结合蛋白质组学、代谢组学和生理分析对干旱前后重施氮水稻生长和产量的影响

背景

施氮可有效减轻干旱对作物生长和产量的损害。然而，旱前重施氮和旱后重施氮在调控水稻对干旱胁迫反应中的作用仍存在争议。本研究以水稻品种五峰优286为材料，通过生理、蛋白质组学和代谢组学分析两种氮肥管理模式(NBD和NAD)的产量形成及其对抗旱性的调控机制。

结果

结果表明，在幼穗分化期遭受干旱胁迫，NBD和NAD的产量显著下降，而2017年和2018年NBD的产量分别比NAD高33.85和36.33%，达到显著水平。干旱条件下，与NAD相比，NBD提高了叶片叶绿素含量和净光合速率，显著提高了超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶和过氧化氢酶等抗氧化酶活性，降低了丙二醛(MDA)含量。NBD促进了叶片氮素同化，表现为硝态氮还原酶(NR)和谷氨酰胺合成酶(GS)活性增加。此外，NBD还显著提高了可溶性糖、可溶性蛋白和游离脯氨酸等渗透调节物质的含量。对234个差异表达蛋白和518个差异代谢产物的基因本体论和KEGG富集分析表明，不同的氮素管理导致光合途径、能量代谢途径、氮素代谢和氧化还原途径发生强烈变化。

结论

不同施氮方式对水稻抗旱性有显著差异。这些结果表明，干旱前重施氮肥可能是提高水稻产量和抗逆性的重要途径，并为水稻氮素调控提供了新的生态学视角。

干旱是导致作物减产的主要环境因素，干旱造成的损失大于其他环境胁迫的总和[1]．不同程度的干旱压力通常导致叶子中的气孔闭合，防止转移CO₂从空气到叶片的细胞间细胞和叶肉细胞[2，3.]．丝纤维 - 1,5-二磷酸（镁镁）与低浓度的CO合并₂在核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)作用下，经过一系列反应，经NADPH还原生成甘油醛-3-磷酸(PGAld)。由于CO的同化₂消耗NADPH并减少NADP的水平⁺光合作用过程中电子传递的变化，限制了叶片的光合速率。氧作为叶片中重要的电子受体，导致活性氧(ROS)的快速积累，如单线态氧(O₂^-),过氧化物(^•O₂)、羟基(哦^{- 1})和过氧化氢(H₂O₂)，对抗氧化代谢产生负面影响，导致细胞过氧化损伤[4，5，6]．抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD），过氧化物酶，过氧化氢酶，通过调节其基因表达和活性，在干旱胁迫下在植物抗氧化代谢中起着核心作用[7，8，9]．干旱胁迫还影响与碳氮同化有关的酶的活性，包括蔗糖合酶(SS)、硝酸还原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸脱氢酶(GDH)和转氨酶，引起植物碳氮化合物的变化，影响植物对干旱胁迫的抵抗力[10.，11.，12.]．干旱胁迫也促进了植物细胞中抗旱基因的表达。它导致功能蛋白的积累，如膜蛋白(水通道蛋白)、渗透调节分子(包括蔗糖、脯氨酸和甜菜碱)、大分子保护因子(如热休克蛋白、分子伴侣、mRNA结合蛋白)[13.，14.]和过量规范蛋白质（包括转录因子，蛋白激酶）[15.，16.]．

近年来，N作为信号因子在调控植物抗逆性中的作用引起了研究者的广泛关注[17.]．N调控植物抗逆性的作用与N的吸收和分配过程密切相关[18.]．合理增加施氮量可显著改善干旱胁迫对水稻光合作用的负面影响[19.，20.]．适当的高氮水平可以提高气孔对干旱胁迫的响应阈值，保持光合作用的完整性[21.]，改善根系开发中的弹性，增强植物抗氧化能力[22.]．相关的研究报告已经出现在农作物上，例如水稻[23.]，玉米［24.]，芸苔CameStris.［25.] 和小麦［26.]这表明适当高水平的氮肥可以有效缓解干旱胁迫并降低产量损失。农民有两种主要方式施加氮肥以改善作物的抗旱性。在干旱之前，一种是氮肥的繁重应用[27.，通常用来应对季节性干旱。另一种是干旱后大量施用氮肥[28.]，多见于“雨养田”水稻上，主要用于对不规则干旱的补救措施[29.]．

蛋白质组学和代谢组学是对各种环境刺激的植物反应分析的强大工具[30.]．这些方法可以有效地改进对代谢网络和蛋白质调节机制的深入分析[31.]．蛋白质组学和代谢组学已被广泛应用于水稻叶片干旱响应途径的研究(栽培稻l .)、玉米(玉米）和杜兰姆（小麦属植物硬质） 小麦 [32.，33.，34.]．然而，两种施氮方式对水稻干旱胁迫响应的有效性仍存在争议，结合蛋白质组学、代谢组学和相关生理指标研究干旱前后重施氮肥缓解水稻产量损失的机制较少。本研究以水稻品种五峰优286为试验材料，采用干旱前重施氮和干旱后重施氮两种氮素管理模式。选择幼穗分化期作为干旱处理的时间点。为确定NBD和NAD缓解干旱对水稻产量的影响，对生理指标、蛋白质组学、代谢组学分析及产量进行了研究，为干旱条件下水稻氮素调控管理提供理论参考。

产量及产量构成因素分析

2017年，干旱胁迫下单株NBD产量显著高于NAD，显著低于CK (p< 0.05)（Table1）.结果表明，双熟早稻幼穗分化期是水分亏缺的敏感期。与NAD相比，NBD单株产量提高了33.85%，达到显著水平(p< 0.05)。从产量组分的角度来看，与NAD相比，NBD的种子设定率高（较高）16.09％（p< 0.05)，单株有效穗数、每穗总粒数和千粒重分别提高6.03、7.65和1.07%。2018年不同处理的产量及产量构成要素与2017年基本相似(表1)1）.CK的单株产量显著高于NBD和NAD (p< 0.05)，单株产量比NAD高36.33% (p< 0.05)。在产量构成因素上，NBD的每穗总粒数和结实率分别比NAD高11.73和14.61% (p分别为< 0.05)。因此，在两个评价年份中，NBD和NAD组的产量和产量构成因素具有可比性。结果表明，在干旱胁迫下，NBD有利于减少水稻的产量损失，其增产的主要原因是结实率和每穗粒数的增加。

干物质、氮的吸收和分配分析

干旱胁迫下，不同氮肥管理对水稻茎、叶和穗干物质积累的影响不同2）.抽穗期，NBD的茎、叶和穗干物质积累量分别比NAD高21.15、52.38和20.93%。NAD在穗部的干物质分配显著低于CK和NBD (p< 0.05)。在成熟的阶段，NAD穗中的干物质积累显着下降，分别低于NBD和CK的27.46％和41.77％。NAD的茎和叶片干物质积累均高于CK和NBD的变化。茎和鞘物质（EPMS）的出口百分比（EPMS）和转化百分比的茎和鞘物质（TPMS）的百分比在CK中为阳性，而那些在NBD和NAD中是阴性的。结果表明，NAD中的光合作用累积的部分稳定化学能量在茎中积聚，并未有效地运输到穗上。

抽穗期，CK和NBD的茎、叶和穗的氮含量显著高于NAD(表2)3.）.NAD处理穗部、茎部、叶部和地上部氮素积累量分别比对照低56.34、48.96、46.21和48.81%，比对照低40.16、31.77、37.78和36.21%，差异均极显著(p< 0.05)。成熟期，NAD植株穗部、茎部和叶片氮素积累量分别比NBD高11.57、44.13和88.14%。NAD植株茎叶氮素积累率显著高于CK和NBD (p< 0.05)。CK穗部和地上部氮素积累量均显著高于NBD和NAD。

光合作用相关参数分析

NBD的净光合速率比NAD的净光合速率高于17.9％，达到显着差异（图。1一种）。NBD和NAD的净光合速率比CK的净光合速率为22.98％和34.33％（p分别为< 0.05)。CK，NBD和NAD的气孔导度为436,359和293mmol / m²在干旱胁迫结束时，CK和NBD和NAD之间的差异显着。NBD的气孔导率比NAD高21.52％（p< 0.05)。NBD的叶绿素含量高于NAD的10.03％，差异很大（图。1b). CK的叶绿素含量比NBD和NAD分别高13.94和25.96% (p分别为< 0.05)。

抗氧化酶活性及可溶性蛋白分析

与CK和NAD相比，NBD的SOD、过氧化物酶和过氧化氢酶活性显著升高(图2)。1NBD的SOD活性比NAD和CK分别高20.09和40.92%，差异显著。过氧化物酶活性方面，NAD和CK分别比NBD低24.04和48.11%，差异极显著。NAD和CK的过氧化氢酶活性显著低于NBD的29.08和44.95% (p分别为< 0.05)。可溶性蛋白含量方面，NBD比NAD和CK分别高22.52和42.66%，差异显著(图2)。1f)。

渗透调节物质分析

干旱结束后，NBD中可溶性糖和游离脯氨酸的含量明显高于NAD和CK中的含量（图。2a, b). NBD的可溶性糖和游离脯氨酸含量分别比NAD高18.38和33.33%，差异极显著(p< 0.05)。NBD和CK显着降低了MDA含量低于NAD（图。2c），NBD比NAD低22.87％。

与氮代谢相关的酶活性分析

NBD和CK的NR和GS活性显著高于NAD。2酶活性方面，NBD和NAD的NR活性分别比对照低17.88和34.58%，GS的活性分别比对照低17.92和38.01%。NBD的NR和GS活性分别比NAD高25.53和32.31%，差异显著(p< 0.05)。NAD和CK的GDH活性显着低于NBD（图。2f)， NAD的GDH活性比NBD低18.85%。

TMT蛋白组学分析

利用TMT标记NBD和NAD处理的水稻叶片进行蛋白质组学实验。每个样品经LC-MS/MS检测后，定性蛋白和定量蛋白的数量分别为4254和3892。用LC-MS对酶解标记的样品进行分析，并在数据库中检索。通过TMT实验筛选出3548个可信蛋白。通过对NBD和NAD样本的对比分析，我们发现PCA评分可以解释73.5%的NAD和NBD的分离(图。3.)，因此PCA可以可靠地解释NAD和NBD样品之间的蛋白差异。此外，我们通过聚类分析可视化了NBD和NAD中不同点的差异表达蛋白(DEPs)(图)。4)，结果进一步表明数据是可信的。

DEPS的功能分析

基于所选择的可信蛋白质，具有折叠变化> 1.3的蛋白质被视为上调（p< 0.05)，倍数变化< 10/13者视为下调(p< 0.05)［35.]．因此，这些DEPs被认为是NBD和NAD的响应蛋白，在NAD和NBD组间共衍生出234个DEPs(47个上调，187个下调)(数据集S1）.在NAD和NBD之间的DEPs中，有36个上调蛋白和105个下调蛋白已被基因本体注释，其余DEPs未被注释。数字5显示了NAD-NBD的dep的火山图。

为了进一步分析NBD和NAD之间的DEPS的功能特性，首先为基因本体函数注释141AD，然后在三个水平分析：生物过程，细胞成分和分子功能。根据DEPS基因数量的重要性分析，生物过程中的前三项是单生物代谢，氧化还原和小分子代谢过程。细胞组分中的前三个项目是细胞质，细胞质部分和叶绿体。分子功能的前三个项目是催化活性，氧化还原酶活性，并在过氧化物上作用，作为受体，过氧化物酶活性（图。6）.然后对DEPs进行KEGG通路分析，结果表明，参与NAD和NBD的主要KEGG通路包括:次生代谢产物的生物合成、碳代谢、氨基酸的生物合成、谷胱甘肽代谢、光合生物固碳和氮代谢(图S1）.进一步分析差异蛋白与KEGG通路之间的蛋白相互作用，绘制蛋白相互作用网络图(图S1）.结果表明，部分上调的微分蛋白A0A088BV97，O22438和Q0D3N3与Keeg途径相互作用，包括次级代谢物生物合成，碳代谢，代谢途径和NAD和NBD中的氨基酸生物合成。

代谢物的概要文件

首先，在NAD和NBD样品上进行PCA，结果表明，该模型在解释两组之间的代谢差异是可信的（图。2一种）;PLS-DA模型可以更好地解释NAD和NBD样品之间的差异（图S2B);NAD和NBD样品在OPLS-DA评分图上有光谱分离(图S2C)，最后对OPLS-DA模型进行200次响应排序检验，结果表明该模型没有过拟合(图S)2d）。差分代谢物（DMS）和差分蛋白的筛查标准是相同的。因此，DMS被认为是NBD和NAD响应性代谢物。总共，从NAD和NBD组之间的米叶中筛选518dms（296调节和222个下调）（DataSet s2）.然后，利用DMs的KEGG ID进行通路富集分析，结果表明DMs在光合生物通路中的卟啉和叶绿素代谢、柠檬酸循环、代谢通路和固碳通路中均显著富集。关于dm的更多信息包含在数据集S中2．为了更清晰地显示NAD和NBD样本中代谢物表达模式的差异，我们使用DMs表达对每组样本进行分层聚类(图S3.）.说明NAD和NBD植物在代谢水平上对水分胁迫有不同的响应。表中显示了KEGG通路在DEPs和dm中显著富集4．此外，通过omicbean平台构建了差异蛋白、DMs和代谢途径的相互作用网络图(图2)。7)，根据重要性对代谢途径进行排序:代谢途径;次生代谢产物的生物合成;丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代谢;氨基酸的生物合成;精氨酸生物合成;卟啉、叶绿素代谢和碳代谢途径。

干旱前后重施氮肥对产量和生理生化的影响

干旱胁迫通常导致谷物数减少，种子设定率和水稻产量[20.]．以前的研究表明，不同的氮施用率和氮气管理可以调节干旱胁迫下的作物水和产量[19.，36.]．在干旱条件下适当高水平的氮能促进水稻根系发育，减少产量损失[37.]．本研究发现，2017年和2018年NBD的产量显著高于NAD。NBD的增产主要是由于结实率和每穗粒数的增加1）.增加N肥料应用的水平可以有效提高植物的抗氧化能力[38.]．结果表明，NBD和NAD的过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性显著高于CK，而NAD的过氧化物酶、过氧化物酶和过氧化氢酶活性显著低于NBD。干旱胁迫后MDA的大量积累表明水稻植株的膜结构受到了一定程度的破坏。NBD中抗氧化酶活性的提高有利于缓解叶片损伤，与NAD相比，MDA含量显著降低(图2)。2c).适当高氮水平可以协调碳氮代谢，缓解水分胁迫对光合作用的抑制[21.]．本研究表明，NBD处理的叶绿素含量和净光合速率显著高于NAD处理。这也表明，NBD可以改善干旱胁迫对水稻光合作用的不利影响，这种缓解作用有利于干物质的生产和积累，这与NBD的产量和干物质结果一致(表)2）.在干旱胁迫下，水稻叶片、茎、穗和根系的干物质分布存在显著差异，这也改变了根冠比之间的关系[39.]．在标题阶段，NBD茎，叶片和穗茎的干物质积累明显高于NAD。在成熟的阶段，NBD的穗和TPMS中的干物质积累高于NAD，这提供了通过NBD增加产量的保证。高水平氮的应用增强了NO的同化_3.^-和NH₄⁺并增加与氮代谢有关的酶的活性[22.]．该研究表明，NBD治疗中NR和GS和可溶性糖和游离脯氨酸含量的活性显着高于NAD，GDH活性明显低于NAD中的GDH活性。这与NBD的每个器官中的氮积累明显高于标题阶段的NAD（表3.）.结果表明，NBD有利于提高水稻氮素代谢相关酶的活性和渗透调节物质的含量，在水稻对干旱胁迫的适应中发挥重要作用。Huang等人发现氨基酸和可溶性蛋白的积累有利于提高植物抗旱性[40，我们的研究结果也与他们一致。因此，NBD有利于维持水稻的光合势，协调水稻碳氮代谢，对提高水稻的耐受性和产量形成具有重要作用。综上所述，水稻在水分胁迫下的损伤机制和抗旱性机制是一个复杂的过程。植物应对缺水主要有三种策略:避旱、避旱和耐旱[41.，这将影响植物对干旱胁迫反应的发展。NBD通过调控水稻抗旱性机制，促进渗透调节物质的积累，提高抗氧化酶的活性，为植物生理活动的维持提供保障。此外，在水稻穗分化期，严重的干旱对水稻造成了强烈的伤害，对植株造成了不可逆的伤害，两种施氮方式无法补偿正常产量。今后的研究以不同施氮量调节水稻产量和抗逆性途径为目标，将更好地阐明氮肥在水分胁迫下维持产量形成中的确切作用。

干旱前后重施氮肥对光合作用的响应

干旱对植物的影响主要是通过影响光合作用，而光合作用对干旱胁迫的反应是极其复杂的[42.]．在轻度和中度干旱胁迫下，气孔导度和叶肉导度的降低直接影响光合同化能力，导致叶绿体对CO的利用减少₂，或由于光合新陈代谢的变化[43.，44.]．以前的研究发现，植物的光合速率随着N浓度的增加而增加，并随着土壤水分含量降低而降低[45.]．水氮相互作用对光合作用的影响已经在许多作物中观察到[46.]．光收获叶绿素A / B结合蛋白（LHCBS）是光系统II（PSII）复合物的载脂蛋白。这些叶绿体/囊体蛋白被核基因编码，它们的表达主要受环境和发育因素的调节[22.]．本研究中，与NAD相比，NBD的叶绿素a-b结合蛋白(蛋白ID: A2WS81, A2YMN1, Q7M1S8)显著上调(p< 0.05)。在农业生态系统中，增加施氮量可以缓解作物光合能力的限制，可以将更多的N分配给光合蛋白质，进一步提高作物光合氮的利用效率[47.]．本研究表明，NBD的光调节蛋白(蛋白ID: Q03200, A2Y886)含量明显高于NAD。这与抽穗期NBD叶片氮素积累显著高于NAD的结果一致。严重干旱胁迫通过氧化胁迫导致光合作用的非气孔限制，抑制了叶片中rubisco酶和电子传递复合物的功能，从而影响光合作用机制[48.]．在本研究中，NBD中二磷酸核酮糖羧化酶相关蛋白(蛋白ID: A6N182)的表达显著上调(p< 0.05)。结果表明，在小穗分化期间米饭遭受严重的干旱后，叶绿素和净光合速​​率的参数可通过限制气孔开口，抑制PS II光反应和电子传输过程，降低细胞间二氧化碳浓度49.]．干旱前大量施氮有利于光合色素和二磷酸核酮糖羧化酶等相关蛋白的合成和表达，增加气孔开度，维持较高的电子传递速率和rubisco酶活性。从而保护了光合作用的生化过程，增强了水稻对干旱胁迫的适应性。

一般代谢在干旱前后对重氮施用的反应

N对植物抗旱性的调控与施氮量和胁迫强度有关[50.]．前人研究发现，适宜的高施氮肥水平促进了植株根系对硝酸盐的吸收和分配，有效提高了植株的抗逆性[51.]．本研究表明，在抽穗期，NBD各器官和地上部的氮素积累量显著高于NAD。Nagy等认为GS可以作为植物抗旱性的重要代谢指标[52.]．过表达NR和GS1基因可显著维持植物氮素同化能力，提高植物抗旱性[53.]．本研究表明，与NAD相比，NBD处理显著提高了氨基酸合成和氮代谢相关蛋白(蛋白ID: Q2QN11, P93402)的表达，这与NBD处理提高了NR、GS等关键氮代谢酶活性是一致的。这说明NBD中的氮代谢酶促进硝态氮和铵态氮的同化，合成渗透物质脯氨酸等化合物，维持细胞水分平衡。此外，还原NO_3.^-叶片能更有效地消耗能量，这对于增强叶片在干旱条件下的热能耗散，缓解过剩光能对光合作用的抑制具有重要作用[54.]．在水分压力下，nh₄⁺植物组织中的积累是由蛋白质水解增加和增强的轻呼吸，而过量的NH₄⁺累积对植物是有毒的[55.]．GDH能直接催化NH的缩合反应₄⁺与α-酮戊二酸(α-OG)结合形成NH中的Glu₄⁺同化途径，从而降低NH的不良反应₄⁺在水稻上[56.]．本研究表明，NBD的GDH活性显著高于NAD，相关代谢酶蛋白(蛋白ID: Q7Y0E0)表达显著增加。氮作为有机渗透调节物质合成的重要元素，在改善植物农艺生理特性方面起着关键作用[50.]．钟等。证明，较高的氮施用水平增强了水稻适应性对干旱胁迫，如血液疗程增加和叶片中的脯氨酸含量增加[22.]．该研究表明，与NAD相比，NBD显着增加了蔗糖合酶相关蛋白（蛋白ID：A2YA46）和羧酸还原相关蛋白（蛋白质ID：A6N182）的表达，这与可溶性糖和游离脯氨酸含量的增加一致。这表明NBD促进了游离脯氨酸作为分子伴侣，以稳定细胞膜的完整性和蛋白质结构，并增加渗透调节物质，例如可溶性糖以调节细胞渗透潜力。

干旱前后重施氮肥对抗氧化反应的影响

在干旱胁迫下呼吸链中的电子转移堵塞导致反应性氧物种如h的过度积累₂O₂，O.₂·ˉ和细胞内的氮氧化物[9]，引起严重的氧化应激，导致细胞内膜结构和细胞器的氧化损伤[4]．干旱胁迫在植物抗氧化酶系统中增加了过氧化氢酶，SOD和谷胱甘肽过氧化物酶的活性[38.]．增加N肥料应用的水平可以进一步增强植物的抗氧化能力，抑制膜过氧化，缓解叶过氧化损伤的加重[57.]．该研究表明，响应于氧化还原方法，反应性氧代谢性源和氧化应激，显着富集NBD和NAD的生物过程，如差异蛋白质基因本体富集所证明的（图。6）.NBD治疗显着提高了与NAD相比过氧化物酶相关蛋白（蛋白ID：A2YPX5，A3REN3，Q5U1N4）的表达，这与抗氧化酶如过氧化物酶，SOD和过氧化氢酶的增加的增加一致。MDA是膜脂质过氧化的最终产物，其含量的变化是血浆膜损伤程度的重要指标之一[6]．该研究表明，NBD显着降低了脂氧合酶相关蛋白（蛋白质ID：A2XL22）的表达，这与NBD中的MDA含量的降低一致。这表明严重的干旱诱导植物中叶细胞膜和电解质渗漏的崩解，NBD可以有助于减轻脂氧基酶在膜脂质过氧化中的累积，并减少对细胞膜系统的损伤。谷胱甘肽系统在可活性氧物种和生物保护中发挥着重要作用[58.]．该研究表明，与NAD相比，NBD显着上调了谷胱甘肽过氧化物酶相关蛋白（蛋白ID：Q10L56，B8ASV8）的表达。谷胱甘肽是抗坏血酸 - 谷胱甘肽循环的基本组分，并且增加了NBD中的谷胱甘肽过氧化物酶活性促进了严重干旱下细胞内氧化还原潜力的维持，并且还催化了H的减少₂O₂和脂质过氧化，从而保护叶片免受环境应激产生的活性氧物质毒性。这表明，在干旱条件下植物抗氧化系统中N的调节涉及多种机制（图。8）.干旱前重施氮肥提高了抗氧化酶系统中过氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性，增加了抗氧化非酶系统中还原型谷胱甘肽的含量和抗坏血酸/脱氢抗坏血酸比值。这对于维持干旱胁迫下细胞的氧化还原状态和信号转导，在一定程度上有效缓解氧化应激，最终保护光合作用的生化效应，提高产量具有重要作用。

不同施氮方式对水稻抗旱性有显著差异。结果表明，在水稻青少年穗分化阶段的干旱胁迫下，干旱前后的重氮施用对产量，生理和生化参数，蛋白质和代谢机制不同。与大氮施用后的重度氮施用相比，在水稻品种武信沟286，重氮施用前脱脂率明显增加产量，净光合速率，叶绿素和渗透叶片的血液含量，以及抗氧化酶和氮的活性在不同程度上也增加了代谢酶，这有助于缓解光合作用和叶片脂质过氧化的抑制，最终提高产率。234ACE和518DMS与光合途径，氧化还原途径，蔗糖代谢和氮代谢途径以及抗性相关蛋白质密切相关。这些结果表明，干旱前的重氮施用可能是改善水稻耐受性的重要途径，并提供了一种新的生态视角，就氮气对水稻水进行调节的影响。

植物材料

吴峰友286（五峰A /中辉286，栽培稻L.）是江西大型种植区的水稻品种之一，是华南地区的主要产区。在这项研究中，由中国水稻研究所的武信楼286武功286次进行实验材料。2017年和2018年，该实验是在江西省江西省江西省农业大学进行的（28°45'N，115°49'e，平均年降雨量：1650毫米，年平均气温：17.7°C）。在塑料桶中培养米植物，高25.0cm高，30.0cm上径和23.5cm底部直径。实验土壤为0〜20厘米的表土，这是几年的未使用的荒地。2017年和2018年土壤的物理和化学特征如表所示5．土壤自然干燥后，用FT-1000A土壤崩解机(山东阿贝尔仪器有限公司)进行粉碎。然后用100毫米的筛网进行筛分。移栽前先淹土2周。在四叶期，将生长良好、一致的水稻秧苗移栽到桶中，按每桶三苗、每孔一苗的规格种植。结合植株营养需求，每桶施用钙镁磷肥5.0 g，氯化钾1.0 g作为基肥。以尿素为氮源，每桶施氮5.0 g，用量为180 kg·hm^{- 2}．根据实验设计，在移植前将混合幼苗阶段肥料加入铲斗中，并且其余的氮肥与每个生长阶段的灌溉组合施用。在移植前，该领域均匀管理，并且在移植后，根据高产培养的方式进行植物，水，疾病和虫害。每次受精后要注意天气变化，塑料桶被移动到雨雨中的雨伞，以避免水溢出引起的肥料元素的损失，铲斗直接在雨后返回外部空间停了下来。

实验治疗

根据以往的研究结果，双季稻在幼穗分化阶段极易受到干旱胁迫[59.]．因此，在青少年分化的阶段选择了武信元286种品种，为干旱胁迫。2017年，早稻稻在3月16日播种并于4月26日移植.2月25日的两种治疗方法，5月14日的Tiller肥料和胰蛋白肥料。2018年3月15日播种了早稻米并于4月25日移植。分别于4月24日，5月13日和6月13日植物肥料施用基础肥料。根据实验设计，对于NAD植物，将1g氮肥施用为基础肥料，将1克氮肥施用为耕作肥，3克氮肥施用为穗肥。对于NBD和对照处理（CK），将1g氮肥施用为碱肥料，将3克氮肥施用为耕作肥，施用1克氮肥作为穗肥（表6）.CK植株在生育期保持3 ~ 5 cm水层，各处理在收获前1周进行破水处理。2017年和2018年干旱胁迫期间的平均气温分别为26.1℃和24.9℃，平均相对湿度分别为81.6和77.1%。干旱胁迫,水桶中的水的NAD和NBD植物被手动倾斜倒出,然后进入玻璃房子十天的干旱(年轻的茎长绒毛的增长点,和小穗的长度是1毫米)。土壤水分监测采用JK710土壤水分测定仪(测量范围:0-50%，北京华西泰创科技有限公司)。对不同处理组的土壤施加渐进干旱胁迫，每晚测定不同处理组的土壤含水量。随着干旱胁迫的进行，不同处理组的叶片开始枯萎卷曲，土壤表面变得块状开裂。土壤含水量< 5% (m^3./ M.^3.)达到NAD组和NBD组(模拟严重干旱)的严重干旱标准。干旱结束后，将NAD植株和NBD植株从玻璃房移出，分别进行复水和施用穗肥(见表2)6）.根据随机块设计，NAD和NBD处理都是用3个重复进行的，每个物质含有20个桶。

产量和产量组分

在成熟的阶段，从每个治疗组中选择7种具有一致生长的水稻植物，并且它们均分离它们的圆锥，叶和茎。在阳光下风干后，研究了每株植物的产量和产量组分（每株植物的有效胰腺的数量，种子设定率，穗长，1000粒重量）。

干物质积累、分配和转运

每个处理在抽穗期和收获期选择5株生长状况相同的水稻植株，将叶片、穗部和茎部分开包装后进行碾磨。然后将它们放入80°C的烤箱中干燥至恒重。成熟期，自然晒干至恒重，重量均匀。根据文献计算茎鞘物质出口百分比(EPMSS)和茎鞘物质转化百分比(TPMSS) [59.]．

氮素积累计算

氮含量按微量凯氏定氮法测定[60.]．大米（全植物茎，叶和穗）的器官被高速粉碎机（浙江荣豪工业和贸易有限公司，中国）粉碎，加热了0.5g粉末样品并用硫酸消化和催化剂并用腐血氮素测定器分析（FOSE KJELTEC 8400，Danmephus Analytical仪器有限公司）。

SPAD值

用手持SPAD-502叶绿素仪(叶绿素仪SPAD-502 Plus，浙江拓普科技有限公司)测定第二叶上叶的SPAD值。干旱胁迫后，选择5株生长稳定的水稻植株，对每个处理进行标记。取叶顶、叶中、叶基的平均值作为叶片的SPAD值。

净光合速率

干旱结束后测定净光合速率。叶片的净光合速率是使用9:00至11:00的CI-340光合作用者（CID Bio-Science）测定。在晴朗的一天。在每种治疗中，选择5种植物的前第二叶，并选择具有良好且一致的生长标记和测量。

渗透调节物质和酶活性的测定

叶片标本于干旱处理结束后的同一天采集。各渗透调节物质的测定原则如下:采用蒽酮比色法测定可溶性糖[61.]可溶性蛋白质含量[62.通过BCA方法确定，丙二醛（MDA）含量[63.[硫氨基吡啶酸法测定，以及自由脯氨酸的提取[64.]，按磺基水杨酸法进行(实验所用试剂盒由苏州科明生物技术有限公司提供)。

测定酶活性的步骤是每个处理组取3株水稻主茎上第二叶的0.1 g叶片样品。然后将叶片样品直接用液态N冷冻，置于−80°C冰箱中保存。硝酸还原酶(NR)活性[65.]，谷氨酰胺合成酶（GS）[66.]和谷氨酰胺脱氢酶（GDH）[62.用套件（Comin，China，中国）确定。

代谢产物提取和数据分析

在干旱结束后的第一天，对不同施氮量的水稻叶片进行取样。每个处理组取8个生物重复。准确称取NAD和NBD各样品80 mg，加入内标并研磨;离心15 min后提取上清200 μl，低温保存至液相色谱-质谱(LC-MS)测定。在整个LC-MS分析过程中，每8个样品均注入qc以评估分析的重复能力。使用转换软件MS converter将原始数据转换为常用数据格式文件mzML，并使用XCMS软件(版本号:1.50.1)进行代谢数据的峰提取。然后目测所有叶片样品的基峰色谱图后，进一步去除QC样品中相对标准偏差(rsd)大于30%的变量。离子过滤后共得到正离子3882个，负离子3199个，筛选率分别为89.91和94.95%。特征产率超过75%，证明代谢组学方法是可靠的。

蛋白质提取和数据分析

NBD和NAD在3个生物重复中进行(每次重复选择同一桶植物)。提取蛋白质时，将样品用液氮研磨成粉末，然后按照蛋白质样品的提取工艺进行酶解消化[67.]．通过在萃取后使用BCA试剂盒进行蛋白质浓度测量。同时，通过SDS-PAGE电泳可视化每个蛋白质样品的蛋白质带，透明和均匀，蛋白质没有降解，并且每个车道具有良好的并行性（图。4）.样品经安捷伦1100高效液相色谱后反相色谱质谱分析。使用Proteome Discoverer™2.2 (Thermo, USA)对实验获得的数据进行分析，使用的数据库为Uniprot GOA大米数据库(www。http://www.ebi.ac.uk/goa/）.

统计分析

SPSS 19.0 (v20.0, SPSS Inc.，芝加哥，美国)和Origin 9.0进行显著性差异分析和绘图;p< 0.05表示方差检验结果显著。

本研究期间生成或分析的所有数据都包含在本发布的文章及其补充信息文件中。

NBD:

干旱前大量施氮

nad：

旱后重施氮肥

SPAD:

土壤和植物分析仪的开发

epm:

茎鞘物质出口百分比

及:

转化百分比的茎和鞘

MDA:

丙二醛

SOD:

超氧化物歧化酶

NR:

硝酸还原酶

g:

谷氨酰胺合成酶

GDH：

谷氨酸脱氢酶

PCA：

主成分分析

(O) PLS-DA:

（正交）部分最小二乘判别分析

DMs:

微分代谢物

DEPS：

差异表达的蛋白质

KEGG:

京都基因和基因组百科全书

不适用。

国家自然科学基金资助项目(no . 31360309, no . 31471441)。资助方在研究设计、数据收集和分析、决定发表或手稿准备方面没有作用。

作者指出

1. 杰杜和天华沉相等地贡献了这项工作。

从属关系

1. 江西农业大学农学院，作物生理生态与遗传育种教育部重点实验室，江西330045

   杰杜，天化沉，王强熊，长兰朱，小荣鹏，小鹏，孙汝，林务欧阳，建胜b，李小阳孙，孙阳，八胡园，郝瓜，雷忠和小东陈

贡献

XC，LZ构思和设计了研究。JD，TS和QX进行了实验。XS，LH，CZ XP，XH，JF，LO和JB贡献了新的试剂或分析工具。JD，DZ和HH分析数据。JD写了稿件。所有作者都阅读并批准了稿件。

相应的作者

对应到雷忠或Xiaorong陈．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

提交人声明他们没有利益冲突。

出版商的注意事项

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。

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