行至关重要的作用gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．尽管gydF4y2Ba热休克gydF4y2Ba在热应激期间，已被广泛报道[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]gydF4y2Ba热休克gydF4y2Ba只是之前研究中热诱导转录本的一小部分[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．注释为的deg仅为7.75% (117/1509)gydF4y2Ba热休克gydF4y2Ba小麦在HS后1小时[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．不一致,gydF4y2BaHspgydF4y2Ba在高羊茅中，热处理后的DEGs含量最高，几乎占到一般上调的一半。此外，表达这些gydF4y2Ba热休克gydF4y2Ba相比于HT_72h, HT_1h的变化更为显著，这与前人的研究一致[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．结果表明gydF4y2Ba热休克gydF4y2Ba热应力很大，非常快。热应力产生对植物细胞有毒的ROS，并影响照片系统II的修复系统[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．多项研究表明，ros清除机制在保护植物免受高温胁迫方面具有重要作用[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．在本研究中，活性氧清除剂(gydF4y2Ba消费税gydF4y2BaHT_1h和HT_72h共同诱导了参与光合作用的基因，说明高羊茅植物试图清除ROS，维持稳定的光合作用，以最大限度地减少高温造成的伤害。gydF4y2Ba

高羊茅的热反应是在热处理时间上是不同的。在这里，我们发现，高羊茅，短期热响应是更快，比以往任何时候都报道了更戏剧性的过程。在the previous study, the number of DEGs under 2 h of short-term heat treatment (4311) was only half of that under 12 h of long-term heat treatment (8395), and most of the DEGs were down-regulated [15gydF4y2Ba］．而在我们的研究中，HT_1h特异性调控的deg更多，其中76.48%上调超过32倍。一项研究进一步强调了短期HS更快的反应，该研究表明，在热处理的前30分钟内，小麦叶片和籽粒中检测到42.83和74.50%的DEGs [gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．热应激1 h后，一半的DEGs值下降gydF4y2Ba热休克gydF4y2Ba；然而,几乎没有gydF4y2Ba热休克gydF4y2Ba由HT_72 H特别上调，进一步表明响应gydF4y2Ba热休克gydF4y2Ba高羊茅的热应激是快速、短暂和剧烈的。gydF4y2BaFKBPS.gydF4y2Ba，另一个在蛋白质折叠中扮演经典角色的伴侣家族[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]，也被HT_1h高度诱导。不一致的gydF4y2BaFAFKBP65gydF4y2Ba在本研究中，HT_1h从0诱导至13.33，gydF4y2BaOsFKBP65gydF4y2Ba仅热应激后在RNA水平检测[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，AtFKBP62调制耐热性通过与Hsp90.1相互作用并且影响HsfA2调节sHsps的积累[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．在这里，六gydF4y2BaFaFKBP62sgydF4y2Ba明显被HT_1h诱导。结果表明gydF4y2BaFKBPS.gydF4y2Ba在高羊茅中被激活以抵抗短期高温。钙调素已被报道参与FKBP的功能，钙信号在HSR中的作用已在小麦和小麦中得到证实gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．一直，gydF4y2BaPCM5gydF4y2Ba编码钙调蛋白的HT_1H上调。此外gydF4y2BaPCM5gydF4y2Ba，在热处理1 h后也发现了其他钙信号基因，提示钙可能在其中起作用gydF4y2Ba^{２＋gydF4y2Ba}在短期高铁中介导的信号传导。植物激素如ABA、SA和乙烯在耐热性中的作用已被广泛报道[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．在这里，参与了ABA，油菜素内酯，JA，和细胞分裂素基因通过短期HS引起的，虽然角色在热应激这些上调的基因还没有被证实。另外的实验需要来确定耐热自己的角色和下游通路。gydF4y2Ba

长期HSR的过程与短期HSR的过程完全不同。与短期HSR相比，抑制了更多基因。经过长期热应激，核糖体蛋白，gydF4y2BaCYPS.gydF4y2Ba和钾转运蛋白显著诱导，而植物激素信号传导基因，钙信号传导基因，gydF4y2Ba糖果gydF4y2Ba，和gydF4y2Ba14-3-3年代gydF4y2Ba被抑制。在HT_72h特异性上调的deg中，核糖体蛋白所占比例最大。一致地，大量核糖体蛋白基因在HS后上调，尤其是小麦的长期HS [gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．鉴于核糖体蛋白是蛋白质合成所必需的，核糖体蛋白的诱导可能表明它们在防止长期热应激对蛋白质合成的干扰方面的作用。钾离子(KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)是生命必需的营养物质gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba穿过膜的运输是由KT / Hak / Kup家族介导的[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba］．gydF4y2BaKT / (/ KUPgydF4y2Ba有文献记载转运蛋白参与应激反应，包括盐和干旱[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．然而，它的作用gydF4y2BaKT / (/ KUPgydF4y2Ba尚未见报道在热应激转运。在这里，上调gydF4y2Ba在野阵营gydF4y2Ba为进一步研究hak介导的热反应提供了线索。它们可以通过K来修复高温引起的细胞渗透失衡gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba吸收和排出。与HT_1h相比，植物激素信号转导相关基因，包括生长素、细胞分裂素、ABA、乙烯和JA主要受到HT_72h的抑制。JA和乙烯在抗热胁迫方面有相反的作用gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba．当gydF4y2Bacoi1gydF4y2Ba突变体对热应激更敏感，而gydF4y2Baein2gydF4y2Ba突变体显示增加的耐热性[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．然而，的表达gydF4y2BaFacoi1.gydF4y2Ba和gydF4y2BaFaEIN2gydF4y2Ba均在HT_72h后降低，说明gydF4y2BaCOI1gydF4y2Ba和gydF4y2BaEIN2gydF4y2Ba热应激可能是种特异性的。14-3-3蛋白在各种非生物和生物胁迫中起调节作用[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba］．在gydF4y2Ba果蝇gydF4y2Ba细胞，14-3-3蛋白被观察到溶解和重新自然化热聚集蛋白[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba］．然而，14-3-3蛋白在HS中的功能在植物中尚未见报道。在这里，我们发现在高羊茅中，长期HS与14-3-3蛋白相关。几个gydF4y2BaGF14sgydF4y2Ba被HT_72h特异性抑制。与此相反，大部分14-3-3蛋白在热处理15 min后呈现瞬时表达升高gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba52gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

热应激和衰老之间的协同和拮抗关系gydF4y2Ba

本研究还探讨了衰老与短期或长期热应激之间的关系。短期HS与叶片衰老可能存在拮抗关系;短期热胁迫可加速叶片衰老。gydF4y2BaSAG12gydF4y2Ba，是叶子衰老的一种参考基因，随着年龄的增长而显著增加[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba］．通过HT_1H降低，但通过HT_72H增加，表明短期HS后叶片衰老略微减少，但长期HS后诱导。在先前的研究中，热诱导的叶片衰老与细胞蛋白合成呈负相关，与乙烯和ABA正相关[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．乙烯合成基因gydF4y2Ba华gydF4y2Ba和细胞分裂素降解基因gydF4y2BaCKX4gydF4y2Ba此外，另一种促衰老激素JA的合成基因也被HT_72h和sen诱导。我们的研究结果表明，长期热应激可通过调控植物激素合成和降解的相关基因来促进衰老。在叶片衰老过程中，叶绿素通过SGR和叶绿素分解代谢酶(CCEs)降解为无色产物，如NYC1、NOL、PPH、PAO和RCCR [gydF4y2Ba54gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55gydF4y2Ba，gydF4y2Ba56gydF4y2Ba］．SGR-CCE-LHCII复合物的形成触发LHCPII的不稳定，以降解Chls和无chl LHCPII亚基在衰老的叶子[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba］．在这里，SGR和3个cce被诱导，但lhcb被HT_72h和Sen抑制，表明长期热应激通过SGR- cce - lhcii复合物加速衰老。gydF4y2Ba

的反应gydF4y2BaFaHsfsgydF4y2Ba和gydF4y2BaFaNACsgydF4y2Ba热胁迫和叶片衰老gydF4y2Ba

课题组在应对不同的生物和非生物胁迫起到了重要的作用。在这里，热响应的TF家庭成员进行了鉴定。HSFS是HSR在所有真核生物的主调节器[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba］．这里，表达水平gydF4y2BaHsfA2sgydF4y2Ba是由HS引起的最强烈的，这与之前的研究一致[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba59gydF4y2Ba］．几项研究报告了函数分析gydF4y2BaHsfA2gydF4y2Ba，但仍有争议[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba60gydF4y2Ba，gydF4y2Ba61gydF4y2Ba］．在这项研究中,gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba过度抑制gydF4y2BaFaHsfA2agydF4y2Ba显示对HS的容差增加。它的进一步体内功能分析将在高空中进行。由于-LFGV-MOTIF，B类HSF总是应该在HS期间具有阻遏功能。一小部分gydF4y2BaHsfB2sgydF4y2Ba是由短期或长期HS诱导的，其功能有待进一步研究[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba］．很少有C类Hsfs在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba或者番茄，它的功能还不知道。一致,只有一个gydF4y2BaHsfCgydF4y2BaHS诱导高羊茅。NAC是植物特有的转录因子家族，在植物发育和非生物胁迫中发挥着不同的作用[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba］．一些顾问委员会已被确定为衰老积极监管，有趣的是，其中一些参与植物抗逆性以及[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba，gydF4y2Ba64gydF4y2Ba］．说到这里，很多的gydF4y2Ba北亚gydF4y2Ba自然衰老和长期的HS均显著诱导，表明热诱导的衰老其潜在的重要作用。NAC029，自然衰老的关键调节因子，也被认定参与盐，干旱和冷胁迫[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba，gydF4y2Ba65gydF4y2Ba，gydF4y2Ba66gydF4y2Ba，gydF4y2Ba67gydF4y2Ba］．但是，NAC029在HS中的作用仍然未知。一个高大的FESCUE基因gydF4y2Bai1_HQ_TF3rd_c26766 / f2p2/1431gydF4y2Ba它被注释为gydF4y2BaNAC029gydF4y2Ba主要由Sen和HT_72h诱导。gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba过度抑制gydF4y2BaFANAC029.gydF4y2Ba显示膜损伤增加，提示gydF4y2BaFANAC029.gydF4y2Ba可能在高羊茅长期HS加速衰老中起重要作用。同时，对另一个的功能分析gydF4y2BangydF4y2Ba基因gydF4y2Bai1_hq_tf3rd_c44692 / f2p0 / 1636gydF4y2Ba它被注释为gydF4y2BaNAM-B1gydF4y2Ba在执行gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba也据报道gydF4y2BaNAM-B1gydF4y2Ba能加速小麦的衰老[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba，花期后热和agydF4y2BaNAM-B1gydF4y2Ba基因渐渗在面包小麦中有类似的作用(两者都能加速花梗衰老)，但非加性作用[gydF4y2Ba69gydF4y2Ba］．但是，在这项研究中，叶子感染了gydF4y2Ba35 s:: NAM-B1gydF4y2Ba与空载体感染相比，HS后的膜损伤更明显，说明gydF4y2BaFaNAM-B1gydF4y2Ba可能在高羊茅长期HS加速衰老中起重要作用。进一步对两者进行体内功能分析gydF4y2BaNAC基因gydF4y2Ba高羊茅将开展。gydF4y2Ba

在热应激和叶片衰老中的参与gydF4y2Ba

AS参与许多植物过程，特别是对环境压力的反应[gydF4y2Ba70gydF4y2Ba］．在本研究中，我们仅检测到298例与HS相关的AS事件，其数量远少于其他研究[gydF4y2Ba71gydF4y2Ba］．这可能是由于缺乏参考基因组序列。然而，高羊茅AS事件的分布与RI为主要AS事件的其他植物一致[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．有很好的文献证明gydF4y2BahsfgydF4y2Ba和gydF4y2Ba热休克gydF4y2Ba很容易交替拼接[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba72gydF4y2Ba］．差异表达gydF4y2Ba热休克gydF4y2Ba和gydF4y2BahsfgydF4y2Ba通过AS产生的同种型在高羊茅热处理后广泛观察到。此外，许多其他的亚型，如gydF4y2Ba岩石gydF4y2Ba，gydF4y2BaPAOgydF4y2Ba，和gydF4y2BaPED1gydF4y2Ba在高羊茅中，AS的表达也存在差异。虽然没有关于AS在植物衰老中的作用的研究报道，gydF4y2BangydF4y2Ba的基因,gydF4y2Baelf3s.gydF4y2Ba和gydF4y2BaAAO3gydF4y2Ba由在高大的裂缝中在衰老叶中观察到的。在HS和衰老期间，这些基因的功能需要进一步调查。gydF4y2Ba

本研究研究了HSR的短期和长期变化以及HSR与衰老的关系(图)。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba）.我们的结果表明，短期内HS可以激活大量的gydF4y2Ba热休克gydF4y2Ba，gydF4y2BaFKBPS.gydF4y2Ba，钙信号基因，植物激素信号传导基因，和gydF4y2BahsfgydF4y2Ba改善热能。然而，长期HS可能导致通过激活叶绿素分解基因，植物激素合成/降解基因，应激相关基因和，NAC TFS和抑制光合作用相关基因的叶片衰老，gydF4y2BaFKBPS.gydF4y2Ba和gydF4y2BaCAT的gydF4y2Ba．在热应激和衰老，大量HS-的和衰老相关DEIS由AS生成。需要涉及深入耐热性育种的候选基因在高羊茅表征进一步研究，以揭示热适应和热诱导的衰老的潜在机制。gydF4y2Ba

植物材料及处理gydF4y2Ba

耐热性较高的商业型高羊茅‘猎犬5’种子(附加文件gydF4y2Ba13gydF4y2Ba) ［gydF4y2Ba73gydF4y2Ba]播种于塑料花盆(直径10厘米，高度10厘米)，与沙土和泥炭混合(1/2,v/v)。然后将花盆保持在温室中，温度为22°C/18°C(昼/夜)，光周期为14 h /10 h，相对湿度为70-80%。建立2个月后，将所有植株转移到光周期为16 h、光合有效辐射为450 μmol m的控制环境生长室(HP300GS-C，瑞华仪器，中国武汉)gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}冠层日/夜温度22/18°C，相对湿度70%。植株在此条件下驯化1周后再进行热处理。取一株高羊茅弱绿叶作为对照(简称对照)。然后将剩下的植物分成两组。第I组高羊茅在22/18°C(昼/夜)的控制环境生长室中保存，直到高羊茅叶片衰老，采集衰老叶片(命名为Sen)。第二组在受控环境生长箱中进行38°C昼/33°C夜处理。除温度外，其他生长环境与对照相同。分别在热处理1h(命名为HT_1h)和72h(命名为HT_72h)后采集叶片。所有采集的样本立即用液氮冷冻，在−80°C保存，直到RNA分离。所有处理重复3个重复。gydF4y2Ba

RNA制备和Illumina RNA测序gydF4y2Ba

使用Trizol试剂盒(Invitrogen公司，Carlsbad公司，CA)从收集的样品(Con, Sen, HT_1h, HT_72h)中提取总RNA。使用NanoDrop 2000 (Thermo, Waltham, USA)和1.2%琼脂糖凝胶检测总RNA的数量和质量。Illumina RNA测序时，每个样本总RNA含量为1.5 μg。根据制造商的建议，使用Illumina®(NEB, Ipswich, USA)的NEBNext®Ultra™RNA文库准备试剂盒构建测序库。采用安捷伦生物分析仪2100系统对图书馆质量进行评价。gydF4y2Ba

聚合RNA样本PacBio SMRT测序gydF4y2Ba

对于PacBio SMRT测序，将Illumina RNA-seq使用的12个RNA样本等量混合在一起。Isoform Sequencing (Iso-Seq)文库根据Iso-Seq协议生成，使用Clontech SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit (Takara, Dalian, China)和Pacific Biosciences (PN 100-092-800-03)描述的BluePippin Size Selection System协议。gydF4y2Ba

PacBio数据处理gydF4y2Ba

PacBio测序后，使用SMRTlink 6.0软件对原始数据进行处理。ccs由通过2次的子reads生成，精度> .8,max_length为15,000。根据是否有5 ' -和3 ' - cdna引物，以及3 ' -引物前是否有poly-A尾信号，将CCS或亚读序列分为全长、非全长和嵌合reads。然后将全长和非全长fasta数据输入到聚类步骤中，由ICE进行同形级聚类，最后进行Arrow抛光。为了提高共识的准确性，LoRDEC利用Illumina测序数据进一步纠正了共识reads的额外核苷酸错误[gydF4y2Ba65gydF4y2Ba］．最后的转录物通过CD-HIT的修正共识删除冗余获得。gydF4y2Ba

全长唯一转录本模型重建gydF4y2Ba

非冗余转录物与编码基因组重建工具（切实V3.1处理gydF4y2Bahttps://github.com/Magdoll/CogentgydF4y2Ba)，使用参数:——dun_use_partial。通常，Cogent首先将输入fasta文件分割成chunk_size大小的块，然后计算k-mer配置文件。每个转录本家族使用De Bruijn图法进一步重构为一个或几个独特的转录本模型(称为UniTransModels)。gydF4y2Ba

替代剪接分析gydF4y2Ba

使用gmap-2017-06-20将错误更正的非冗余转录本(Cogent重建前的转录本)映射到UniTransModels。映射到相同UniTransModels的转录本的剪接连接被检查，具有相同剪接连接的转录本被折叠。不同剪接连接的折叠转录本被鉴定为UniTransModels的转录亚型。SUPPA检测AS事件(gydF4y2Bahttps://github.com/comprna/SUPPAgydF4y2Ba)，使用默认设置。通过rMATS对AS事件的差异表达进行量化[gydF4y2Ba74gydF4y2Ba］．用|dpsi| > 0.1和|过滤AS事件的显著差异表达gydF4y2BapgydF4y2Ba- value <0.05;．gydF4y2Ba

基于Illumina数据的差异表达分析gydF4y2Ba

通过RSEM计算各样本的基因表达水平[gydF4y2Ba75gydF4y2Ba］．采用DESeq R包(1.10.1)进行两组差异表达分析。DESeq提供了使用基于负二项分布的模型来确定数字基因表达数据中的差异表达的统计程序。由此产生的gydF4y2BaPgydF4y2Ba值采用Benjamini和Hochberg的方法进行调整以控制错误发现率。如果一个基因表现出两倍的差异，即|log，则认为它是一个DEGgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba比值(治疗/对照)|≥1，调整后gydF4y2BapgydF4y2Ba-value≤0.05,FPKM > 10。gydF4y2Ba

度的视角的实时定量PCR分析gydF4y2Ba

根据上述方法，采用qRT-PCR检测deg的表达水平[gydF4y2Ba76gydF4y2Ba］．简而言之，利用PrimeScript RT试剂试剂盒(Takara，中国大连)进行cDNA合成。采用20 μl SYBR (Takara, China, Dalian)和ABI STEPONE Real-Time PCR系统进行qRT-PCR。gydF4y2BaFaACTINgydF4y2Ba作为内参基因进行归一化处理。用于qRT-PCR分析的所有基因特异性引物均在附加文件中列出gydF4y2Ba14gydF4y2Ba．采用三个独立的生物学重复进行qRT-PCR分析。gydF4y2Ba

在瞬时表达gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba电解质渗漏分析gydF4y2Ba

对于瞬时过表达的实验中，质粒转移到gydF4y2Ba根癌土壤杆菌gydF4y2Ba菌株AGL1。如前所述进行农药过滤[gydF4y2Ba77gydF4y2Ba，gydF4y2Ba78gydF4y2Ba］．简单地说，将过夜培养的细菌重新悬浮在农业渗透培养基(10 mM MES, pH 5.6, 10 mM MgCl)中gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和200 μM乙酰丁香酮)的OD600为1.0。采用无针注射器渗透gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba植物在生长条件下，24°C日/ 20°C夜间，16 H光/ 8 H黑暗循环。渗透后，将植物保持在22℃过夜。第二天早晨，农业渗透植物被移动到45℃。在高温处理的24小时（在12小时光/ 12 H-暗循环中）后，收获叶子以进行EL测定。三个复制样品五1厘米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba从每个叶片样品中打上叶盘，然后用去离子水清洗两次。将圆盘放置在50ml的试管中。每根试管中加入25 mL去离子水，然后将样品保存在25°C 150 rpm的摇床中。4 h后，用电导率计测量初始电导率。然后对样品进行高压灭菌，冷却至室温后测定总电导率。计算细胞膜损伤程度:初始电导率× 100/总电导率。gydF4y2Ba

的Fv / FM的测量gydF4y2Ba

在测量FV / FM之前，将叶子保持在黑暗中30分钟以关闭所有PSII反应中心。然后，根据制造商的协议，通过脉冲幅度调制（PAM）便携式叶绿素荧光计（PAM-2500，Walz，Effeltrich，德国）测量FV / FM。gydF4y2Ba

在目前的研究中生成和分析的数据集可在NCBI序列读取存档库生物工程PRJNA647166 (gydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/traces/study/?acc=PRJNA647166.gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

海关:gydF4y2Ba

热应力gydF4y2Ba

DEG：gydF4y2Ba

差异表达基因gydF4y2Ba

Hsp:gydF4y2Ba

热休克蛋白gydF4y2Ba

Hsf:gydF4y2Ba

热休克因子gydF4y2Ba

ROS:gydF4y2Ba

活性氧gydF4y2Ba

APX：gydF4y2Ba

抗坏血酸盐过氧化物酶gydF4y2Ba

TF：gydF4y2Ba

转录因子gydF4y2Ba

SMRT:gydF4y2Ba

单分子实时gydF4y2Ba

为:gydF4y2Ba

替代拼接gydF4y2Ba

PACBIO：gydF4y2Ba

太平洋生物科学gydF4y2Ba

CCS技术:gydF4y2Ba

圆形的共有序列gydF4y2Ba

FLNC：gydF4y2Ba

全身non-chimeric读gydF4y2Ba

ICE：gydF4y2Ba

错误修正的迭代聚类gydF4y2Ba

NFL：gydF4y2Ba

非全长gydF4y2Ba

NR：gydF4y2Ba

非冗余蛋白质序列数据库gydF4y2Ba

NT：gydF4y2Ba

核苷酸序列数据库gydF4y2Ba

KOG /齿轮:gydF4y2Ba

直际蛋白质群体gydF4y2Ba

KEGG:gydF4y2Ba

基因和基因组的京都百科全书gydF4y2Ba

走:gydF4y2Ba

基因本体论gydF4y2Ba

缺点：gydF4y2Ba

控制gydF4y2Ba

HT_1h:gydF4y2Ba

1小时38°C热处理gydF4y2Ba

ht_72h：gydF4y2Ba

72 h of 38 °C heat treatment

森：gydF4y2Ba

衰老的叶子gydF4y2Ba

销售税:gydF4y2Ba

谷胱甘肽S-transferasegydF4y2Ba

阿巴：gydF4y2Ba

脱落酸gydF4y2Ba

是:gydF4y2Ba

茉莉酸gydF4y2Ba

SE:gydF4y2Ba

外显子跳跃gydF4y2Ba

MX：gydF4y2Ba

相互排斥的外显子gydF4y2Ba

A5:gydF4y2Ba

替代5'剪接位点gydF4y2Ba

A3:gydF4y2Ba

替代3'拼接 - 网站gydF4y2Ba

ri：gydF4y2Ba

保留的内含子gydF4y2Ba

AF：gydF4y2Ba

替代第一外显子gydF4y2Ba

AL：gydF4y2Ba

选择最后一个外显子gydF4y2Ba

妄想：gydF4y2Ba

差异表达的事件gydF4y2Ba

Iso-Seq:gydF4y2Ba

亚型测序gydF4y2Ba

FKBP：gydF4y2Ba

FK506-binding蛋白质gydF4y2Ba

猫:gydF4y2Ba

过氧化氢酶gydF4y2Ba

SGR:gydF4y2Ba

vistgreengydF4y2Ba

埃尔:gydF4y2Ba

电解质泄漏gydF4y2Ba

DEI：gydF4y2Ba

差异表达亚型gydF4y2Ba

PRS：gydF4y2Ba

小亚基核糖体蛋白gydF4y2Ba

光杆载荷:gydF4y2Ba

大亚基核糖体蛋白gydF4y2Ba

PAO：gydF4y2Ba

Pheophorbide一加氧酶gydF4y2Ba

PPH：gydF4y2Ba

苯酚酶gydF4y2Ba

NOL:gydF4y2Ba

叶绿素b还原酶gydF4y2Ba

华:gydF4y2Ba

1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶gydF4y2Ba

opr1：gydF4y2Ba

12-Oxophytodienoate还原酶1gydF4y2Ba

PED1：gydF4y2Ba

过氧物酶体缺陷1gydF4y2Ba

CKX4:gydF4y2Ba

细胞分裂素氧化酶/脱氢酶4gydF4y2Ba

SEP2：gydF4y2Ba

应激增强蛋白2gydF4y2Ba

SRP:gydF4y2Ba

与压力相关的蛋白质gydF4y2Ba

ELF3：gydF4y2Ba

初花期3gydF4y2Ba

AAO3:gydF4y2Ba

脱落醛氧化酶3gydF4y2Ba

高铁:gydF4y2Ba

HS响应gydF4y2Ba

CCE:gydF4y2Ba

叶绿素分解酶gydF4y2Ba

不适用gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

This work was financially supported by the National Natural Science Foundation of China (41503067 and 31672482), the National Science Foundation for Young Scientists of China (41603121), the Fundamental Research Funds for the Central University (CZZ19006), the Major Science and Technology Innovation Project of Shandong Province (2019JZZY010726), Poverty Alleviation through Agricultural Projects from the Agricultural Office of Chinese Academy of Sciences, and the Strategic Priority Research Program of the Chinese Academy of Sciences. These funding bodies did not play any roles in the design of the study and collection, analysis, and interpretation of data and in writing the manuscript.

作者指出gydF4y2Ba

1. 钱义光、曹立文对这项工作的贡献是一样的。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 深圳大学化学与环境工程学院环境化学与生态修复重点实验室，深圳市人民共和国深圳gydF4y2Ba

   怡光钱gydF4y2Ba

2. 中国科学院植物种质创新与特色农业重点实验室，中国科学院种子设计创新研究院武汉植物园gydF4y2Ba

   李文曹，强张，毛里斯·阿梅＆梁辰gydF4y2Ba

3. 中南民族大学资源与环境科学学院，催化与能源材料化学教育部重点实验室，催化与材料科学湖北省重点实验室，武汉gydF4y2Ba

   陈客gydF4y2Ba

4. 中华人民共和国武汉，中国科学院核心植物园经济植物学中心gydF4y2Ba

   梁陈gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

YGQ和LWC撰写了这份手稿并进行了实验。YGQ、LWC、QZ对测序数据进行分析，MA对测序数据进行分析并对手稿进行修改，KC、LC对实验进行设计指导并对手稿进行修改。所有作者阅读并批准了手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应于gydF4y2Ba陈客gydF4y2Ba或gydF4y2Ba梁陈gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

竞争利益gydF4y2Ba

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。gydF4y2Ba

出版商的注意事项gydF4y2Ba

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文是基于知识共享署名4.0国际许可,允许使用、共享、适应、分布和繁殖在任何媒介或格式,只要你给予适当的信贷原始作者(年代)和来源,提供一个链接到创作共用许可证,并指出如果变化。本文中的图像或其他第三方材料都包含在本文的知识共享许可中，除非在该材料的信用额度中另有说明。如果资料不包括在文章的知识共享许可协议中，并且你的预期用途没有被法律规定允许或超过允许用途，你将需要直接从版权所有者获得许可。如欲查阅本许可证副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用及公共领域专用豁免书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba）适用于本文中提供的数据，除非另有用入数据的信用额度。gydF4y2Ba

重印和权限gydF4y2Ba