樱桃砧木‘CDR-1’抗性分析(GydF4y2Ba李属mahalebGydF4y2Ba)以冠瘿病GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

冠瘿病，由致病菌引起GydF4y2Ba根癌土壤杆菌GydF4y2Ba是造成果园大量经济损失的罪魁祸首。樱桃砧木‘CDR-1’(GydF4y2Ba李属mahalebGydF4y2Ba)表现出高抗性，但机制尚不清楚。在这里,我们审查pathogen-infected根颈表面的形态,确定活动的10的内容与国防有关的酶和水杨酸(SA)和茉莉酸(JA),并应用转录组分析,瞬态表达式和转基因验证探索冠瘿病抗性基因在CDR-1植物。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

在我们的研究中，过氧化物酶在感染后的第10天增加，而苯丙氨酸解氨酶和脂肪加氧酶在感染后的第15天增加。AsA-GSH循环中的四种关键酶也有一定程度的反应;虽然处理后JA含量显著增加，但SA含量没有增加。在后续的转录组分析中，差异表达基因GydF4y2BaPm4CL2GydF4y2Ba，GydF4y2BaPmCYP450GydF4y2Ba，GydF4y2BaPmHCT1GydF4y2Ba，GydF4y2BaPmHCT2GydF4y2Ba,GydF4y2BaPmCADGydF4y2Ba是差异。基于以上结果，我们重点研究了木质素的生物合成途径，并进一步测定了木质素含量，发现木质素含量显著增加。的GydF4y2BaPm4CL2GydF4y2Ba通过瞬时表达和转基因实验验证其在冠瘿病抗性中的作用。结果显示，在治疗后12 h，治疗组的相对表达量几乎是对照组的14倍。感染处理后，转基因株系出现明显的抗性迹象;这说明在较高的表达水平和较早的激活下GydF4y2BaPm4CL2GydF4y2Ba，植物抗性增强。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

' CDR-1 '的冠瘿抗性可能与木质素生物合成途径有关GydF4y2BaPm4CL2GydF4y2Ba植物防御反应病原体中关键功能GydF4y2Ba农GydF4y2Ba．研究结果为研究樱桃根茎‘CDR-1’对树冠瘿病的防御反应和抗性机制提供了新的思路。GydF4y2Ba

冠瘿病很久以前就被认为是一种细菌性植物疾病[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba]，其病原菌为GydF4y2Ba根癌土壤杆菌GydF4y2Ba主要感染双子叶植物。这种疾病经常给樱桃和其他果树的生产造成严重的经济损失[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba，GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba4GydF4y2Ba]．冠瘿病开始于附着GydF4y2Ba农GydF4y2Ba植物细胞。然后转移DNA, Ti质粒的一部分，将被整合到植物基因组中。最后，有症状的肿瘤形成并生长[GydF4y2Ba5GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

树冠瘿病影响许多果树，给苗圃造成广泛的经济损失。在之前的一项研究中，调查了11个树种。发病率最高的是桃(GydF4y2Ba桃GydF4y2Ba(L。[英语背诵文选杏仁(GydF4y2BaP. Dulcis.GydF4y2BaD韦伯），樱桃(GydF4y2Bap .鸟结核GydF4y2BaL.），苹果（GydF4y2Ba马吕斯的抗旱性GydF4y2Ba和橄榄(GydF4y2BaOlea EuropaeaGydF4y2Bal .) [GydF4y2Ba6GydF4y2Ba]．桃、樱桃、苹果和梨的砧木(GydF4y2BaPyrus Communis.GydF4y2Bal .)树是一个影响因素的显著差异的频率擦伤植物。GydF4y2Ba

植物经常暴露在各种各样的细菌、病毒和真菌病原体中，但它们已经进化出强大的防御系统来保护自己[GydF4y2Ba7GydF4y2Ba]．在植物的防御反应中，微生物病原体的识别起着关键作用，因为它“打开”了信号转导通路，激活了众多病原体应答基因的表达[GydF4y2Ba8GydF4y2Ba，GydF4y2Ba9GydF4y2Ba]．这些抗病基因对于病原体感染过程中识别效应蛋白至关重要[GydF4y2Ba7GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

许多生物技术策略已被开发和应用于试图控制冠瘿病。在转化实验中，参与T-DNA转移的截断基因已被用于诱导植物对冠瘿病的抗性[GydF4y2Ba10GydF4y2Ba，GydF4y2Ba11GydF4y2Ba]，灭活致癌基因可防止肿瘤形成[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba]．因此，为了获得抗冠瘿病的植物，很多研究都致力于通过将这些序列置于相反的强组成启动子之间，来产生癌基因序列的意义和反义链[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba]，或使用过早终止密码子使相关的细菌致癌基因沉默[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba]．Niemeyer等人(2014)的研究证明了病毒的成功重编程GydF4y2BaNGydF4y2Ba针对冠瘿病基因响应[GydF4y2Ba9GydF4y2Ba]．近年来，Rosalia Deeken的团队一直在研究冠瘿病与冠瘿病之间的分子机制GydF4y2Ba农GydF4y2Ba在GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba［GydF4y2Ba8GydF4y2Ba，GydF4y2Ba15GydF4y2Ba，GydF4y2Ba16GydF4y2Ba，GydF4y2Ba17GydF4y2Ba，GydF4y2Ba18GydF4y2Ba]．病原菌侵染往往引起植物激素的反应。Lee et al.(2009)从SA、JA、乙烯(et)、生长素(吲哚-3-乙酸，IAA)等方面探讨了植物的生理变化和适应GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba肿瘤发生过程中的转录组[GydF4y2Ba5GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

目前，种植抗病品种和开发生物拮抗剂是防治果树树冠瘿病的有效措施[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba]．现有的生物拮抗剂，主要用于预防，但他们的行为不当的治疗。因此，冠农抗胆品种均需要[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba]．先前的研究已经报道了苹果、桃子、李子、葡萄藤、白杨和玫瑰抗冠瘿病的品种[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba21GydF4y2Ba，GydF4y2Ba22GydF4y2Ba，GydF4y2Ba23GydF4y2Ba，GydF4y2Ba24GydF4y2Ba，GydF4y2Ba25GydF4y2Ba，GydF4y2Ba26GydF4y2Ba，GydF4y2Ba27GydF4y2Ba]．对20株植物的冠瘿抗性进行了评估GydF4y2Ba李属GydF4y2Ba物种(GydF4y2Ba21GydF4y2Ba]．结果发现，当菌株K12和C58GydF4y2Ba农GydF4y2Ba用该菌侵染幼苗的主茎或侧枝，部分材料的抗性发生率高达30%GydF4y2Bap . mahalebGydF4y2Ba．樱桃育种资源植物GydF4y2Bap . mahalebGydF4y2Ba是世界性的樱桃根茎。在我国西北地区，由于其优良的生物学特性，如抗冠瘿病、矮化能力和耐盐性等，已成为甜樱桃的主要砧木之一[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba]．通过对樱桃种的系统分类，GydF4y2Bap . mahalebGydF4y2Ba属于III。GydF4y2Ba授粉GydF4y2Ba亚属，第5节Mahaleb Focke [GydF4y2Ba29GydF4y2Ba]．它是一种落叶乔木或大灌木，可长到2-10米(很少长到12米)高，树干直径可达40厘米。在大多数樱桃种植国家，mahaleb樱桃被用作甜樱桃和酸樱桃的砧木[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba]．该砧木在樱桃生产中表现出较强的抗树冠瘿病能力，但其抗树冠瘿病机理尚不清楚。此外，支持对冠瘿病抗性的实际基因(未经修饰)尚未被报道。GydF4y2Ba

在这项研究中，我们专注于樱桃砧木“CDR-1”（GydF4y2Bap . mahalebGydF4y2Ba），的天然杂交品种GydF4y2Bap . mahalebGydF4y2Ba．本研究的目的是探讨‘CDR-1’对冠瘿病的抗性机制。我们对‘CDR-1’进行了形态学观察、生理生化分析、基因表达分析和转录组分析，并在烟草中进行了瞬时表达和转基因验证。我们的研究结果表明，‘CDR-1’的冠瘿抗性可能与木质素生物合成途径有关。GydF4y2Ba

形态学观察GydF4y2Ba

形态学观察使用场发射扫描电子显微镜（FESEM）揭示GydF4y2Ba农GydF4y2Ba在感染后5天(dpi)， × 4.00 k放大后，损伤对照组细胞完全缺失。GydF4y2Ba1GydF4y2Baa)，但在× 4.50 k的放大倍数下接种处理时，许多细胞粘附在创面上。GydF4y2Ba1GydF4y2Bab).值得注意的是垂直侵入方式GydF4y2Ba农GydF4y2BaFESEM捕捉到通过伤口部位进入给定的“CDR-1”植物(图。GydF4y2Ba1GydF4y2Bab)。GydF4y2Ba

生物化学分析GydF4y2Ba

接种处理与伤对照组超氧化物歧化酶(SOD)活性相近。除20 dpi时治疗组SOD活性高于伤对照组外，两组间无显著差异(图2)。GydF4y2Ba2GydF4y2Baa).然而，处理组过氧化物酶(POD)活性在10dpi时急剧上升至峰值，随后迅速下降并保持相对稳定的水平，而受伤对照组则在整个过程中保持在较低的稳定水平(图1)。GydF4y2Ba2GydF4y2Bab).伤对照组和治疗组的过氧化氢酶(CAT)活性均在前15天急剧升高，随后在其余时间下降。但在15和20 dpi时，处理组的CAT活性显著高于对照组(图2)。GydF4y2Ba2GydF4y2Bac).处理组多酚氧化酶(PPO)活性在试验前5天呈上升趋势，在10 dpi前呈下降趋势，但在试验结束后逐渐升高。伤对照组在前10 d内表现出相似的趋势，与接种治疗组比较差异无统计学意义。在10 - 20 dpi范围内，受伤对照组的PPO活性保持在一个较低且稳定的水平(图1)。GydF4y2Ba2GydF4y2Bad） 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性在前5个月逐渐升高 受伤对照组的PAL活性保持在较低水平，但从10到20 dpi略有增加。因此，在整个期间，PAL活性水平相对较高（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Bae）。脂氧合酶（LOX) activity in both the wounded control and treatment group gradually increased in the first 10 days. LOX activity in the treatment with inoculation sharply increased to a peak at 15 dpi, and then rapidly declined over the later days, while that in the wounded control showed a gradual increase in the next 10 days. In an overall view, LOX activity in the treatment was significantly higher than that in the wounded control during the whole period except at 20 dpi (Fig.2GydF4y2Baf)。GydF4y2Ba

抗坏血酸盐过氧化物酶(APX型)治疗接种活动大幅增加在第一个五天,逐步增加从5到15 dpi,然后迅速下降,直到实验结束时,在受伤的控制它保持在一个低和相对稳定的水平在整个期间(无花果。GydF4y2Ba3.GydF4y2Baa).治疗组单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)活性在前5 dpi时稳定，在15 dpi时急剧上升至峰值，随后迅速下降。与受伤对照组相比，感染治疗显著增加了' CDR-1 '的MDHAR活性，从10 dpi到15 dpi。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bab)。GydF4y2Ba

治疗组脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)和谷胱甘肽还原酶(GR)活性在第10天均下降近50%后升高。20 dpi时，接种处理的DHAR和GR活性均显著高于伤对照组。在受伤对照组中，DHAR活性在前15天相对稳定后下降，GR活性在前15天略有波动后下降(图1)。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bac和d）。GydF4y2Ba

伤对照组和治疗组的总SA含量在整个过程中均有波动，在10和20 dpi处达到峰值。处理后SA含量在前5 dpi保持不变，在10 dpi时增加，在10 - 15 dpi时减少，随后急剧增加。伤对照组在前10dpi逐渐升高，与接种处理相比显著升高，随后10d与处理组趋势相似(图1)。GydF4y2Ba4GydF4y2Baa).处理组JA含量在15 dpi前急剧上升至峰值，随后迅速下降，而伤对照组JA含量保持在较低水平，略有波动。因此，处理组的JA含量在整个时期显著升高(图2)。GydF4y2Ba4GydF4y2Bab)。GydF4y2Ba

转录组分析GydF4y2Ba

为了获得‘CDR-1’植物转录组对病原菌感染反应的总体概况，以5dpi采集感染的根颈组织。从这些样本中，我们总共获得了43,331,742到63,922,658个reads，其中超过63%的reads被映射到参考樱桃(GydF4y2Bap .鸟结核GydF4y2Ba)基因组（附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:表S1)。此外，40个差异表达基因(DEGs)被鉴定为绝对值对数GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba(fold change)≥1，假发现率< 0.001。通过GO注释、KEGG通路和富集分析，获得了预测的DEGs功能。根据GO注释将这些词划分为30个功能词。其中生物学过程项16项，分子功能项13项，细胞成分项1项(附加文件)GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：图。S1）。生物过程组中的基因主要参与代谢和氧化 - 还原处理。分子功能方面均与过渡金属离子结合：特别是，铁离子结合，转移酶活性，血红素结合，氧化还原酶活性和四吡咯结合均显著富集的GO术语。根据KEGG通路和富集分析，DEGS在脂肪酸代谢和生物合成苯丙的信号通路被显著富集的（附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S2)。在40个deg中，有37个上调基因和3个下调基因，我们都成功注释了这些基因。GydF4y2Ba5GydF4y2Ba一个)。GydF4y2Ba

根据KEGG途径和富集分析结果，结合POD、PPO、PAL酶活性，我们重点研究苯丙素生物合成途径(图)。GydF4y2Ba5GydF4y2Bab，附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：图S3）。具体而言，我们测量了基因的相对表达-GydF4y2BaPmPAL1GydF4y2Ba，GydF4y2BaPmPAL2GydF4y2Ba，GydF4y2BaPm4CL1GydF4y2Ba，GydF4y2BaPm4CL2GydF4y2Ba，GydF4y2BaPmCAD1GydF4y2Ba和GydF4y2BaPmCAD2GydF4y2Ba- 编码的关键酶PAL，4CL（4-香豆酸：辅酶A连接酶），CAD（肉桂醇脱氢酶）在该途径。图S4示出了这些基因在“CDR-1”植物的它们的表达水平。mRNA水平GydF4y2BaPmPAL1GydF4y2Ba，GydF4y2BaPmPAL2GydF4y2Ba，GydF4y2BaPm4CL1GydF4y2Ba，GydF4y2BaPm4CL2GydF4y2Ba，GydF4y2BaPmCAD1GydF4y2Ba,GydF4y2BaPmCAD2GydF4y2Ba治疗组在5 dpi时均显著上调，在5 dpi时反应最强GydF4y2BaPm4CL2GydF4y2Ba，表达为受伤对照组的12倍GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：图S4）。在这项研究中，基因GydF4y2BaPm4CL2GydF4y2Ba(ID: Pav_sc0000636.1_g260.1。可,LOC110758567),GydF4y2BaPmCYP450GydF4y2Ba(ID: Pav_sc0001248.1_g320.1。可,LOC110766184),GydF4y2BaPmHCT1GydF4y2Ba(Pav_sc0002792.1_g140.1。br, LOC110774309),GydF4y2BaPmHCT2GydF4y2Ba(Pav_sc0002792.1_g150.1。可,LOC103335795),GydF4y2BaPmCADGydF4y2Ba（Pav_sc0004014.1_g160.1.mk，LOC110744673）从GydF4y2Bap . mahalebGydF4y2Ba分别在苯丙生物合成途径的度的视角。GydF4y2Ba

其次，测定了侵染植物的木质素含量GydF4y2Ba农GydF4y2Ba．这通常会升高随着时间的推移，显示出与对照早5天感染后（图相比，治疗的显著效果。GydF4y2Ba5GydF4y2Bac)基因GydF4y2BaPm4CL2GydF4y2Ba，催化木质素单体的生物合成，因此被选为靶基因用于下面的过表达实验。GydF4y2Ba

烟草遗传转化的假说验证GydF4y2Ba

的T.ransient expression analysis revealed the relative expression of treatment group was approximately 14-fold that of the control group at 12 h post-treatment (Fig.6GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

调查GydF4y2BaPm4CL2GydF4y2Ba胁迫下GydF4y2Ba农GydF4y2Ba，我们转化了目标基因GydF4y2BaPm4CL2GydF4y2Ba到烟草（GydF4y2Ba烟草GydF4y2BaL.，CV SR1）和生成GydF4y2BaPm4CL2GydF4y2Ba-过表达转基因烟草株系(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S5)。其中，选择两个独立的系4CL2-1和4CL2-2进行接下来的实验。的扩增片段长度GydF4y2BaPm4CL2GydF4y2BaPCR检测为1815 bp(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S6)。GydF4y2Ba

测试对…的敏感性GydF4y2Ba农杆菌GydF4y2Ba在转基因植株和野生型(WT)烟草植株的茎部感染了该致癌物GydF4y2Ba农GydF4y2Ba（图。GydF4y2Ba7GydF4y2Baa).转基因品系4CL2-1感染两周后，在损伤程度为III的创面部位可见数个虫瘿(图2)。GydF4y2Ba7GydF4y2Bab)，而WT植物幼龄虫瘿生长迅速，并布满整个伤口，损伤程度为V(图。GydF4y2Ba7GydF4y2Bac） 然而，转基因品系4CL2–2的症状不太明显，只有少量小虫瘿零星出现在伤口上，损伤程度仅为I（图。GydF4y2Ba7GydF4y2Bad）。After 0 h, 12 h, 48 h, and 60 h, the relative expression of both transgenic lines was significantly higher than that of counterpart WT plants. After infection, the relative expression of transgenic line 4CL2–1 increased gradually, reaching a peak at 60 h (Fig.7GydF4y2Bae)，而转基因株系4CL2-2的峰值更早，在12 h(图4)。GydF4y2Ba7GydF4y2Baf)。GydF4y2Ba

植物在其一生中会受到许多生物体的攻击。病原菌能侵入植物组织，并在细胞外空间增殖。植物已经进化出免疫系统来识别和限制病原体的生长[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]．在植物病原体感染后的第几个小时，在一定程度上，他们的防守反应途径被激活，但是这取决于工厂系统[GydF4y2Ba8GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

在初步试验中，‘CDR-1’对冠瘿病的抗性强于‘Gisela 6’，这促使我们使用前者作为材料进行抗性分析。在本研究中，冠瘿发育伴随着感染幼苗形态、防御相关酶和植物激素的深刻变化，其防御反应随着时间的推移而增强。接种后，在5dpi处理组仍有一些细菌附着在创面上，试图入侵植物。它表明,GydF4y2Ba农GydF4y2Ba与机械损伤引起的单脉冲应力相比，感染是慢性的。GydF4y2Ba

在本研究中，‘CDR-1’的PAL活性在感染后增加，最高达15 dpi，显著高于‘Gisela 6’(补充文件)GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S7a)由Liang等人(2019)报道。PAL是苯丙氨酸途径中的关键限速酶，催化苯丙氨酸生成反式肉桂酸，进而合成木质素或类黄酮生物合成的前体[GydF4y2Ba31GydF4y2Ba，GydF4y2Ba32GydF4y2Ba]．结果表明，接种处理POD活性在感染后10 d开始升高，PPO活性在感染后10 d开始升高。Liang et al.(2019)的研究表明，“吉塞拉6号”的POD和PPO活性在过去10天均有所增加(补充文件)GydF4y2Ba1GydF4y2Ba图S7b和c)。POD的早期激活似乎是易感菌株‘Gisela-6’和抗性菌株‘CDR-1’防御反应的主要差异。GydF4y2Ba

POD酶被广泛认为催化木质素生物合成的最后一步酶促，的脱氢GydF4y2BaP.GydF4y2Ba-coumaryl醇[GydF4y2Ba33GydF4y2Ba]．对苹果的研究表明，处理后苹果PAL和POD活性显著增加GydF4y2BaɛGydF4y2Baε-聚-L-赖氨酸处理相对于激活苹果果实的酚类化合物，黄酮类化合物和木质素的积累，以形成限制病原体侵入[物理屏障GydF4y2Ba34GydF4y2Ba]．PPO被认为参与了多酚氧化成奎宁和植物细胞的木质化[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba]．一些研究还表明，苯酚氧化酶可能参与植物的防御反应[GydF4y2Ba36GydF4y2Ba，GydF4y2Ba37GydF4y2Ba]．与POD活性不同的是，在早期，PPO活性在敏感的Gisela-6和抗性的CDR-1之间似乎没有差异，这表明PPO可能在防御反应中没有发挥重要作用或没有参与。GydF4y2Ba

感染处理后，‘CDR-1’植株的CAT活性在15 dpi时升高，但‘吉塞拉6’接种处理与受伤对照组之间无明显差异(附文件)GydF4y2Ba1GydF4y2Ba中：图S7D）GydF4y2Ba2GydF4y2Ba]．LOX酶是JA生物合成的关键酶，在许多植物物种中有助于防御致病微生物[GydF4y2Ba38GydF4y2Ba，GydF4y2Ba39GydF4y2Ba]．在感染后的前15天，接种处理的LOX活性显著高于伤对照组。处理组‘CDR-1’的LOX活性显著高于‘Gisela 6’(补充文件)GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S7e) [GydF4y2Ba2GydF4y2Ba这是易感品种“Gisela-6”和抗性品种“CDR-1”防御反应的主要差异。GydF4y2Ba

APX，MDHAR，DHAR和GR是在ASA-GSH周期，这是一种有效的抗氧化剂体系，以消除活性氧物种（ROS）的四个关键酶。在我们的研究中，“CDR-1”一般都类似于“吉塞拉6”的所有四种酶的趋势[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba]，但‘CDR-1’中APX酶活性显著升高(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S7f)。在光合生物中，APX是HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba解毒。在一些研究中，则表明APX活动是在控制为H重要GydF4y2Ba_2GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba一些胁迫条件和病原体攻击条件[浓度下在细胞内信号传导GydF4y2Ba40GydF4y2Ba]．CDR-1的APX活性较高，说明该砧木对H有较高的解毒能力GydF4y2Ba_2GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

SA在植物对生物胁迫的防御反应中起着重要的信号分子作用。人们提出了两种SA的生物合成途径。一种途径是苯丙氨酸在PAL酶催化下生成肉桂酸合成SA。另一种是由异chorismate synthase (ICS)和异chorismate pyruvate lyase (IPL)催化的两个反应生成的[GydF4y2Ba41GydF4y2Ba]．许多研究表明，高PAL活性对病原菌诱导植物中SA的形成具有重要意义[GydF4y2Ba42GydF4y2Ba，GydF4y2Ba43GydF4y2Ba]．However, in this study, the total SA content of the treatment group was lower than wounded control group during the first 10 days since infection. We interpret this to suggest cinnamate catalyzed by PAL enzyme was mainly used for lignin biosynthesis rather than SA biosynthesis (Additional file1GydF4y2Ba:图S8)，我们推测两组SA含量可能都是由创伤诱导的ICS通路合成的GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

JA在使植物对攻击的病原体作出反应和防御方面起着关键作用[GydF4y2Ba44GydF4y2Ba，GydF4y2Ba45GydF4y2Ba]．在我们的研究中，‘CDR-1’植株感染后，整个时期JA含量均显著高于受伤对照，在15 dpi时达到峰值，然后逐渐下降，明显高于‘吉塞拉6号’(附文件)GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S9) [GydF4y2Ba2GydF4y2Ba]．值得注意的是，‘CDR-1’对冠瘿病的防御反应中可能存在JA和SA之间的拮抗作用。JA和SA信号通路是植物抗病原菌所必需的。众所周知，这些途径相互作用，有时导致途径之间的拮抗。JA和SA通路之间的拮抗作用在化学和生物分析中都被观察到，尽管这是不对称的[GydF4y2Ba46GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

通过转录组分析，我们在处理后的植物中发现了40个deg。关于参与植物早期防御反应的基因的转录激活，无可否认，这些研究迄今为止得出了不同的结论。例如，用非致癌的高毒性药物治疗GydF4y2Ba农杆菌GydF4y2Ba菌株中防御基因的表达GydF4y2Ba藿香conyzoidesGydF4y2Ba感染后24小时细胞培养变化[GydF4y2Ba47GydF4y2Ba]．在对烟草植物的研究中[GydF4y2Ba48GydF4y2Ba], just within 3–6 h after infected with different农杆菌GydF4y2Ba菌株的防御基因转录增加，但随着T-DNA转移的开始，防御基因转录开始下降。与这些发现相反，该研究没有显示在4到24小时内转录水平的变化，但这些确实在感染后48小时增加GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba［GydF4y2Ba49GydF4y2Ba]．后GydF4y2Ba农杆菌GydF4y2Ba把菌株接种在伤兵的根部GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba茎，只有很少的防御基因在感染后3小时被激活[GydF4y2Ba5GydF4y2Ba]．在我们确定了40度的视角，五个是苯丙生物合成途径的一部分：GydF4y2BaPm4CL2GydF4y2Ba，GydF4y2BaPmCYP450GydF4y2Ba，GydF4y2BaPmHCT1GydF4y2Ba，GydF4y2BaPmHCT2GydF4y2Ba,GydF4y2BaPmCADGydF4y2Ba．GydF4y2Ba

苯丙素途径是植物中木质素、酚类和类黄酮生物合成的主要次级代谢途径[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba]，并发挥在植物上的抗病能力至关重要的作用GydF4y2Ba31GydF4y2Ba]．木质素可促进宿主细胞壁的生长，作为抵抗病原体感染的物理屏障[GydF4y2Ba50GydF4y2Ba]．与此观点一致的是，我们的研究结果表明，木质素相关基因(GydF4y2BaPmPAL1GydF4y2Ba，GydF4y2BaPmPAL2GydF4y2Ba，GydF4y2BaPm4CL1GydF4y2Ba，GydF4y2BaPm4CL2GydF4y2Ba，GydF4y2BaPmCAD1GydF4y2Ba和GydF4y2BaPmCAD2GydF4y2Ba)编码的关键酶PAL、4CL(4-香豆酸辅酶a连接酶)、CAD(肉桂醇脱氢酶)均在5 dpi水平上调。GydF4y2Ba

综上所述，我们合理地关注了木质素生物合成途径，测定了侵染处理后不同阶段的木质素含量。证实我们之前的分析(生理/生化和转录组学)，木质素含量在受病原体感染的植物中显著增加。在之前的一项研究中，结果表明，病原体感染抗性植物的防御反应包括胁迫诱导木质素的形成[GydF4y2Ba51GydF4y2Ba]．伤后对照组木质素含量也有所增加，但明显低于治疗组。正如Soltani等人(2006)所证实的那样，这可以解释为仅仅是植物的物理伤害导致了木质素含量的升高。[GydF4y2Ba52GydF4y2Ba]，而GydF4y2Ba农GydF4y2Ba更明显。GydF4y2Ba

植物中的生物胁迫可以通过苯丙素调控来对抗。木质素单体的生物合成是通过苯基丙素途径进行的。在这一途径中，4-香豆酸辅酶a连接酶(4CL)在催化羟肉桂酰辅酶a酯的形成中起重要作用。随后，它被还原为相应的单分子醇(羟基肉桂醇)[GydF4y2Ba52GydF4y2Ba]．在苯丙素途径中，4CL是一种关键酶，在生物胁迫下其表达会发生改变，这清楚地说明了4CL在对抗各种生物胁迫中的重要性[GydF4y2Ba53GydF4y2Ba]．的GydF4y2Ba4 clGydF4y2Ba基因是在一般通路分支途径的转折点，起着植物及其病原体之间的相互作用具有重要作用。GydF4y2Ba

Ehlting等人（1999年）报告说GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba，GydF4y2BaAt4CL3GydF4y2Ba可能参与了导致类黄酮最终产物的生物合成途径，而GydF4y2BaAt4CL1GydF4y2Ba和GydF4y2BaAT4CL2GydF4y2Ba中可能参与木质素的形成和生产其它的酚类的比黄酮[化合物以外GydF4y2Ba54GydF4y2Ba]．JA及其相关化合物在植物的快速局部和系统性创伤反应中发挥了重要作用[GydF4y2Ba55GydF4y2Ba，GydF4y2Ba56GydF4y2Ba，GydF4y2Ba57GydF4y2Ba]．研究表明，在欧芹中GydF4y2BaPc4CL1GydF4y2Ba基因表达被JA处理激活[GydF4y2Ba58GydF4y2Ba而创伤、过度紫外线和病原体感染等压力都会激活GydF4y2BaAt4CLGydF4y2Ba基因表达在GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba［GydF4y2Ba54GydF4y2Ba]．在我们的研究中，瞬时表达的处理效果显著，说明当烟草叶片注射目标基因时GydF4y2BaPm4CL2GydF4y2Ba被感染了GydF4y2Ba农GydF4y2Ba的相对表达GydF4y2BaPm4CL2GydF4y2Ba是显著的调节。研究表明，过度表达GydF4y2Ba4 clGydF4y2Ba可增强抗病能力[GydF4y2Ba59GydF4y2Ba]．我们的实验功能验证GydF4y2BaPm4CL2GydF4y2Ba在烟草中，与损伤程度和转基因株系和野生植物相对表达相结合，一起提出更高的表达水平和早期激活GydF4y2BaPm4CL2GydF4y2Ba促成了更强的抵抗力。GydF4y2Ba

在“CDR-1”冠瘿病，POD，PAL，LOX酶和JA含量感染治疗后显著提高了防御反应。与转录组分析和转基因进一步验证相结合，我们的研究结果提供的证据表明，转基因烟草的冠瘿性可能与木质素生物合成途径，其中GydF4y2BaPm4CL2GydF4y2Ba植物防御反应病原体中关键功能GydF4y2Ba农GydF4y2Ba．我们推测,GydF4y2BaPm4CL2GydF4y2Ba通过木质素的积累，可以增强' CDR-1 '的抗病能力GydF4y2Ba农GydF4y2Ba感染。本研究为培育抗树冠瘿品种奠定了基础。GydF4y2Ba

植物材料GydF4y2Ba

樱桃砧木“CDR-1”的幼苗通过在温室中切割传播。钻屑物在樱桃实验和西北农林科技大学，周至，西安，陕西，中国的示范站收集的（E 108°14.803'，N 34°11.560'）。With the height attaining approximately 30 cm, plants at the same developmental stage were used for the农杆菌GydF4y2Ba感染治疗。GydF4y2Ba

烟草(GydF4y2Ba烟草GydF4y2BaL.，品种SR1）种子滋生生物技术有限责任公司，陕西省，中国获得的。的seeds were sown into plastic pots filled with sterile nutrition medium and placed in an illumination incubator (Type: GXZ-300B, Southeast instruments Co., Ltd., Ningbo, China) at 22 °C under 16-h light and 8-h dark photoperiod cycle. The fully expanded leaves of four- to six-week old grown plants were used for transient expression assays.

实验设计和接种方案GydF4y2Ba

受感染的植物在温室中生长;在感染后0、5、10、15和20天(dpi)，采集植物根颈感染组织，在流动水下清洗，在液氮中冷冻，并在−80°C下保存，直到需要进一步的生化和木质素分析。GydF4y2Ba

生化分析,根颈部组织(0.1 g)在0、5、10、15、20 dpi在1% (w / v) polyvinylpolypyrrolidone (PVP)使用pre-chilled迫击炮和杵,及均分在1.2毫升的50 mM PBS (pH值7.8)包含1毫米乙二胺四乙酸(EDTA)和0.3% Triton x - 100 (GydF4y2Ba60GydF4y2Ba，这是酶的提取物。GydF4y2Ba

为了进行转录组学分析，我们收集了未感染和感染的‘CDR-1’植株的根颈组织进行RNA测序。对每组进行三个独立的生物学重复测序和分析。GydF4y2Ba

农GydF4y2Ba在这项研究中使用的是我们的团队以前从受感染樱桃树的冠瘿组织中分离出来的[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba]．的孵化GydF4y2Ba农GydF4y2Ba按照Liang等人(2019)描述的方法进行[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba]．的b一个cT.E.ria were inoculated in a lysogeny broth (LB) and incubated at 28 °C on a shaker (160 rpm) for 16–20 h. Bacteria were harvested by centrifugation (2500×GGydF4y2Ba)，在室温(RT)下重悬20分钟，在600-nm吸光度下重悬至最终光密度为0.5。GydF4y2Ba

为了保证接种和促进病害的均匀发展，采用了人工伤害技术。“CDR-1”植物的根颈上有4厘米的伤口(补充文件)GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：Fig. S10), and inoculated with 20 μL of农杆菌GydF4y2BaNiemeyer等人(2014)[GydF4y2Ba9GydF4y2Ba];在创面上涂无菌水(20 μL)作为创面对照。接种后用保鲜膜包裹感染部位(附加文件)GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：Fig. S10a) that was removed 2 days later (Additional file1GydF4y2Ba中：图S10B）。After infection, the damage degree was divided into five grades: I < 20%; 20% < II < 40%; 40% < III < 60%; 60% < IV < 80%; 80% < V < 100%.

场发射扫描电子显微镜（FESEM）分析GydF4y2Ba

形态学观察遵循Liang等人(2019)所描述的方法进行[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba]．5 dpi时用FESEM检测感染组织的形态。植物组织标本用蒸馏水洗涤，切成长度≤7mm，厚度≤3mm的切片，在4%戊二醛中室温固定2 h, 4℃固定6 h。用0.1 M磷酸盐缓冲盐水(PBS;pH值6.8)，4次，每次10分钟，然后使用乙醇稀释系列(30、50、70、80、90%)在每种浓度下脱水20分钟，然后使用100%乙醇脱水3次(每次30分钟)。然后用乙酸异戊酯取代乙醇20 min，待样品干燥后镀金，并在FESEM S-4800 (Hitachi Ltd, Japan)下观察。GydF4y2Ba

生物化学分析GydF4y2Ba

生化检测(包括POD、SOD、CAT、PPO、PAL、LOX、APX、MDHAR、DHAR、GR活性、SA和JA含量)采用Liang et al. (2019) [GydF4y2Ba2GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

分别在0、5、10、15和20 dpi处理下测定上述各酶活性和植物激素水平，每个处理重复3次。使用学生确定统计学显着GydF4y2BaT.GydF4y2Ba-测试通过IBM SPSS统计v21.0。GydF4y2Ba

木质素含量的测定GydF4y2Ba

约0.5 g样品用95% (v/v)乙醇在研钵中研磨，3000×离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba7分钟。沉淀物用95% (v/v)乙醇洗涤3次，再用乙醇:正己烷= 1:2 (v/v)的混合液洗涤3次，收集后在70℃烘干。将每个干燥样品溶解在25% (v/v)乙酰溴和冰醋酸溶液中，置于70℃恒温水浴中30分钟。用0.9 mL 2 M NaOH终止反应，然后用5 mL冰醋酸和0.1 mL 7.5 M羟氯化铵终止反应，体积填满冰醋酸10 mL。2500×离心GydF4y2BaGGydF4y2BaFor 5 min, after which the supernatant was measured for its absorption value at 280 nm. Lignin content was measured at 0, 5, 10, 15, and 20 dpi, and each treatment was replicated three times. Statistical significance was determined using Student’sT.GydF4y2Ba-测试通过IBM SPSS统计v21.0。GydF4y2Ba

转录组分析GydF4y2Ba

以下Liu等人描述的方法进行分析转录。（2018）[GydF4y2Ba61GydF4y2Ba]．A total amount of 3 μg RNA per tissue sample was used as input material to prepare the RNA samples. Sequencing libraries were generated using NEBNext® Ultra™ RNA Library Prep Kit for Illumina® (NEB, USA) following the manufacturer’s recommendations, with index codes added to attribute the sequences to each sample. The clustering of these index-coded samples carried out on a cBot Cluster Generation System using the TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS (Illumina). After cluster generation, the library preparations were sequenced on an Illumina HiSeq platform that generated 125-bp/150-bp paired-end reads. Raw data (raw reads) in the fastq format were first processed using an in-house perl script. In this step, clean data (i.e., clean reads) were obtained by removing from the raw data those reads containing adapters or containing poly-N, and any low-quality reads. Hence, all of the downstream analyses were based on clean data of high quality. The index of the reference genome was built, using Bowtie v2.2.3, to which paired-end clean reads were aligned using TopHat v2.0.12 software; finally, HTSeq v0.6.1 was used to count the read numbers mapped to each gene.

由此产生的GydF4y2BaPGydF4y2Ba-值使用Benjamini和Hochberg控制的错误发现率进行调整。基因的调整GydF4y2BaPGydF4y2Ba-value < 0.05为差异表达，用GydF4y2Ba李属鸟结核GydF4y2Ba数据库(GydF4y2Bahttps://www.rosaceae.org/species/prunus_avium/genome_v1.0.a1GydF4y2Ba） 以供参考。GydF4y2Ba

通过定量实时PCR（QRT-PCR）的基因表达分析GydF4y2Ba

根据厂家说明书，使用RNAprep Pure Plant Kit(天根生物技术有限公司，北京，中国)提取根颈组织总RNA。使用PrimeScript™RT Reagent Kit (Takara Biotechnology Co.， Ltd.， Dalian, China)合成单链cDNA。SYBR预混ExGydF4y2BaTaqGydF4y2Ba使用Kit (Takara Biotechnology Co.， Ltd, Dalian, China)在Life Technologies QuantStudio®5上进行qRT-PCR。PCR条件为:95℃初始孵育30 s, 95℃5 s, 60℃30 s，共40个循环。引物是由Primer Premier v5软件设计的GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:表S2)。GydF4y2Ba肌动蛋白GydF4y2Ba和GydF4y2Ba肌动蛋白GydF4y2Ba分别作为‘CDR-1’和烟草植株中基因表达正常化的内参。所有qRT-PCR实验均采用3个生物学重复和3个技术重复进行。使用学生确定统计学显着GydF4y2BaT.GydF4y2Ba-测试通过IBM SPSS统计v21.0。GydF4y2Ba

向量构造GydF4y2Ba

序列的全长编码GydF4y2BaPm4CL2GydF4y2Ba用正向引物(5 ' -GGACTCTTGAGydF4y2BaCCATGGGydF4y2Ba包含一个ATGATATCCATTGCCTCTAATAATTCCGT-3”)GydF4y2Ba以区域GydF4y2BaI酶切位点(下划线)和反向引物(5 ' -ATTCGAGCT)GydF4y2BaGGTCACCGydF4y2BaTTAGGGCAATGGGGTTGGTGTGG-3”);后者的GydF4y2BaBstGydF4y2BaEII限制性酶切位点（下划线）插入花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子的载体质粒pCAMBIA1301背后的同一部位。将连接的构建体（pCAMBIA1301-GydF4y2BaPm4CL2GydF4y2Ba;附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S11)，然后转化为GydF4y2Ba农GydF4y2Ba(菌株EHA105)冻融试验[GydF4y2Ba62GydF4y2Ba用于烟草的瞬时表达实验和稳定转化。GydF4y2Ba

瞬时表达GydF4y2Ba

瞬态表达实验遵循Niemeyer等人(2014)所描述的方法进行[GydF4y2Ba9GydF4y2Ba，只做了一些修改。的GydF4y2Ba农GydF4y2Ba将含有重组T-DNA结构的菌株(EHA105)接种于含有利福平50 μg/mL和卡那霉素50 μg/mL的溶菌肉汤(LB)中，并在28°C的摇床上(160 rpm)孵育16-20小时。离心收获细菌(2500×GydF4y2BaGGydF4y2Ba)，在RT下重悬20分钟，然后在MES缓冲液中重悬(10 mM MES水合物，10 mM MgClGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba(100 μM乙酰丁香酮)，在激振器上(100 rpm)静置2小时，在600 nm吸光度下获得最终光密度为0.5。的瞬态表达式GydF4y2Ba烟草GydF4y2Ba在实验中，使用生长了4 - 6周的成熟植物完全展开的叶子。的GydF4y2Ba农杆菌GydF4y2Ba用1-mL无针注射器将悬浮液(菌株EHA105)渗入叶片背面;MES缓冲区缺失GydF4y2Ba农GydF4y2Ba作为控制。的致癌GydF4y2Ba农GydF4y2Ba从树冠组织中分离的胆管组织也进行了上述培养。渗透后的GydF4y2Ba农杆菌GydF4y2BaEHA105菌株悬液48 h，致癌性GydF4y2Ba农杆菌GydF4y2Ba悬浮液再次渗透到叶片的背面。分别在处理后0 h和12 h测定相对表达量，并复制3次。GydF4y2Ba

转基因烟草植物的产生GydF4y2Ba

转基因烟草植物是根据叶盘转化协议生成的[GydF4y2Ba9GydF4y2Ba，GydF4y2Ba62GydF4y2Ba，只做了一些修改。的GydF4y2Ba农GydF4y2Ba将携带重组T-DNA结构的菌株EHA105接种在含有利福平50的LB培养基中 μg/mL和卡那霉素50 μg/mL，28℃孵育 振动筛上的摄氏度（160 16-20转/分） h、 在600℃时获得0.6的最终光密度 纳米吸光度。通过离心法（2500×100）收集细菌GydF4y2BaGGydF4y2Ba)，在室温下重悬于MES缓冲液中(100转/分)2小时，在600 nm吸光度下获得最终光密度为0.4。不育生长的叶盘GydF4y2Ba烟草GydF4y2Ba简历。SR1植物在此培养GydF4y2Ba农杆菌GydF4y2BaMS培养基(MS培养基含1.0 μg/mL 6-苄基氨基嘌呤，pH为5.8)，室温下黑暗孵育2天。共培养后，将叶盘转移至MS培养基(MS培养基中含有1.0 μg/mL 6-苄基胺嘌呤、300 μg/mL Timentin、15 μg/mL湿霉素，pH为5.8)，置于24℃的生长室内(光照16 h，暗8 h)培养。将独立愈伤组织的未分化芽切断，转移到含0.1 μg/mL萘乙酸、300 μg/mL Timentin、15 μg/mL潮霉素(pH 5.8)的1/2MS培养基上。采用PCR方法对50 μg/mL卡那霉素诱导的转基因烟草植株进行鉴定。将转基因F2种子播种于相同培养基的植株容器中，培养4周。一旦通过PCR和RT-PCR分析鉴定，选择的植物再培养3周，直到进行毒力检测。GydF4y2Ba

致癌基因的毒力测定GydF4y2Ba农GydF4y2Ba

对茎干的毒力测定如前所述，在上面的感染试验部分。对于这些试验，致癌的GydF4y2Ba农杆菌GydF4y2Ba如在部分上制备前面所述制备悬浮液GydF4y2Ba农杆菌GydF4y2Ba培养液。将染病植株在光照培养箱中进一步培养，记录其肿瘤发生和发育情况。分别在处理后0 h、12 h、48 h、60 h测定相对表达量(重复3次)。GydF4y2Ba

统计分析GydF4y2Ba

采用Microsoft Excel 2016计算平均值和标准偏差，数据以3个重复样本的平均值±标准偏差(sd)表示。使用学生确定统计学显着GydF4y2BaT.GydF4y2Ba-测试通过IBM SPSS统计v21.0。GydF4y2Ba

支持本研究结果的所有数据均包含在文章和附加文件中。测序原始数据保存在NCBI Sequence Read Archive中，登录号为PRJNA663117 (GydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=PRJNA663117GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

山:GydF4y2Ba

水杨酸GydF4y2Ba

是:GydF4y2Ba

茉莉酸GydF4y2Ba

对其:GydF4y2Ba

场发射扫描电子显微镜GydF4y2Ba

dpi:GydF4y2Ba

天感染后GydF4y2Ba

SOD:GydF4y2Ba

超氧化物歧化酶GydF4y2Ba

豆荚：GydF4y2Ba

过氧化物酶GydF4y2Ba

猫:GydF4y2Ba

过氧化氢酶GydF4y2Ba

PPO:GydF4y2Ba

多酚氧化酶GydF4y2Ba

朋友:GydF4y2Ba

苯丙氨酸ammonialyaseGydF4y2Ba

液态氧:GydF4y2Ba

脂氧合酶GydF4y2Ba

APX型:GydF4y2Ba

抗坏血酸盐过氧化物酶GydF4y2Ba

MDHAR:GydF4y2Ba

Monodehydroascorbate还原酶GydF4y2Ba

达:GydF4y2Ba

Dehydroascorbate还原酶GydF4y2Ba

格:GydF4y2Ba

谷胱甘肽还原酶GydF4y2Ba

度:GydF4y2Ba

差异表达基因GydF4y2Ba

4 cl:GydF4y2Ba

4-coumarate:辅酶a连接酶GydF4y2Ba

计算机辅助设计:GydF4y2Ba

肉桂醇脱氢酶GydF4y2Ba

WT：GydF4y2Ba

野生型GydF4y2Ba

人力资源：GydF4y2Ba

超敏反应GydF4y2Ba

集成电路:GydF4y2Ba

Isochorismate合酶GydF4y2Ba

IPL:GydF4y2Ba

异分支酸丙酮酸裂解GydF4y2Ba

存在:GydF4y2Ba

定量实时聚合酶链反应GydF4y2Ba

磅:GydF4y2Ba

溶菌肉汤GydF4y2Ba

RT:GydF4y2Ba

室内温度GydF4y2Ba

我们感谢西北农林科技大学园艺学院对实验室和仪器的支持。GydF4y2Ba

陕西省科技计划项目(批准号:2019NY-011);中央财政林业科技推广示范项目(批准号:SLTG[2019] 05-2);试验示范站科技推广重点项目(批准号:XTG2019-17)。支持者在研究设计、数据收集、数据分析、数据解释、手稿写作或决定发表方面没有作用。GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

1. 园艺，西北农林科技大学，杨凌，712100陕西省，中国的大学GydF4y2Ba

   成林梁，田丸，Rendun吴，赵梅，赵悦和蔡渔梁GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

CL和YC构思了项目，设计了实验;CL进行实验，分析数据，撰写初稿;TW和RW制备了实验材料;MZ和YZ参与了手稿的编辑工作。YC协调了这个项目并编辑了手稿。所有作者都已阅读并批准了最终稿。GydF4y2Ba

相应的作者GydF4y2Ba

对应到GydF4y2BaYuliang蔡GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

同意出版GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

相互竞争的利益GydF4y2Ba

作者声明他们没有相互竞争的利益。GydF4y2Ba

出版商的注意GydF4y2Ba

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。GydF4y2Ba

开放获取GydF4y2Ba本文根据创意公约归因于4.0国际许可证，这允许在任何中或格式中使用，共享，适应，分发和复制，只要您向原始作者和来源提供适当的信贷，提供了一个链接到Creative Commons许可证，并指出是否进行了更改。除非信用额度另有说明，否则本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创造性公共许可证中，除非信用额度另有说明。如果物品不包含在物品的创造性的公共许可证中，法定规定不允许您的预期用途或超过允许使用，您需要直接从版权所有者获得许可。要查看本许可证的副本，请访问GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba．创作共用及公共领域专用豁免书(GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba)适用于本文提供的数据，除非在数据的信贷额度中另有说明。GydF4y2Ba

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