CRISPR-Cas9多重基因组编辑羟脯氨酸-gydF4y2BaO -gydF4y2Ba半乳糖基转移酶基因家族改变阿拉伯半乳蛋白糖基化和功能gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

阿拉伯半乳聚糖蛋白(AGPs)是一类富含羟脯氨酸的蛋白质(HRGPs)，与II型阿拉伯半乳聚糖(AGs)严重糖基化(> 90%)。AGPs参与了植物的生长发育过程，包括细胞扩张、体细胞胚胎发生、根和茎的生长、耐盐性、激素信号、雌雄配子体发育和防御等。到目前为止，8个Hyp-gydF4y2BaOgydF4y2Ba-半乳糖转移酶(GALT2-6, HPGT1-3)已被鉴定;这些酶负责将第一个糖，半乳糖，添加到agp上。由于基因冗余gydF4y2Ba高尔特gydF4y2Ba，单的还是双的gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba基因敲除突变体往往不足以充分揭示它们的生物学功能。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在这里，我们报道了成功应用CRISPR-Cas9基因编辑/多路融合技术，获得了5个基因的高阶敲除突变体gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba基因家族(gydF4y2BaGALT2-6gydF4y2Ba）.高阶AGPs分析gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba突变体(gydF4y2Bagalt2 galt5gydF4y2Ba，gydF4y2BaGALT3 GALT4 GALT6gydF4y2Ba,gydF4y2BaGalt2 galt3 galt4 galt5 gal6gydF4y2Ba)在莲座叶、茎和角果中糖基化的AGPs明显少于相应的野生型。从莲座叶中分离到的AGPs的单糖组成分析显示，阿拉伯糖和半乳糖在所有高阶均显著降低gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba突变体。表型分析显示有两个或两个以上的突变gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba这些基因能够克服β-D-Gal-Yariv试剂的生长抑制作用，而β-1,3-半乳聚糖在AGPs上特异性结合。除此之外gydF4y2BaGalt2 galt3 galt4 galt5 gal6gydF4y2Ba突变体表现为整体生长下降，根生长受损，花粉异常，果期缩短，结实率降低。互交实验证明gydF4y2BaGalt2 galt3 galt4 galt5 gal6gydF4y2Ba突变体的雌性配子体存在缺陷，导致结实率降低。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

与传统的T-DNA突变株遗传杂交相比，我们的CRISPR/Cas9基因编辑/多路融合方法提供了一种更简单、更快的方法来生成高阶突变体，用于功能表征。高阶gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba本研究中产生和特征的突变体提供了熟悉糖装饰和植物中AGPS之间的各种生物学功能之间的关系的洞察力。gydF4y2Ba

阿拉伯半乳糖蛋白(arabinogalactanproteins, AGPs)属于富含羟基脯氨酸的糖蛋白(HRGP)超家族，其特征是其II型阿拉伯半乳糖(arabinogallactan, AG)多糖链广泛修饰羟脯氨酸(hydroxyproline, Hyp)残基。AGPs在植物细胞表面起着重要的作用，在植物生长发育、细胞信号传导、伤害/防御和细胞程序性死亡中起着重要的作用[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]．agp通常包含双肽基序，如Ala-Hyp、Ser-Hyp、thra -Hyp、Val-Pro、Gly-Pro、thra - pro，并在不连续的Hyp残基上糖基化。将各种糖添加到agp中是一种逐步的方式，需要大量不同的酶的作用，称为糖基转移酶(GTs) [gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]．根据目前的模型，AGPS由β-1,3键连接的半乳​​糖基残基的骨架组成，与β-1,6-连接的半乳​​糖基和阿拉伯糖基残基（II型AGS）的分支组成;这些侧枝还含有其他较少丰富的糖，如β-（甲基）葡糖醛酸（Glca / Meglca），α-rhamnose（rha）和α-岩藻糖（FUC）作为末端残留物[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

到目前为止，8个Hyp-gydF4y2BaOgydF4y2Ba碳水化合物活性酶(CAZy) GT31家族的-半乳糖转移酶(GALT 2-6和HPGT1-3)被鉴定为催化第一个糖半乳糖添加到羟脯氨酸(AGPs)的Hyp残基上gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba．HPGT1-3在其蛋白序列中包含一个GALT结构域，而GALT2-6同时包含一个GALT结构域和一个GALECTIN结构域[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]．之前，我们的实验室研究了单突变体和双突变体(gydF4y2BaGalt2, galt3, galt4, galt5, galt6，gydF4y2Ba和gydF4y2Bagalt2 galt5gydF4y2Ba) for the fivegydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba基因。所有5个galt均显示Hyp-gydF4y2BaOgydF4y2Ba-半乳糖转移酶(GALTs)体外活性研究[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]．单gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba突变体显示较少的糖基化(即β-Gal-Yariv试剂沉淀)AGPs [gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]．而gydF4y2Bahpgt1 hpgt2 hpgt3gydF4y2Ba三重突变体表现出具有矮化表型，较长的根毛，较小的玫瑰花丝和较短的单片机，​​相应的肺炎效应gydF4y2BahpgtgydF4y2Ba单个突变体未表现出明显的异常表型[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]．此外，两者都是gydF4y2Bagalt2 galt5gydF4y2Ba双突变体,gydF4y2BahpgtgydF4y2Ba三重突变体分别在幼苗中的糖基化AGPS减少了〜40％和〜70％[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

另一种来自GT31家族的β-1,3-半乳糖转移酶KNS4/UPEX1最近被鉴定为GT31gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba；这种酶被认为与β-1,3-半乳糖骨架的合成有关[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]．不像其他的gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba和gydF4y2BaHPGTgydF4y2Ba已经提到的基因广泛表达gydF4y2BaKNS4 / UPEX1.gydF4y2Ba基因仅在花序分生组织中表达。突变体分析发现，KNS4是外壁形成的关键。的gydF4y2Bakns4gydF4y2Ba突变体表现为花粉塌陷，角果变短，育性降低[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]．另外两个galt, AtGALT29A和AtGALT31A也被发现具有将半乳糖附着到β-1,6半乳糖侧链的功能。AtGALT29A和AtGALT31A共表达时，协同作用形成蛋白复合物。另外,单gydF4y2BaGALT31AgydF4y2Ba突变体表现出异常的细胞分裂和胚胎致死表型[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]．来自GT37系列的两种α-1,2-岩藻糖基转移酶（FUTS），FUT4和FUT6，被证明负责将岩藻糖转移到AGPS中gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]．功能丧失gydF4y2BaFUT4.gydF4y2Ba或gydF4y2BaFUT6.gydF4y2Ba导致agp上的焦点和木糖减少，agydF4y2Bafut4 fut6gydF4y2Ba双突变体没有可检测的病灶，对盐胁迫敏感[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]．此外，另一种名为RAY1的GT被鉴定为β-阿拉伯呋喃基转移酶gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba尽管事实上只有α-AragydF4y2BafgydF4y2Ba据报道，改性agp存在于自然界中[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]．尽管如此,gydF4y2Baray1gydF4y2Ba突变体表现出减少阿拉伯呋喃（AragydF4y2BafgydF4y2Ba）AGPS中的残留物。该突变体还表现出较短的根长度以及矮化表型。值得注意的是，提及葡萄糖醛酸是一种相对较小的成分，并且AGPS中唯一带负电荷的糖。最近，三种葡糖醛糖基睾基转移酶（gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba）基因，gydF4y2Baglcat14a.gydF4y2Ba，gydF4y2BaGLCAT14B.gydF4y2Ba,gydF4y2BaGLCA.gydF4y2BaT14CgydF4y2Ba，通过与AGPs共表达分析，鉴定出GT43家族gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]．等位T-DNA插入突变体gydF4y2Baglcat14a.gydF4y2Ba,名叫gydF4y2Baglcat14a-1gydF4y2Ba和gydF4y2Baglcat14a-2,gydF4y2Ba显示β-glcat活性的降低，并且与野生型（WT）相比，ARA含量〜12％的ARA含量下降约12％gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba．两个突变体的根和下胚轴长度都增加了~ 30% [gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]．最近，人们发现GLCAT14A和GLCAT14B在种子萌发、根毛和毛状体的形成、种子粘液的形成、花粉的形状和角果的发育等方面都有多余的调控作用[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]．两个都gydF4y2Baglcat14a glcat14b.gydF4y2Ba和gydF4y2Baglcat14a glcat14b glcat14cgydF4y2Ba在莲座叶，茎和单片机中显示更多糖基化的AGP [gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]．此外，还有单倍、双倍和三倍gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba与WT相比，突变体展示了它们的AGPS的钙结合更少[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

AGP一般由约90%的碳水化合物和10%的蛋白质组成，因此AG多糖被认为在AGP的生物学功能中起着关键作用。但是，如前所述，至少有8个Hyp-gydF4y2BaOgydF4y2Ba来自GT31家族的耐受，可参与启动AGP糖基化。而且，单身gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba突变体只显示微妙或没有明显的表现型，和两个高阶gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba突变体(gydF4y2Bagalt2 galt5gydF4y2Ba和gydF4y2Bahpgt1 hpgt2 hpgt3gydF4y2Ba）仅在糖基化的AGP的量中分别减少。这提供了另一种证据gydF4y2Ba高尔特gydF4y2Ba补偿的时候是一个还是几个gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba基因是非功能性的，表明在这个家庭中存在基因冗余gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba5gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]．显然，这两个先前描述的高阶突变体并不足以充分阐明糖基化在AGP生物学功能中的作用。来解决这种基因冗余的问题gydF4y2Ba高尔特gydF4y2Ba，我们扩展了这项工作，并确定了另外两个更高阶的特征gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba突变体(gydF4y2BaGALT3 GALT4 GALT6gydF4y2Ba和gydF4y2BaGalt2 galt3 galt4 galt5 gal6gydF4y2Ba）由两个CRISPR / CAS9基因编辑/多路复用方法以及gydF4y2Bagalt2 galt5gydF4y2BaT-DNA突变体。我们的作品不仅证明了应用CRISPR-CAS9基因编辑技术为冗余基因家族创造高阶突变体的可行性，而且还提供了了解植物生长和繁殖AGPS对糖装饰的生物重要性的洞察力。gydF4y2Ba

5种galt (GALT2 -GALT6)的表达谱gydF4y2Ba

公开的rna测序数据来自KlepikovagydF4y2Ba拟南芥gydF4y2BaATLAS EFP浏览器（gydF4y2Babar.utoronto.cagydF4y2Ba)来比较这5种基因的表达谱gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba和三gydF4y2BaHPGTgydF4y2Ba不同发展阶段的基因gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]．基于RNA-SEQ数据，gydF4y2BaGALT2gydF4y2Ba，gydF4y2BaGALT3gydF4y2Ba，gydF4y2BaGALT5gydF4y2Ba，gydF4y2BaHPGT1.gydF4y2Ba,gydF4y2BaHPGT2.gydF4y2Ba在根，玫瑰花叶，花序和种子萌发和花发育期间表达。相比之下，gydF4y2BaGALT4gydF4y2Ba和gydF4y2BaGALT6gydF4y2Ba显示组织特异性表达模式。gydF4y2BaGALT4gydF4y2Ba在花发育过程中表达，而gydF4y2BaGALT6gydF4y2Ba仅在干燥的种子，衰老叶片，第一个池中和前两个单片机中表达。不像gydF4y2BaHPGT1.gydF4y2Ba和gydF4y2BaHPGT2.gydF4y2Ba在组织中广泛表达，gydF4y2BaHPGT3.gydF4y2Ba仅在花和种子中有中度表达。值得注意的是所有的gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba和gydF4y2BaHPGTgydF4y2Ba除了基因gydF4y2BaGALT6gydF4y2Ba与其他组织相比，在萼片和心皮中有较高的表达值。像大多数gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba基因在花发育过程中表达，预计它们将在植物繁殖中发挥作用。gydF4y2Ba

两种CRISPR/Cas9多路复用结构的设计gydF4y2BaGALT3，GALT4，gydF4y2Ba和gydF4y2BaGALT6gydF4y2Ba在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba

以前，我们的实验室的特征gydF4y2Bagalt2 galt5gydF4y2BaT-DNA双突变体gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba．进一步揭示二者之间的功能相关性gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba基因家族和AGPs的糖基化过程，我们利用CRISPR/Cas9多路复用方法进一步靶向gydF4y2Ba高尔特gydF4y2Ba．的gydF4y2Ba高尔特gydF4y2Ba来自Cazy GT31家族中的Clade 7的基因同源物，先前证明具有Hyp-gydF4y2BaOgydF4y2Ba-galt活性gydF4y2Ban .烟草gydF4y2Ba［gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]．瞄准多个gydF4y2Ba高尔特gydF4y2Ba，每个基因选择3个导向RNA (gRNA)靶位点gydF4y2BaGALT3，GALT4，gydF4y2Ba和gydF4y2BaGALT6gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa).然后使用两种多路复用方法将这些grna组装成两种CRISPR结构。用于第一个构建的方法是基于多顺反子tRNA-gRNA (PTG)系统，该系统最初是为水稻中的crispr多路复用而开发的[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab - 1)。一旦PTG单位在植物中被转录，内源性RNase Z和RNase P在tRNA位点上裂解，释放gRNAs结合到各自的靶标上。因为用于PTG结构的水稻tRNA序列是保守的gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，PTG系统也已应用于gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba用于多重基因编辑[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]．用于第二个构造的方法涉及四个gRNA盒，每个都有自己的启动子和终止子(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab - 2)。第二种结构中的grna通常针对这三个分子的更多上游区域gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba基因。第1和第2个构建片段均克隆到pHEE401E载体中，该载体含有玉米密码子优化的Cas9基因(zCas9)gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba蛋细胞特异性启动子（例如，与蛋细胞特异性增强剂（例如）融合（例如，E.C.1.2）[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

通过转化tRNA-gRNA结构(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab - 1)gydF4y2Bagalt2 galt5gydF4y2BaT-DNA双突变背景下，获得68个T1转基因株系。在这68个T1行中，有3个(#12、#25和#40)包含由in中3-1和3-2创建的部分删除gydF4y2BaGALT3gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2BaA和B）。令人惊讶的是，68 T1 CISPR线筛选中没有一个显示在6-1和6-2靶位点之间的缺失gydF4y2BaGALT6gydF4y2Ba．为了获得含有完全删除的突变体gydF4y2BaGALT3gydF4y2Ba，两个T1 CRISPR株系(#25和#40)中包含部分突变，被自交并用于生产T2株系。在T2中，来自#25的80%的子代遗传了T1的突变，其中36.7%的子代含有581 bp的缺失gydF4y2BaGALT3gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Bac).此外，来自#40的74%的子代遗传了该突变，其中8.7%的子代含有581 bp的缺失gydF4y2BaGALT3gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2BaC）。在T2中含有581bp缺失的几条线被自行自动化以产生T3。在T3中，所有12个来自＃40-10的随机选择的后代继承了581bp删除gydF4y2BaGALT3gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Bad).值得注意的是，# 40-10也包含纯合基因编辑事件gydF4y2BaGALT4gydF4y2Ba和gydF4y2BaGALT6gydF4y2Ba基因。gydF4y2BaGALT4gydF4y2Ba在其最后一个外显子中包含1 bp的插入(图4-1)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.与3-1和3-2不同，# 40-10中的6-1和6-2的基因编辑事件没有在两个位点之间产生基因缺失，但在两个位点上都有1 bp的缺失gydF4y2BaGALT6gydF4y2Ba基因（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

因为GRNA for.gydF4y2BaGALT4gydF4y2Ba(4 - 1),gydF4y2BaGALT6gydF4y2BatRNA-gRNA结构中的(6-1和6-2)位于GALECTIN结构域之后(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa)，我们不确定这些目标位点是否会完全消除相应的GT活性gydF4y2Ba高尔特gydF4y2Ba．为了确保突变体同时具有GALECTIN和GALT结构域失活，我们创建了另一个包含gRNAs的CRISPR结构体(图中的3-3、4-2、4-3和6-3)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba一种）;这些GNA所有通常都存在于两个催化结构域（Galectin和Galt）的上游（图。gydF4y2Ba1gydF4y2BaB-2）gydF4y2Ba．gydF4y2Ba通过将该基因构建变为gydF4y2Bagalt2 galt5gydF4y2BaT-DNA纯合突变体背景，获得一个Quintule突变线＃29-36，其在所有GRNA靶位点含有纯合突变，包括所有三种基因（gydF4y2BaGALT3gydF4y2Ba，gydF4y2BaGALT4gydF4y2Ba,gydF4y2BaGALT6gydF4y2Ba)，导致终止密码子过早成熟(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.因此，我们使用了这个＃29-36突变线而不是先前的Quintuple突变线（＃40-10）进行生化和功能表征。gydF4y2Ba

β-D-Gal-Yariv沉淀AGPs的定量gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba突变体gydF4y2Ba

以检验是否高阶gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba突变体含有较少（糖基化）AGPS，从莲座叶，茎和单片机中提取AGPSgydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba利用β-D-Gal-Yariv试剂特异性结合AGPs的β-1,3-半乳糖骨干糖[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]，并容许其量化[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]．对于wt和各种各样的gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba突变体，AGPs在SILIQUES中最丰富，茎和莲甜叶叶（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.不出所料，所有的gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba突变体的agp显著减少。两个都gydF4y2Ba23456gydF4y2Ba(五倍的突变体)和gydF4y2Bahpgt1 hpgt2 hpgt3gydF4y2BaT-DNA突变体(以下简称gydF4y2Ba789gydF4y2Ba与野生型相比，三组突变体)莲座叶(80%)和角果(55%)的agp含量减少gydF4y2Ba25gydF4y2Ba(即T-DNA双突变体)和gydF4y2Ba346gydF4y2Ba三重突变体表现出玫瑰花叶（40-45％），茎（30-40％）和单片机（15-16％）的较小程度的AGP减少程度（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）gydF4y2Ba．gydF4y2Ba事实如此gydF4y2Ba23456gydF4y2Ba显示了比gydF4y2Ba25gydF4y2Ba和gydF4y2Ba346gydF4y2Ba反映了gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba并强调了基于crispr的方法在产生高阶突变体以阐明其生物学功能方面的价值。gydF4y2Ba

单糖组成分析gydF4y2Ba

研究了不同类型的agp的糖组成gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba突变体，我们使用β-D-GAL-YARIV试剂从五周龄玫瑰花叶中纯化AGP，然后通过高性能阴离子交换色谱法与脉冲倍转检测（HPAEC-PAD）进行单糖组合物分析。的gydF4y2Ba25gydF4y2Ba双突变体gydF4y2Ba, 346年gydF4y2Ba三重突变体，和gydF4y2Ba23456年gydF4y2Ba与WT相比，5倍突变体Ara的表达量分别下降了~ 8%、~ 8%和~ 25%(图1)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）gydF4y2Ba．gydF4y2Ba同样，Gal含量也分别降低了~ 6%、~ 8%和~ 10%gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba346gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23456年gydF4y2BaAra和Gal的减少导致其他单糖如rhamose (Rha)、木糖(Xyl)和葡萄糖醛酸(GlcA)的相对增加(图1)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

根生长表型gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba突变体在正常情况下gydF4y2Ba

调查是否敲门gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba基因影响gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba测定根发育、主根和根毛长度gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba在½ms板上生长的突变体和WT幼苗。这俩gydF4y2Ba23456gydF4y2Ba五元突变体和gydF4y2Ba789gydF4y2Ba与WT相比，三重突变体表现出较短的原始根长度，而两者都是gydF4y2Ba25gydF4y2Ba和gydF4y2Ba346gydF4y2Ba根长度与WT相似(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba有趣的是，根毛gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23456gydF4y2Ba,gydF4y2Ba789gydF4y2Ba显著长于WT(图。gydF4y2Ba7gydF4y2BaB和D）。此外，两者都是gydF4y2Ba23456gydF4y2Ba和gydF4y2Ba789gydF4y2Ba与其他相比，在种子萌发中显示大约12小时延迟gydF4y2Ba加尔特gydF4y2BaAGP糖基化在种子萌发过程中起着关键作用。gydF4y2Ba7gydF4y2Bae)。gydF4y2Ba

根生长表型gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba在30 μM β-D-Gal-Yariv存在下的突变体gydF4y2Ba

已有研究表明β-D-Gal-Yariv试剂能与AGPs上的β-1,3-半乳糖骨干结合，抑制细胞分裂、根伸长和花粉管生长[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]．进一步验证β-D-gal-yiv对根本生长的影响gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba突变体，将四天龄幼苗转移到含有30μmβ-D-加仑纱的1/2 MS板上，并生长2周。转移后7和14天测量根伸长率。这俩gydF4y2Ba25gydF4y2Ba双突变体和gydF4y2Ba23456gydF4y2Ba五倍突变体的根伸长明显高于野生型和野生型gydF4y2Ba346gydF4y2Ba第7天和第14天发生三重突变。的根长度gydF4y2Ba346gydF4y2Ba突变体在14天后显着长于WT，但在7天后不是（图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

GALTS有助于常规植物生长和生殖增长gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba

表型，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba双,gydF4y2Ba346gydF4y2Ba三种突变体与WT相似，除了这两种突变体单株的角果数分别减少26%和34%(图1)。gydF4y2Ba9gydF4y2Bab及补充表gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.的gydF4y2Ba23456gydF4y2Ba而5倍突变体则表现出许多异常的生长表型，如莲座叶变小，花期延迟约2天，株高下降16%，单株角果减少20%，单株角果减少65%，结实率下降30%(图1)。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba和补充表gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.为了了解是否是男性或雌性的配子体gydF4y2Ba23456gydF4y2Ba突变体是导致育性降低的主要原因，而互交是在两者之间进行的gydF4y2Ba23456gydF4y2Ba和wt植物。从WT或WT或gydF4y2Ba23456gydF4y2Ba被用来为野生型植物授粉gydF4y2Ba，gydF4y2Ba角果长度和结实率均正常。然而，当花粉从WT或gydF4y2Ba23456gydF4y2Ba是用来授粉的gydF4y2Ba23456gydF4y2Ba观察到突变体，较短的单片机和减少的种子数量（图。gydF4y2Ba9gydF4y2BaD-e）。这些倒数交叉数据表明，较短的单件和减少种子组gydF4y2Ba23456gydF4y2Ba是女性配子体中缺陷的结果。进行体外花粉萌发以检查各种花粉表型gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba突变体。所有的gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba突变体含有正常形状花粉，除了gydF4y2Ba23456gydF4y2Ba突变体的花粉约25%是小的，有缺陷的花粉不能在离体中萌发(图。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba和gydF4y2Ba11gydF4y2Bac).正常形态花粉的萌发率gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba突变体与WT相似(图。gydF4y2Ba11gydF4y2Baa).然而，所有的gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba与野生型相比，突变体的花粉管长度减少了大约25%(图。gydF4y2Ba11gydF4y2Bab)。gydF4y2Ba

CRISPR-Cas9基因编辑有助于研究参与AGP糖基化的GTsgydF4y2Ba

Arabinogalactan-proteins是植物王国中最高糖基化的蛋白质[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]．鉴于AGPS由大约90-98％的糖组成，Ag多糖链可能形成这些糖蛋白的交互分子表面并控制其生物学功能[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]．因此，负责向agp中添加糖的GTs特别有趣。研究这些gt可能特别具有挑战性，原因有几个，包括发现这些gt存在于基因家族中，并且具有重叠和冗余的活动，这使得研究它们对AGP结构和功能的影响变得困难[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

这里，生成了两个多路复用CRISPR结构来瞄准多个gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba基因（即，gydF4y2BaGALT3gydF4y2Ba，gydF4y2BaGALT4gydF4y2Ba,gydF4y2BaGALT6gydF4y2Ba)参与Hyp-gydF4y2BaOgydF4y2Ba-半乳糖化的agpgydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba．具体地，两个纯合突变体系[即，agydF4y2Ba346gydF4y2Ba三突变体和agydF4y2Ba23456gydF4y2Ba选择5倍突变体]进行进一步的鉴定(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab和b - 2)。两种突变体均发生了由crispr - cas9诱导的突变，并导致所有靶位点的终止密码子过早出现(图)。gydF4y2Ba12gydF4y2Ba和gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.利用CRISPR-P 2.0软件检测脱靶基因突变。从GALT CRISPR突变体中鉴定出5个最重要的脱靶基因并进行了测序。GALT CRISPR突变体中未发现脱靶突变(补充表)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

表型变化较少gydF4y2Ba25gydF4y2Ba双突变体和gydF4y2Ba346gydF4y2Ba三重突变体相比gydF4y2Ba23456gydF4y2Ba五元突变体的存在表明，两者之间存在着补偿效应gydF4y2Ba高尔特gydF4y2Ba．因此，仅可以通过尽可能多的冗余基因揭示AGP糖装饰的真实生物功能，优选地通过使用CRISPR / CAS9复用方法来揭示AGP糖装饰的真实功能。鉴于五个gydF4y2Ba高尔特gydF4y2Ba（gydF4y2BaGALT2-6gydF4y2Ba）和三gydF4y2BaHPGTS.gydF4y2Ba（gydF4y2BaHPGT1-3gydF4y2Ba）每个都属于GT31和GT31中的单独的枝条gydF4y2Ba23456gydF4y2BaCRISPR突变体表现出与之前报道相似的多效表型gydF4y2Ba789gydF4y2BaT-DNA突变体，这表明GT31的每个分支对AGP糖启动步骤有显著的贡献gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

CRISPR诱导的突变gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba基因导致糖基化的AGPS较少并减少ARA和GALgydF4y2Ba

由β-D-gal-yar-yar-yiv沉淀检测到的糖糖基化的AGPS的显着减少在所有的莲特叶，茎和SISIQUE中发现gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba与WT相比的突变体(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.此外，莲座叶AGP的单糖分析表明gydF4y2Ba23456gydF4y2Ba突变体中阿拉伯糖(Ara)和半乳糖(Gal)的含量显著降低gydF4y2Ba25gydF4y2Ba和gydF4y2Ba346gydF4y2Ba突变体，再次说明了这五个gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba基因(gydF4y2BaGALT2gydF4y2Ba，gydF4y2BaGALT3gydF4y2Ba，gydF4y2BaGALT4gydF4y2Ba，gydF4y2BaGALT5gydF4y2Ba,gydF4y2BaGALT6gydF4y2Ba)在功能上是多余的(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.这些数据与AGP蛋白核心Hyp残基半乳糖化起始量随着越来越多而逐渐减少的观点是一致的gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba基因被淘汰，导致总体糖基化的AGP分子，因为它们在其多肽骨架上具有更少的次蛋白链。的AG chains that are added in these mutants are likely similar to wild type AG chains, but do show some reduced amounts of Gal and Ara, which may reflect reduced activities of other potentially interacting GALTs (i.e., β-1,3-galactosyltransferases involved in chain elongation and β-1,6-galactosyltransferases involved in side chain formation/elongation) and arabinosyltransferases when the千斤顶gydF4y2Ba基因是报废。未来的研究可以集中在这种负责AGP生物合成的GTs之间潜在的蛋白-蛋白相互作用上。gydF4y2Ba

AGP糖基化有助于根的正常生长gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba

这俩gydF4y2Ba23456gydF4y2BaCRISPR五倍突变体和gydF4y2Ba789gydF4y2BaT-DNA三突变体在正常生长条件下，根长变短，根毛变长，表明两者之间存在一定程度的基因冗余gydF4y2Ba高尔特gydF4y2Ba和gydF4y2BaHPGTS.gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba和gydF4y2Ba8gydF4y2Ba）.用30 μM β-D-Gal-Yariv试剂处理后，结果表明gydF4y2Ba23456gydF4y2Ba突变体表现出最大的根伸长率，然后是gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba346gydF4y2Ba， WT(图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba）.所示的根本明显更长gydF4y2Ba25gydF4y2Ba相比gydF4y2Ba346gydF4y2Ba经Yariv治疗后表明gydF4y2BaGALT2gydF4y2Ba和gydF4y2BaGALT5gydF4y2Ba可能在根中agp的糖基化过程中发挥更重要的作用比gydF4y2BaGALT3gydF4y2Ba，gydF4y2BaGALT4gydF4y2Ba,gydF4y2BaGALT6gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba）.这也说明了基因间存在部分冗余gydF4y2Ba高尔特gydF4y2Ba这取决于器官类型。这与之前的研究结果一致gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba突变体等gydF4y2Bagalt2gydF4y2Ba，gydF4y2Bagalt3gydF4y2Ba，gydF4y2Bagalt4gydF4y2Ba，gydF4y2Bagalt5gydF4y2Ba,gydF4y2Bagalt6gydF4y2Ba显示对根生长的延长抑制不太敏感[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]．除此之外gydF4y2Ba789gydF4y2Ba与野生型相比，突变型有更长的侧根和更长的根毛[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]．如Basu等人所建议的[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]，植物需要维持一个糖基化AGP的临界值才能正常生长，尤其是对AGP变化特别敏感的根系。因此，AGP糖基化降低会影响根的生长gydF4y2Ba23456gydF4y2Ba和gydF4y2Ba789gydF4y2Ba突变体。gydF4y2Ba

agp是已知的定位和参与根系生长的各种研究。Yariv治疗gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba根表现为短、肿的根表型，这是由于细胞增殖和细胞伸长受到抑制[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]．其他几个AGP相关的GTS或AGP突变体如gydF4y2Bareb1-1.gydF4y2Ba，gydF4y2Baray1gydF4y2Ba，gydF4y2BaFUT4 / FUT6.gydF4y2Ba，gydF4y2Baglcat14a-1gydF4y2Ba，gydF4y2Bafla1gydF4y2Ba，gydF4y2Bafla4 / sos5gydF4y2Ba和gydF4y2Baagp30gydF4y2Ba，在正常或盐胁迫条件下也表现出异常的根系表型gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]．此外，AGPs抗体JIM8、JIM13和LM2等可将AGPs定位于主根、根冠和根毛[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]．这里研究的CRISPR突变体清楚地阐明了AGP糖基化在根生长中的重要作用。gydF4y2Ba

AGP糖基化对于正常生长和发展至关重要gydF4y2Ba

的gydF4y2Ba23456gydF4y2BaCRISPR突变体的地上生长表型较正常突变体多gydF4y2Ba25gydF4y2Ba突变体,gydF4y2Ba346gydF4y2Ba突变体和野生型植物（图。gydF4y2Ba9gydF4y2BaA-B;补充表gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.这种异常的生长表型包括更小和更少的莲座叶以及更短的花序，并使人想起以前报道的矮化表型gydF4y2Ba789gydF4y2Ba三重突变体和gydF4y2Baray1gydF4y2Ba突变体[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]．AGP糖基化影响和控制这种植物生长的机制在很大程度上是未知的。然而，一种可能性是，由galt启动的agp上的AG链允许agp与其他质膜和细胞壁成分相结合，以保持细胞壁的完整性。许多agp通过GPI锚点位于质膜外表面，这些agp与其他质膜蛋白如壁相关激酶(WAKs)、RLKs(如FEI1/FEI2)、纤维素合成酶(cellulose synthases)等紧密相连[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]．这种质膜AGPs也与细胞骨架有关，但确切的分子相互作用尚不清楚。通过在烟草BY2细胞中表达番茄AGP融合蛋白(即LeAGP1- gfp)，发现LeAGP1在质解过程中定位于Hechtian链[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

agp也存在于细胞壁中，并能与其他细胞壁成分相互作用。当使用AGP抗体从粗果胶组分中检测出AGP时，发现了AGP与果胶之间结合的证据[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]．添加钙可以促进胡萝卜AGPs和果胶的结合，而EGTA(钙螯合剂)则减弱了这种结合，说明钙可能是一种重要的交联剂[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]．提出了AGPS和果胶用作细胞壁增塑剂，其促进细胞壁多糖之间的结合[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]．也许AGP与其他壁分子相互作用的最显著例子是发现一种被称为APAP1的特殊AGP不仅与果胶共价相互作用，而且还与阿拉伯木聚糖共价相互作用[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]．APAP1的连锁分析gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba细胞悬浮培养发现AGP糖和在阿拉伯木聚糖和果胶中发现的糖(RG-I)之间存在共价键[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]．因此，敲掉了gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba基因可以影响碳水化合物残基与其相互作用分子之间的这些各种关联，以改变细胞壁网络连接，导致异常生长。gydF4y2Ba

AGP糖基化在雄性和女性配子体发育中的功能gydF4y2Ba

反向杂交实验表明，雌性配子体的缺陷是导致种子结实率降低(约30%)的原因gydF4y2Ba23456gydF4y2Ba五倍的突变(无花果。gydF4y2Ba9gydF4y2BaC-E）。种子较严重的减少gydF4y2Ba23456gydF4y2Ba突变体相比gydF4y2Bagalt4gydF4y2Ba和gydF4y2Bagalt6gydF4y2Ba单突变体建议gydF4y2BaGALT4gydF4y2Ba和gydF4y2BaGALT6gydF4y2Ba在种子发育中扮演多余的角色。与这些gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba突变体gydF4y2Ba，gydF4y2Ba的gydF4y2Ba789gydF4y2Ba据报道，三种突变体只有较短的果柄，但结实率正常[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]．因此，尽管是次级的gydF4y2BaOgydF4y2Ba- GALTS，GALTS（GALT2-6）和HPGT（HPGT1-3）各自可具有AGP糖基化和功能中的部分重叠的作用。GALTS在硅化发展中的功能作用表明，卵巢中AGP糖基化的程度有助于正常的雌性配子体发育gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba．由于花粉、花粉管和卵巢等生殖组织中富含AGP及其碳水化合物，我们的研究结果表明，由galt启动的AGP上的糖类对AGP的生殖功能至关重要。gydF4y2Ba

几种agp被认为参与了雌配子体的发育gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba．AGP4 (JAGGER)最近被证明在助细胞中起作用，以阻断和防止多囊癌gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]．在gydF4y2Ba贾格尔gydF4y2Ba突变体，第二助细胞在受精后没有退化，能继续吸引花粉管到胚囊[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]．有人认为，AGP4/JAGGER蛋白本身或AGP4/JAGGER上的碳水化合物作为信号分子，导致受精后第二助细胞变性，阻止更多花粉进入[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]．AGP19是另一种表达于卵巢、传递道和卵细胞的AGPgydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba．一个gydF4y2Baagp19gydF4y2Ba敲除突变体显示出较少且较短的机器，表明在再现中的AGP19功能[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

AGPs的碳水化合物部分一直被视为生殖发育过程中的信号分子和营养来源，包括授粉、雌雄配子体发育、子房引导、受精和胚胎发生[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]．一项研究发现，AGP18的糖基化建立了从孢子体组织向配子体组织的过渡。虽然在卵细胞中发现了AGP18的转录本，但糖基化的AGP18仅在有功能的大孢子母细胞中发现[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]．AGP糖基化参与花粉卵巢通信的经典实例是传输组织特异性（TTS）蛋白，其在烟草样式的发射机中表达的AGP [gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]．观察到花粉管被吸引并朝着较高浓度的糖基化的TTS蛋白增长。体外和体内实验中的两种情况都发现，花粉管可以在朝向卵巢的发展时脱糖基质，表明TTS上的碳水化合物向花粉管向卵巢产生了途径。gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]．结果表明，AGPs上的多糖对花粉管有引诱作用gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba这和另一项研究一致吗gydF4y2BaTorenia fournierigydF4y2Ba．结果表明，卵巢分泌的AGP多糖链中含有β-甲基-葡萄糖醛酸半乳糖(4-Me-GlcA-β-1,6- gal)gydF4y2BaTorenia fournierigydF4y2Ba是使花粉管具备胚珠靶向/引导能力的必要条件[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

关于花粉的发育，大多数gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba突变体除了gydF4y2Ba23456gydF4y2Ba含有正常形状的花粉(图。gydF4y2Ba11gydF4y2Ba）.所有的gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba与wt相比，突变体表现出较短的花粉管。此外，大约30％的花粉gydF4y2Ba23456gydF4y2Ba五倍突变体是缺陷的，因此它们更小，不能存活(图。gydF4y2Ba11gydF4y2BaA-C）。这种有缺陷的花粉表型由此显示gydF4y2Ba23456gydF4y2Ba突变体拟表型gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2BaRNAi突变体的gydF4y2BaFLA3gydF4y2Ba，它编码一种类似束状蛋白的AGP，其中一半的花粉粒萎缩，无法存活[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]．有缺陷的花粉gydF4y2Bafla3gydF4y2Ba表现出异常的花粉信息，导致男性生育率和种子缩小的缺陷[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba突变体等gydF4y2BaAGP6，AGP11.gydF4y2Ba,gydF4y2Baagp6 agp11gydF4y2Ba也表现为花粉塌陷，花粉萌发减少，花粉管伸长减少，花粉释放减少[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]．最近鉴定出称为KNS4的GT31家族的另一个成员具有AGPβ-（1,3） - 半乳糖基甲酰转移酶活性，并参与形成的外出层gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba花粉[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]．的gydF4y2Bakns4gydF4y2BaT-DNA插入突变体在花粉发育四分体阶段表现为花粉粒塌陷，花粉粒外壁较薄，不能从花粉母细胞中分离[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]．可能是缺陷的花粉表型gydF4y2Ba23456gydF4y2Ba同样由微孔壁形成异常引起的。单个AGP突变体和呈现的类似表型gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba突变体可以归因于不恰当的糖基化或糖基化AGPs。之前的一项研究gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba单突变体在花粉管伸长和花粉形态上无明显差异gydF4y2Bagalt2gydF4y2Ba，gydF4y2Bagalt3gydF4y2Ba，gydF4y2Bagalt4gydF4y2Ba，gydF4y2Bagalt5gydF4y2Ba,gydF4y2Bagalt6gydF4y2Ba突变体(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]．这些对比调查结果再次指示基因冗余gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba基因家族。gydF4y2Ba

通过众多植物物种中的免疫橡胶化研究AGPS和/或Glycan链的其他可能的作用[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]并且可能是未来研究的一个领域。的development of AGP monoclonal antibodies (e.g. JIM8, JIM13, MAC207, and LM2) is a milestone in AGP research as it provides information on the localization and putative roles of AGPs and/or the complicated glycan structures on AGPs in specific cell types or developmental stages. Antibodies such as JIM8 and JIM13 have detected AGPs in the cell walls of microspores in拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]．LM2和Mac207抗体在花粉管的尖端处局部AGPSgydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]．应用JIM8和JIM13抗体和β-Glc-Yariv试剂，发现苹果和玉兰授粉前的柱头上有agp，授粉后就消失了[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]．类似地，JIM13标记的AGPS显示AGPS以微囊管中生长花粉管的方式发出信号。然而，AGP信号在苹果中的花粉管道后耗尽。Jim8标记的AGP累积在苹果卵巢之前和授粉期间，但受精后很快就会消失[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

本研究成功利用CRISPR-Cas9多重基因编辑技术生成高阶突变体[即。一个三倍(gydF4y2BaGALT3 GALT4 GALT6gydF4y2Ba)和一个五元组(gydF4y2BaGalt2 galt3 galt4 galt5 galt6gydF4y2Ba)突变]gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba基因家族。生化和生理分析均表明基因冗余存在gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba基因家族。生化分析表明，galt的数量对AGPs的糖基化程度有加性影响。表型分析表明，AGP糖基化对正常的营养和生殖生长至关重要，特别是在根和茎的生长、花粉和花粉管的形成、雌配子体的发育、结实率和角果的发育等方面gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba．未来的工作将集中于剖析AGP糖基化控制这些生理过程的分子机制。虽然GALT (GALT2-5)和hpgt (HPGT1-3)都参与了agp的糖基化起始，但GALT包含一个GALECTIN结构域和一个GALT结构域，而hpgt只包含一个GALT结构域。未来的研究还应关注这两个蛋白结构域(即GALECTIN和GALT)的作用，以及GALT和hpgt之间的进化关系。为了进一步阐明糖基化对agp的功能重要性，未来的工作还可以集中于产生更多的高阶突变体，即8个成员中不同或更多的基因gydF4y2BaHyp-O-GaltgydF4y2Ba使用我们的CRISPR-Cas9多路复用方法敲除基因家族。gydF4y2Ba

植物材料gydF4y2Ba

答:芥gydF4y2Ba(Columbia-0生态型)来源于美国俄亥俄州哥伦布市拟南芥生物研究中心(ABRC)，作为野生型gydF4y2Bagalt2 galt5gydF4y2Ba纯合子T-DNA突变体之前在我们的实验室中产生[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]．的gydF4y2Bahpgt1 hpgt2 hpgt3gydF4y2Ba纯合T-DNA突变体来自Ogawa-Ohnishi博士的实验室[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]．我们使用此研究在本研究中产生了所有Crispr突变体gydF4y2BaCol-0gydF4y2Ba背景。gydF4y2Ba

矢量建筑gydF4y2Ba

在线gRNA设计工具CRISPR-P 2.0 (gydF4y2Bahttp://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/gydF4y2Ba)用于gRNA设计[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba]．5种grna被设计为靶向gydF4y2BaGALT3gydF4y2Ba，gydF4y2BaGALT4gydF4y2Ba,gydF4y2BaGALT6gydF4y2Ba同时使用多函数TRNA-GRNA（PTG）方法（表gydF4y2BaS1gydF4y2Ba)[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]．使用表中列出的引物从模板质粒pGTR中扩增出每个gRNA作为一个多顺反子tRNA-gRNA (PTG)单位gydF4y2BaS2gydF4y2Ba和gydF4y2BaS3gydF4y2Ba．PGTR质粒是银阳实验室博士的一份礼物（Addgene质粒＃63143）。扩增后，使用来自Promega的Pizard®SV凝胶和PCR清理试剂盒通过DNA凝胶提取纯化PCR产物。在BSAI消化期间将六个PTG单元连接在一起，并使用通用引物对（PHEE_S5AD-F和PHEE_S5AD-R）进行PCR反应以扩增连接的PTG单元。的ligated PTG PCR product was purified by DNA gel extraction using the Wizard® SV gel and PCR clean-up kit from Promega, and subsequently ligated to the binary vector pHEE401E, which was a gift from Dr. Qi-Jun Chen’s lab (Addgene plasmid #71287). The pHEE401E binary vector had a maize codon optimizedCas9gydF4y2Ba由蛋细胞特异性启动子驱动的基因（例如1.1和E.C 1.2）[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

在旨在瞄准的第二个结构中gydF4y2BaGALT3gydF4y2Ba，gydF4y2BaGALT4gydF4y2Ba,gydF4y2BaGALT6gydF4y2Ba，设计了4种grna (TablegydF4y2BaS1gydF4y2Ba）.用于扩增这些grna的引物列于表中gydF4y2BaS4gydF4y2Ba．在PCR扩增后，随后通过金门克隆方法克隆到Phee401e二元载体的Bsai位点中的这些GRNA片段[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]．3个模板质粒(pCBC-DT1、pCBC-DT2T3、pCBC-DT3T4)来自陈启军博士实验室(Addgene质粒#50590;# 50591;# 50592) [gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

两种构建物均克隆到pHEE401E载体并经Sanger测序确认后，转化农杆菌菌株GV3101，用于转化gydF4y2Ba拟南芥Col-0gydF4y2Ba通过花卉DIP方法的生态型[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]．首先使用简单的基于PCR的方法来检测吲哚突变，然后通过Sanger测序证实[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

β-D-Gal-Yariv定量AGPsgydF4y2Ba

AGPS从四周大中提取gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba利用β-D-Gal-Yariv [gydF4y2Ba54gydF4y2Ba]．简单地说，在加入1ml 2%钙离子之前，用液氮将突变体和野生型植株的莲座叶、茎和鳞茎粉碎约0.3 ggydF4y2Ba_2gydF4y2Ba然后，在13000℃离心，从植物碎片中分离上清液gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟。然后，将200μlβ-D-Gal-Yariv试剂加入到新的1.5mL离心管中的上清液中;使AGPS沉淀2小时。为了量化AGP含量，将沉淀的AGP沉淀物溶于20mM NaOH中并在OD下使用紫外光谱仪测量gydF4y2Ba_420gydF4y2Ba．在相同的Yariv沉淀条件下，用阿拉伯胶制作AGP标准曲线。gydF4y2Ba

高pH值阴离子交换色谱-脉冲安培检测法分析单糖组成gydF4y2Ba

五周的玫瑰花属叶子gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba突变体和WT用于AGPS提取。首先通过液氮粉碎植物组织，然后通过温和振荡混合2％NaCl 2-3小时。接下来，通过以13,000离心获得上清液 ggydF4y2Ba30分钟。然后在上清中加入β-D-Gal-Yariv试剂过夜沉淀AGP。沉淀的AGP球团是通过低速离心(2000gydF4y2BaggydF4y2Ba−5000gydF4y2BaggydF4y2Ba) 10分钟，用蒸馏的H重悬gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO.为了破坏Yariv和AGP之间的连杆，将约25mg二硫代硫酸钠加入到AGP悬浮液中，并在50℃下温育10-15分钟。每个AGP样品通过PD-10脱盐柱（GE Healthcare）。然后冷冻干燥脱盐的AGP。使用先前描述的相同方法进行单糖组合物分析[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

根伸长率和根头发长度的测量gydF4y2Ba

用于测量种子的根系生长情况gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba突变体和WT首先在½MS琼脂皿上萌发。播种后第4天，将幼苗移栽到新的½MS琼脂平板上，在生长室内22℃、16 h光照/20℃、8 h黑暗光照条件下垂直生长。移栽4天后测定根长和根毛长。从根尖处5毫米处测量根毛。使用尼康SMZ1500立体显微镜在20倍放大下测量了大约300根根毛。β-D-Gal-Yariv处理后，将5日龄幼苗转移到含有30 μM β-D-Gal-Yariv的½MS琼脂板上。移栽后7 d和14 d分别测量根伸长。每种基因型约20株，每3次重复。gydF4y2Ba

发芽试验gydF4y2Ba

新鲜收获的种子gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba首先在4℃下将突变体和野生型植物在播种到1/2mS和1％蔗糖琼脂平板上。播种后24小时，36小时，48小时和60小时计数萌发百分比。每种基因型播种大约60种种子，四个重复。gydF4y2Ba

种子设置测量和互惠交叉分析gydF4y2Ba

从五周龄收获成熟的单片机gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba突变体和野生型植物。每个基因型用10株进行结实率测定。以第12期花为对照，进行互交gydF4y2BaGalt2 galt3 galt4 galt5 galt6gydF4y2Ba突变体。对于每一对，大约15-20个成功的人工授粉的角果被选择来测量结实率。为了测量种子数量，种子用70%的乙醇清除2-3天，然后转入50%的甘油。清除后，用尼康SMZ1500立体显微镜在10倍放大下计数种子数量。gydF4y2Ba

体外花粉萌发测定gydF4y2Ba

使用从五周龄的花朵进行体外花粉萌发gydF4y2Ba加尔特gydF4y2Ba花粉离体萌发的方法以前有描述[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]．在花粉萌发培养基上孵育花粉3小时后，使用尼康 - Lab2显微镜在50倍放大率下测量花粉形状，花粉萌发率和花粉管长度。针对每种基因型测量大约300个样品，用三个重复测量。gydF4y2Ba

本研究中使用和/或分析的数据集可在合理要求下从通讯作者处获得。gydF4y2Ba

HRGP：gydF4y2Ba

Hydroxyproline-rich糖蛋白gydF4y2Ba

AGP:gydF4y2Ba

Arabinogalactan蛋白gydF4y2Ba

忧郁,gydF4y2BaOgydF4y2Ba高尔特:gydF4y2Ba

羟脯氨酸,gydF4y2BaOgydF4y2Ba半乳糖基转移酶gydF4y2Ba

加:gydF4y2Ba

半乳糖gydF4y2Ba

CAZy:gydF4y2Ba

碳水化合物活性酶（数据库）gydF4y2Ba

GT:gydF4y2Ba

糖基转移酶gydF4y2Ba

引导RNA。gydF4y2Ba

gRNAgydF4y2Ba

忧郁:gydF4y2Ba

羟脯氨酸gydF4y2Ba

我们感谢萨凡纳比森，丽贝卡库拉，肖恩麦戈尔恩和渭河玉，帮助突变筛选和表型分析。我们还感谢Oyeyemi Ajayi和Carol Showalter为稿件的批判性评论。这项工作得到了俄亥俄州大学艺术与科学学院的研究生研究基金，由俄亥俄大学提供的原始工作授予以及由俄亥俄大学提供的南额度和量子现象研究所（NQPI）奖学金，由俄亥俄大学提供给Y.Z.gydF4y2Ba

这项工作由俄亥俄大学贝克基金资助，资助人没有参与实验设计，数据分析，决定出版，或准备手稿。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 俄亥俄大学分子与细胞生物学项目，雅典，俄亥俄州，45701-2979，美国gydF4y2Ba

   张元，Michael A. Held, Dasmeet Kaur & Allan M. ShowaltergydF4y2Ba

2. 俄亥俄大学环境与植物生物系，雅典，俄亥俄州，45701-2979，美国gydF4y2Ba

   张元，Dasmeet Kaur & Allan M. ShowaltergydF4y2Ba

3. 化学与生物化学系，俄亥俄大学，雅典，哦，45701-2979gydF4y2Ba

   Michael a .举行gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

yz进行了实验。H.A.M.帮助进行单糖成分分析并校对稿件。D.K.帮助了突变体的产生并校对了手稿。A.M.S.和yz构思了这项研究并撰写了手稿。所有作者均已阅读并批准稿件。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应于gydF4y2Ba艾伦·m·肖沃特gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者们宣称他们没有相互竞争的利益。Allan M. Showalter是本刊编委会成员(即副主编)。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

《自然》杂志对已出版的地图和附属机构的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文根据创意公约归因于4.0国际许可证，这允许在任何中或格式中使用，共享，适应，分发和复制，只要您向原始作者和来源提供适当的信贷，提供了一个链接到Creative Commons许可证，并指出是否进行了更改。除非信用额度另有说明，否则本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创造性公共许可证中，除非信用额度另有说明。如果物品不包含在物品的创造性的公共许可证中，法定规定不允许您的预期用途或超过允许使用，您需要直接从版权所有者获得许可。要查看本许可证的副本，请访问gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．“创作共用公共领域”豁免书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba）适用于本文中提供的数据，除非另有用入数据的信用额度。gydF4y2Ba

重印和权限gydF4y2Ba