DRIK1是一种应激反应类受体假激酶，其晶体结构揭示了ATP结合缺失的分子基础gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

植物重新编程代谢和发展以迅速适应生物和非生物胁迫。蛋白激酶通过磷酸化蛋白质基质在该过程中起显着作用，该蛋白质基质激活或灭活信号传导级联，其​​调节细胞和代谢适应。尽管他们在植物生物学中重要性，但迄今为止已经研究了一个显着的植物Kinomes的一小部分。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在本报告中，我们描述了gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1是一种应激反应受体样伪激酶，在水分限制下表达下调。我们展示了ATP缺失的结构特征和分子基础gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1。的gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1激酶结构域缺乏对磷酸化活性至关重要的保守氨基酸。的晶体结构gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1激酶结构域显示了由Leu三联体侧链形成的脊柱gydF4y2Ba^240gydF4y2Ba,酪氨酸gydF4y2Ba^{363.gydF4y2Ba},低浓缩铀gydF4y2Ba^{375.gydF4y2Ba}堵塞ATP捆绑袋。虽然gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDrik1无法结合核苷酸，它确实结合了小分子enmd-2076，其在Cicrystal结构中揭示了用作a的潜力gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1抑制剂。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

Zm评选gydF4y2BaDRIK1是一种新型的受体样伪激酶，对生物和非生物胁迫均有响应。蛋白激酶结构域载脂蛋白形式的晶体结构证明了ATP结合的缺失以及磷酸化活性的缺失。基因编码的表达谱gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1提示该激酶可能在下调应激反应基因的表达方面发挥作用，而这在正常情况下是不必要的。在生物和非生物胁迫下，gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1被下调释放这些应激反应的基因的表达。gydF4y2Ba

植物是固着生物，必须不断地调整新陈代谢以适应环境变化，如高/低温度、高/低光照强度和水分限制。当胁迫持续数天时，植物的生长发育受到影响，导致产量损失。对这些环境变化的反应在转录、翻译和翻译后水平上是协调的。发生的一个重要的翻译后修饰是特定底物的蛋白磷酸化，这是由植物中扩大的蛋白激酶家族发挥的作用，这些蛋白激酶可能对胁迫适应有重要贡献[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]．类受体激酶(receptor-like kinases, RLKs)是一类蛋白激酶，在植物的逆境反应中起着重要的作用。通常，RLKs有一个细胞外结构域，通常结合配体激活细胞内激酶结构域，进而通过将ATP的-磷酸基团转移到蛋白质底物来调节信号通路[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]．RLKs是植物激酶中最大的一组，属于一个独特的家族RLK/Pelle，大多数具有与RLK/Pelle LRR亚家族相对应的富含亮氨酸重复序列(LRR)。RLK/Pelle家族包括拟南芥中1000个激酶中的600多个成员，水稻中1400个激酶中的1100多个成员，玉米中1241个激酶中的大约760个成员[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]．尽管RLKs在植物中的重要性和代表性，但只有少数RLKs具有众所周知的功能[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba]这些配体包括内源性蛋白质、磺化肽、类固醇激素和病原体衍生肽激发子[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

已知的RLKs已被证明参与植物的发育调控、抗病和耐受性。例如，LRR-RLKs可以感知促生长的油菜素内酯并调节细胞的伸长和分裂，如油菜素内酯不敏感1 (BRI1)，或感知肽激素来调节根的发育，如根分生组织生长因子受体1 - 3 (RGFR1-3)，如Clavata 1 (CLV1)、BAM1-3 (BAM1-3)、RPK2 (Receptor-like Protein Kinase 2)、HAESA和HAESA- like 2 (HSL2)、ERECTA和ERECTA- like 1 (ERL1)等[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba]其他LRR-RLK，如体细胞胚胎发生受体样激酶（SERK）受体家族，包括BRI1相关受体激酶1（BAK1），涉及广泛的生物学过程，包括植物发育和抗病性[gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba]．此外，植物免疫系统中涉及的RLKs，如感知细菌鞭毛蛋白的鞭毛蛋白敏感2 (FLS2) [gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba]，具有耐药性的水稻Xa-21 [gydF4y2Ba15.gydF4y2Ba]，和NSP相互作用激酶1（NIK1）作为双粒病毒和双生病毒[的防御受体gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba]．由rlks驱动的非生物应激反应包括脱离酸（aba）反应，钙信号传导和抗氧化剂防御干旱，盐，冷，毒性金属/金属体，臭氧和uv-b辐射，以及其他应力[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]．干旱胁迫是造成产量损失的重要原因，目前已经有少数RLKs被鉴定为干旱敏感受体。一个例子是花器官1号(FON1)，对ABA敏感的水稻LRR-RLK已被证明与增加耐旱性有关[gydF4y2Ba17.gydF4y2Ba]．其他的例子是水稻的叶穗2 (LP2)和小麦的叶锈病10抗病位点受体蛋白激酶样1.2 (LRK10L1.2)，它们通过aba介导的信号与干旱胁迫反应有关[gydF4y2Ba18.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba]．在aba独立途径中，应激诱导蛋白激酶1 (OsSIK1) [gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]和应激诱导的蛋白激酶2（Ossik2）[gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba]已经被证明通过气孔发育调控和活性氧解毒相关基因的上调来控制水分流失。另一个例子是bri1样受体激酶3 (BRL3最近被描述为具有抗旱性[gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

大约10-20%的真核kinome成员缺乏磷酸化活性，被称为伪激酶[gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba]一般来说，这些激酶缺乏用于催化的必需氨基酸，因此不能磷酸化任何底物。尽管存在这种缺陷，假激酶在细胞代谢中起着重要作用，充当激酶支架或信号成分的变构调节剂[gydF4y2Ba24.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba]．假激酶可以作为辅助蛋白，通过变构调节扰乱蛋白质伴侣的构象，或作为支架招募催化活性激酶，通过磷酸化触发蛋白质激活。例如，拟南芥假激酶bak1相互作用受体样激酶2 (BIR2)、Coryne (CRN)和受体死亡激酶1分别介导了幼苗发育过程中的免疫反应、干细胞稳态和植物对ABA的响应[gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba]．另一个例子是类似受体的伪激酶保卫细胞抗过氧化氢1 (GHR1)，它作为一个支架与慢负离子通道1 (SLAC1)和钙依赖蛋白激酶3 (CPK3)相互作用，诱导气孔关闭[gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba]．在玉米中，与GHR1同源的伪激酶RLK Pangloss 2 (PAN2)在气孔发育过程中促进副母细胞向相邻保卫母细胞分化的极化[gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba]．这些催化活性不活跃的激酶在激酶结构域保持高度的序列保守，表明激酶结构域的折叠和结构是信号活性所必需的，而它们不同的生物功能是由细胞外结构域的差异驱动的[gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba]．然而，最近的研究表明，一些伪激酶的特异性也可以由它们的胞内激酶结构域决定，而外结构域允许它们与其他跨膜蛋白结合[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

尽管假激酶具有重要的作用，但从植物结构生物学的角度来看，它们还没有得到很好的描述，这导致了对其功能机制的认识存在很大的差距。在这项研究中，我们从转录谱数据集确定了一种受水分可用性调节的玉米RLK [gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]．我们将此rlk干旱响应无效激酶1（或gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1。的晶体结构gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1激酶结构域以载脂蛋白形式分解，并具有高亲和力的共晶结构小分子。阐明了缺乏ATP结合的机制，并对水有效性下的转录谱进行了表征。综上所述，这些结果可能有助于阐明干旱胁迫响应的分子机制，从而有助于培育更耐旱的玉米品系。gydF4y2Ba

DRIK1在进化上较远的植物中是保守的gydF4y2Ba

对genevinvestigator实验数据库的检查[gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba允许识别gydF4y2BaZm评选gydF4y2Ba在抗旱敏感玉米品种Han21和Ye478中，干旱胁迫下drk1下调，复水后drk1上调gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1)。对激酶结构域氨基酸序列的分析揭示了ATP结合和激酶活性所必需的残基改变，这表明该蛋白可能是伪激酶。我们随后研究了编码DRIK1的基因在植物中是否保守。从公共数据库中检索DRIK1相似序列，并检测其系统发育分布。在高粱、水稻、小麦、拟南芥和大豆中鉴定了DRIK1同源物。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba一种）。由于激酶结构域被高度甚至在从不同王国激酶保守的，我们分析了内含子/外显子gydF4y2BaDRIK1.gydF4y2Ba玉米、高粱、水稻和拟南芥的基因结构(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab).玉米和高粱是被分析的最接近的植物，它们的基因结构由6个外显子组成，每个外显子的长度在两个物种中相似。大米gydF4y2BaDRIK1.gydF4y2Ba基因有一个小的额外外显子，似乎是由第三个外显子的引入而产生的gydF4y2BaDRIK1.gydF4y2Ba来自玉米的基因。拟南芥gydF4y2BaDRIK1.gydF4y2Ba更短，但外显子的长度是保守的，更类似于水稻。gydF4y2Ba

DRIK1属于LRR VI-2激酶亚家族，对该亚家族的检测表明gydF4y2BaDRIK1.gydF4y2Ba基因未复制（附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S2a)。的gydF4y2BaDRIK1.gydF4y2Ba当与其他玉米LRR VI-2亚家族成员对准时，基因序列显示出低的身份，但是在编码相应的激酶域的区域是高度保守的（附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S2b和S2c)。一般来说，植物基因家族起源于进化过程中的重复事件，并具有冗余功能。事实上gydF4y2BaDRIK1.gydF4y2Ba该基因以单拷贝形式存在于玉米中可能有助于进一步的功能分析，以确定其在植物代谢中的作用，特别是与干旱胁迫响应相关的分子机制。gydF4y2Ba

植物开发早期阶段的根和叶片的基因表达谱表明，与3天后播种（DAS）相比，叶片中的Drik1表达在15-相比下降了50％。该结果表明DRIK1作为植物生长和叶片膨胀的发育作用（图。gydF4y2Ba1gydF4y2BaC）。gydF4y2Ba

Zm评选gydF4y2BaDRIK1是由生物和非生物胁迫调控gydF4y2Ba

对genevinvestigator数据库中RNAseq数据的调查显示gydF4y2Bazmdrik1.gydF4y2Ba基因在生物和非生物胁迫下下调(附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba：图S3）。gydF4y2Bazmdrik1.gydF4y2Bagene expression is downregulated after infection for 48 h withGlomerella graminicolagydF4y2Ba和gydF4y2Ba尾孢属zeinagydF4y2Ba真菌。当植物暴露在高温和低温、淹没和干旱胁迫下时，该基因也会下调。另一方面，该基因在萌发过程中表达上调gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:图S4)。然而，我们必须谨慎地考虑这些数据，因为它们是在高通量模式下生成的，并没有特别验证gydF4y2Bazmdrik1.gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

实验验证gydF4y2Bazmdrik1.gydF4y2Ba表达模式，分析mRNA水平gydF4y2BaZm评选gydF4y2Ba干旱胁迫下植物叶片中的DRIK1(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.盆栽土壤处理8 d的玉米B73植株限水9、12和14 d后进行复水，并对干旱胁迫和复水植株的叶片样品进行分析gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1 mRNA水平。的gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1 mRNA水平在限水9 d后不久下调，在复水24 h后恢复(图1)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

Zm评选gydF4y2BaDRIK1是一种受体样伪胰酶酶gydF4y2Ba

Zm评选gydF4y2BaDRIK1是一种跨膜蛋白，其具有细胞外结构域，其含有低复杂性区域和蛋白质细胞内部的激酶结构域。通常，活性激酶在保守位置具有氨基酸残基，这对于激酶活性是必不可少的。确认gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1是一个非活性的激酶，我们将DRIK1从不同物种和活性(BRI1;CLV1;IRAK4;非活性(BSK8;BIR2激酶(图)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa).玉米、高粱、水稻和拟南芥的DRIK1氨基酸序列变异最小。在P-loop中，在活性激酶中观察到一个保守序列Gly-X-Gly-X-X-Gly [gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba]而在玉米，高粱和米饭中，第二和第三甘氨酸分别被Thr和Cys代替。由于这些变化发生了小氨基酸，它们可能不会影响ATP结合甚至DRIK1的催化活性。活性激酶的另一个重要特征是保守的ASP-PHE-GLY主题，其中ASP对于协调MG是重要的gydF4y2Ba^2+gydF4y2Ba与ATP的离子交换。在DRIK1中，Asp-Phe-Gly基序变为Asp-Leu-Glu，氨基酸Asp的保守性表明这一特征没有受到损害。另一方面，来自催化环的His-Arg-Asp-X-Lys-X-Asn基序的Asp残基对于接受来自被磷酸化的羟基的氢至关重要[gydF4y2Ba43.gydF4y2Ba]．在DRIK1中，该氨基酸被极性不带电氨基酸Asn所取代，表明磷酸化不可能发生。Val-Ala-Ile-Lys基序中的Lys是最重要的激酶催化氨基酸之一。在DRIK1中，从所有被分析的物种中，这个氨基酸被Ala取代。此外，c -螺旋中的谷氨酸被赖氨酸取代。这两个氨基酸(来自Val-Ala-Ile-Lys基序的Lys和来自C-helix的Glu)形成盐桥，在ATP结合袋中与ATP相互作用并促进磷酸化。因此，这些氨基酸的变化表明即使gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1能够结合ATP，催化氨基酸的缺失增强了它的伪激酶性质。gydF4y2Ba

一些伪激酶，尽管不能磷酸化其他蛋白质，但可以结合ATP [gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46.gydF4y2Ba[改变构象以与其他蛋白质相互作用并调节代谢途径[gydF4y2Ba47.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48.gydF4y2Ba]．我们调查是否gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1-KD能结合核苷酸。纯化的重组gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1-KDgydF4y2Ba^{R187-S514gydF4y2Ba}（无花果。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab)没有结合GTP或ATP模拟物AMP-PNP(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaC）。gydF4y2Ba

三联体Leu240, Tyr363和Leu375会破坏ATP囊处的核苷酸结合gydF4y2Ba

来了解缺乏核苷酸相互作用gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDrik1-KD ATP口袋在分子水平，我们解决了gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1-KD晶体结构在1.7 Å。蛋白质跨越氨基酸Leu的晶体结构gydF4y2Ba^209gydF4y2Ba对职业gydF4y2Ba^491gydF4y2Ba发现了一个典型的激酶结构域，n端叶主要由β层构成，c端叶主要由α-螺旋构成，通过铰链连接(图1)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba一种）。在密度图中未观察到在C-末端叶中形成的活化环的氨基酸380至394的氨基酸380-394，在C-末端叶中形成的环中形成的环中的氨基酸419-425，可能是因为这些的灵活性地区。gydF4y2Ba

ATP绑定口袋的结构是暴露于溶剂的空腔(图)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab和e)。然而，Leu的侧链gydF4y2Ba^240gydF4y2Ba,酪氨酸gydF4y2Ba^{363.gydF4y2Ba}和雷gydF4y2Ba^{375.gydF4y2Ba}氨基酸三合会占据ATP绑定站点，表明这种构象可能会阻塞口袋里的ATP住宿。低浓缩铀gydF4y2Ba^240gydF4y2Ba属于β2链，通过主链上的原子与β1链相互作用。这种相互作用稳定并暴露了这个氨基酸的侧链向ATP结合袋。此外,低浓缩铀gydF4y2Ba^{375.gydF4y2Ba}，属于Asp-Leu-Glu基序(通常为Asp-Phe-Gly)，由于c -螺旋、活化环和催化环的氨基酸的一系列相互作用，稳定地指向ATP结合袋。在C-helix,赖氨酸gydF4y2Ba^275gydF4y2Ba，它取代了保守的Glu，与Asp的主干相互作用gydF4y2Ba^{374.gydF4y2Ba}和glu.gydF4y2Ba^{376.gydF4y2Ba}来自Asp-Leu-Glu基序，支持诱导leu的构象gydF4y2Ba^{375.gydF4y2Ba}从Asp-Leu-Glu motif侧链面向ATP绑定口袋。因此，这种构象是由保守精氨酸的相互作用稳定的gydF4y2Ba^{355.gydF4y2Ba}（从His-arg-asp-x-x-x-x-asn x-asn motif与glu主链的催化回路gydF4y2Ba^{376.gydF4y2Ba}以及色氨酸侧链之间的相互作用gydF4y2Ba^{378.gydF4y2Ba}从激活循环和AspgydF4y2Ba^{374.gydF4y2Ba}从Asp-Leu-Glu主题。在一起，这些相互作用迫使Leu的侧链gydF4y2Ba^{375.gydF4y2Ba}定位朝向ATP绑定口袋。最后，Tyr侧链的位置gydF4y2Ba^{363.gydF4y2Ba}由赖氨酸稳定gydF4y2Ba^{371.gydF4y2Ba}β7链和甘氨酸gydF4y2Ba^312gydF4y2Ba铰链。相互作用能量矩阵(IEM) [gydF4y2Ba49.gydF4y2Ba]分析表明，这三个氨基酸的侧链也具有良好的相互作用能(TyrgydF4y2Ba^{363.gydF4y2Ba}-Leu.gydF4y2Ba^{375.gydF4y2Ba}−5.75 kJ/mol;酪氨酸gydF4y2Ba^{363.gydF4y2Ba}-Leu.gydF4y2Ba^240gydF4y2Ba−1.26 kJ/mol;低浓缩铀gydF4y2Ba^240gydF4y2Ba-Leu.gydF4y2Ba^{375.gydF4y2Ba}： - 5.49 kj / mol）。gydF4y2Ba

进一步阐明黎合的作用gydF4y2Ba^240gydF4y2Ba,酪氨酸gydF4y2Ba^{363.gydF4y2Ba}和雷gydF4y2Ba^{375.gydF4y2Ba}为了防止ATP结合，我们叠加了载脂蛋白结构gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1-KD(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Bac和f)与胞质Aba受体激酶1 (CARK1)共晶结构的AMP-PNP(图。gydF4y2Ba4gydF4y2BaD和g) [gydF4y2Ba50.gydF4y2Ba]．在图像的叠加(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bae和h)在atp的口袋gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1-KD，在铰链和gatekeeper之间有足够的空间容纳ATP的氮基。ATP的磷酸部分也没有任何明显的限制在与gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1-KD磷酸腺苷的口袋里。然而，Leu的侧链gydF4y2Ba^240gydF4y2Ba,酪氨酸gydF4y2Ba^{363.gydF4y2Ba}和雷gydF4y2Ba^{375.gydF4y2Ba}定向到ATP绑定口袋，在ATP结合口袋的中间形成屏障。在Cark1和来自Cark1的AMP-PNP的叠加gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1-KD，这可能是ATP的糖部分可能受到空间位阻损害。因此，由这三个氨基酸的侧链形成的脊柱阻塞了ATP的结合囊gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1-KD，这或许可以解释为什么核苷酸不能将此激酶结合。gydF4y2Ba

ATP袋gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1-KD绑定enmd-2076小分子gydF4y2Ba

虽然gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1-KD不能结合核苷酸，其他分子可能与其ATP结合袋相互作用并调节其活性。使用DSF分析(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba一个;额外的文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba：图S5）我们筛选了为人类激酶设计的378种化合物的小分子文库，并鉴定了enmd-2076化合物（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab)。enmd - 2076绑定gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1-KD的ΔTm位移高于3.5°C，这表明该分子可以热稳定激酶结构域(附加文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba：表S1）。ENMD-2076与互动gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1-KDgydF4y2Ba^{R187-S514gydF4y2Ba}进一步通过ITC用K证实gydF4y2Ba_DgydF4y2Ba为551nm，表示高亲和力结合模式（图。gydF4y2Ba5gydF4y2BaC）。gydF4y2Ba

DSF和ITC可用于鉴定新的配体和阐明的相互作用的物理性质。然而，这些试验不显示在分子水平上的蛋白质分子的相互作用。深入了解如何gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1可以与ATP竞争性抑制剂结合，我们解决了COCrystal结构gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1-KD绑定ENMD-2076。在这种共晶结构中，可以观察到ENMD-2076与ATP结合袋结合，其来自嘧啶的胺基为Ala提供氢gydF4y2Ba^309gydF4y2Ba来自铰链的羰基（图。gydF4y2Ba6gydF4y2BaB-黑虚线）。当我们比较的ATP结合口袋gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1-KD载脂蛋白形式(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Bac)与共晶(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Bab)，我们没有观察到小分子配体引起的重大变化，特别是在铰链和ATP结合袋。gydF4y2Ba

来自ENMD-2076的哌嗪紧贴在腔内，预计由ATP的氮基填补。吡唑暴露于溶剂中，该基团可以在不影响ENMD-2076相互作用的情况下成为修饰的目标gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1-KD。苯乙烯朝向据信被ATP中的磷酸盐所占据的空腔。与ATP不同的是，Leu三和弦的侧链gydF4y2Ba^240gydF4y2Ba,酪氨酸gydF4y2Ba^{363.gydF4y2Ba}和雷gydF4y2Ba^{375.gydF4y2Ba}不损害与ENMD-2076的相互作用。gydF4y2Ba

使用转录组分析生物体内的整体表达模式有助于阐明代谢如何适应应激。然而，转录组实验并未证明单个蛋白质在正常或应激代谢中的作用。然而，使用公共数据库识别具有表达模式的基因由代谢扰动调节可以作为阐明其作用的起点gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1是一种受生物和非生物胁迫调节的保守的类受体伪激酶。gydF4y2Ba

伪激酶已经成为重要的信号传递者，通过招募其他蛋白质来调节细胞代谢，从而激活响应途径[gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba]．在拟南芥中，Clavata2（CLV2）之间的相互作用，受体样蛋白（LRR-RLP）和Coryne，一种受体样伪导体酶，对芽中的干细胞维持是重要的[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba]．尽管缺乏转移酶活性，但Coryne的激酶结构域对于促进CLV2的内质网向质膜迁移是必要的，这表明即使没有磷酸化活性，这些激酶在植物代谢中也有重要作用。在玉米中，气孔的形成依赖于另外两种类似受体的伪激酶，PAN1和PAN2 [gydF4y2Ba51.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba52.gydF4y2Ba]这两种假激酶参与一系列事件，首先极化PAN2，然后极化PAN1，以促进产生功能性气孔的前体辅助母细胞的不对称细胞分裂[gydF4y2Ba53.gydF4y2Ba]．在gydF4y2Bapan1gydF4y2Ba——或者gydF4y2Bapan2gydF4y2Ba-敲除，副母细胞未发生不对称细胞分裂;因此，畸形气孔产生，暗指非功能性气孔。此外，假激酶在生物和非生物胁迫反应中也有作用。拟南芥在应对生物胁迫时，一种名为hopz - ti - deficient 1 (ZED1)的细胞质伪激酶是必不可少的gydF4y2Ba假单胞菌syringeagydF4y2Ba感染 [gydF4y2Ba54.gydF4y2Ba]．在zar1介导的免疫反应中，这种假激酶作为感染效应体HopZ1a的诱饵。另一个重要的伪激酶是GHR1。这种LRR-RLK是激活SLAC1和促进气孔关闭所必需的[gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba]．有人提出，这种伪激酶不会使SLAC1磷酸化，而是作为其他调控因子(如CPK3)的支架。随着越来越多的蛋白质被描述出来，植物伪激酶的广泛相关性必须变得更加复杂。特别是，考虑到参与多种功能、结合伙伴、构象和分子作用机制的人类伪激酶数量不断增加[gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba]．在这项研究中，我们鉴定了假激酶gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1在不同植物物种之间具有系统发育和遗传结构上的保守，但在同一亚科LRR-VI-2的其他代表成员之间的保守程度较低。玉米、高粱和水稻中的保守基因结构表明这些植物具有相似的功能，以及在进化过程中的共同祖先[gydF4y2Ba55.gydF4y2Ba]．虽然RLK/Pelle几个亚家族的串联复制已被描述[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，两者之间缺失的谬误关系gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1和同一亚家族的其他成员并不令人惊讶，因为假激酶的基因复制被认为是从典型激酶进化而来的[gydF4y2Ba56.gydF4y2Ba]，虽然来自玉米的所有其他其他6个LRR-VI-2成员被预测为伪胰剂酶[gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba]．此外，LRR-VI-2的玉米基因序列比对显示，与LRR-VI-2的相似性极低gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1，虽然它们的激酶结构域高度保守，证实了已知和假定死亡激酶的显著方面，保留了保守激酶结构域序列的选择限制[gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba]和胞外结构域的分化[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]．一般来说，人们对伪激酶的分子功能知之甚少，尤其是LRR-VI亚家族[gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba57.gydF4y2Ba]．在这些伪激酶中，只有两个成员在拟南芥中被鉴定为MDIS1和MDIS2。MDIS1/Male discover 1被发现与受体MDIS1形成异源二聚体相互作用受体激酶MIK1和MIK2在花粉管上感知雌性引诱剂LURE1 [gydF4y2Ba58.gydF4y2Ba]．虽然预测MDIS1是伪激酶，但MDIS1可以被MIK1磷酸化[gydF4y2Ba58.gydF4y2Ba，作为假定的辅受体[gydF4y2Ba59.gydF4y2Ba]．MDS2 (MRH1， [gydF4y2Ba60.gydF4y2Ba])被认为与根毛的形成有关，并与植物钾离子通道AKT2相互作用[gydF4y2Ba60.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba61.gydF4y2Ba]．我们的系统发育和基因结构分析显示DRIK1可能与这两个先前特征的蛋白不同。gydF4y2Ba

假激酶的特点是缺乏激酶活性的保守氨基酸；尽管磷酸化受损，但其中一些蛋白质仍保留与ATP结合的能力[gydF4y2Ba62.gydF4y2Ba]．另一方面，一些催化活性的RLKs具有可有可无的激酶结构域，这取决于途径特异性因子的相互作用[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba63.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba64.gydF4y2Ba]．在植物中，BSK8，一种参与油菜素内酯信号转导的伪激酶，以一种不寻常的构象与ATP结合，并且这种复杂的蛋白质:核苷酸可能调节其他蛋白质[gydF4y2Ba46.gydF4y2Ba]．然而,对于gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1未观察到ATP绑定。类似地，伪转油酶BIR2，BAK1介导的防御机制的负调节剂，也不会与ATP结合;在这种情况下，P环的不寻常位置形成遮挡ATP结合位点的屏障[gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba]．尽管ATP结合口袋被暴露于溶剂中gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1，P循环没有显示有源激酶共有的共有序列，并且THR之间的相互作用gydF4y2Ba^237gydF4y2Ba和glu.gydF4y2Ba^{376.gydF4y2Ba}(from Asp-Leu-Glu motif)表明，这种结构更刚性，可能会损害ATP交换，Kwon等人观察到(2019)[gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba]．此外，活性激酶中保守的Asp-Phe-Gly基序与C-helix中的Glu相互作用，催化赖氨酸分别被Asp-Leu-Glu和Lys取代。这些突变导致该核心相互作用中的重排，导致位于Leu侧链的Asp-Leu-Glu基序的稳定构象gydF4y2Ba^{375.gydF4y2Ba}因此，β1-链和β2-链之间的相互作用也定位了Leu的侧链gydF4y2Ba^240gydF4y2Ba在ATP捆绑袋里，还有提尔gydF4y2Ba^{363.gydF4y2Ba}通过与铰链和β7链上的氨基酸相互作用稳定。虽然这三个氨基酸占据了ATP结合袋，但这个空洞是有结构的，容易接近，可能与其他分子结合，如ENMD-2076。这种小配体除了能阻断ATP结合外，还能优先稳定gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1处于构象状态，能够激活或灭活该蛋白，类似于在若干具有小分子结合的人类激酶和假激酶中观察到的[gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba]．利用共晶体结构，这些分子可以合理地设计来阐明蛋白质在植物代谢中的作用。gydF4y2Ba

生物信息学分析gydF4y2BaZm评选gydF4y2Ba利用公开的玉米RNA-seq数据构建的DRIK1表达模式也表明了玉米基因的可能作用gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1在植物开发中：在各种压力条件下玉米萌发和下调期间的上调表达表明，在压力条件下损害警戒状态的生长调节。这种压力反应机制通常以减少增长的成本[gydF4y2Ba65.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba66.gydF4y2Ba]．另一方面，该基因可能作为应激反应的抑制剂。在这种情况下，在正常条件下，该基因使胁迫响应途径失活，当植物必须应对胁迫时，蛋白质水平下降，释放响应途径。一旦应激状态结束，蛋白质水平就会增加，从而抑制应激反应途径。因此，为了回答这个问题，进一步的生理数据将是必要的，而且超出了当前研究的结构范围。遗传调制gydF4y2Ba“植物”gydF4y2Ba如果可以分配催化活性的蛋白激酶折叠，则是阐明的重要工具gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1在玉米中的功能，而小分子，例如ENMD-2076和改进的衍生物可用于调制gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1通过设计符合特异性抑制剂的设计。gydF4y2Ba

Zm评选gydF4y2BaDRIK1是一种新型的受体样伪激酶，对生物和非生物胁迫均有响应。蛋白激酶结构域载脂蛋白形式的晶体结构证明了ATP结合的缺失以及磷酸化活性的缺失。氨基酸三联Leu的侧链gydF4y2Ba^240gydF4y2Ba,酪氨酸gydF4y2Ba^{363.gydF4y2Ba}和雷gydF4y2Ba^{375.gydF4y2Ba}面对atp捆绑袋，形成一个屏障。由这三个氨基酸的侧链形成的脊柱阻塞了ATP袋，阻止了核苷酸的结合。gydF4y2Ba

基因编码的表达谱gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1提示该激酶可能在下调应激反应基因的表达方面发挥作用，而这在正常情况下是不必要的。然而，当植物受到生物和非生物胁迫时，gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1被下调释放的应激反应基因的表达。gydF4y2Ba

干旱胁迫和其他干扰下玉米激酶下调的鉴定gydF4y2Ba

基因调查数据库[gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba用来选择对胁迫反应的候选基因。通过对干旱胁迫下植物基因表达的分析，筛选出有希望的靶标进行进一步鉴定，包括编码基因Zm00001d028770gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1。从郑等人的公开可用的玉米基因芯片数据。2010 [gydF4y2Ba40gydF4y2Ba选取抗旱敏感玉米品种Han21和Ye478，分别研究干旱条件下下调和复水条件下上调的RLKs。作为排名前十的候选人之一，gydF4y2Bazmdrik1.gydF4y2Ba在所有4个样本(基因型和处理)中均有差异表达log-ratio > 2。所有其他的转录表达谱gydF4y2Bazmdrik1.gydF4y2Ba根据genevinvestigator数据库中提供的实验数据，对不同扰动条件下的数据进行了分析。实验数据从genevresearcher检索，使用GraphPad Prism 6.01 for Windows (GraphPad Software, La Jolla, USA)进行分析和编辑。除特别说明外，所有表达数据均来自mRNA-Seq平台，均来自B73自交系。gydF4y2Ba

植物材料及生长条件gydF4y2Ba

玉米（gydF4y2Ba玉米gydF4y2Ba)自交系B73取自玉米遗传合作种质中心(gydF4y2Bahttp://maizecoop.cropsci.uiuc.edugydF4y2Ba）.种子表面消毒:用含0.1% Tween 20的15%次氯酸钠溶液浸泡15分钟，然后用蒸馏水洗8次。将种子用纸巾包好，在28℃下培养72 h，随后采收或移植到土壤与蛭石1:1 (w/w)混合的花盆中，在28℃、16/8 h日夜条件下的生长室中培养15 d。采集叶片和根系，立即冷冻在液氮中，用于qPCR分析。在干旱胁迫试验中，在25°C光照16 h、相对湿度~ 45%的控制条件下，在PG Mix YARA 14-16-18提供的sphagnum:珍珠岩(7:1 v/v)的混合物中培养幼苗。播后8 d灌灌9、12和14 d，进行渐进性干旱胁迫，对照植株充分浇水。采收后立即用液氮冷冻，使用前保存在−80°C。gydF4y2Ba

克隆、表达和纯化gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1激酶结构域（gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1-KDgydF4y2Ba）gydF4y2Ba

从从幼叶分离的总RNA制备的玉米B73自交系的cDNA用作模板用于编码的DNA片段的扩增gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1激酶域。两个前引物(drik1-ArggydF4y2Ba^{187.gydF4y2Ba}-f - tactctcaatccatgcgagctaagaaaatggggaaccg）;DRIK1-LYSgydF4y2Ba^217gydF4y2Ba- f - TACTTCCAATCCATGAAACGATCAGAGCTGGAAACGG)和两种反向引物(drik1-SergydF4y2Ba^514gydF4y2Ba- r - TATCCACCTTTACTGTCAGCTCTCAGAAGTCATAATCTCAAGC);drik1-ProgydF4y2Ba^488gydF4y2Ba- r - TATCCACCTTTACTGTCAAGGCCCTAGCGCGG)。这些引物的组合产生了四个跨越gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1激酶结构域gydF4y2Ba^{187.gydF4y2Ba}-Ser.gydF4y2Ba^514gydF4y2Ba；利斯河gydF4y2Ba^217gydF4y2Ba-Ser.gydF4y2Ba^514gydF4y2Ba；arggydF4y2Ba^{187.gydF4y2Ba}箴gydF4y2Ba^492gydF4y2Ba；利斯河gydF4y2Ba^217gydF4y2Ba箴gydF4y2Ba^492gydF4y2Ba).用T4-DNA聚合酶处理扩增子进行连接酶非依赖性克隆（LIC）[gydF4y2Ba67.gydF4y2Ba]，在pNIC28a-Bsa4中克隆[gydF4y2Ba67.gydF4y2Ba].通过菌落PCR和测序确认阳性克隆。gydF4y2Ba

将每个构建的质粒pNIC28a-Bsa4转化到BL21(DE3)-pRARE中，接种30 mL LB培养基，在37℃摇瓶中培养过夜。培养物在1.5 L TB培养基中稀释至ODgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba达到1.5 - 2。将培养物冷却至18°C，用0.2 mM IPTG诱导蛋白合成过夜。5 000 x g离心收获细菌;10分钟;4°C，悬浮在2x binding buffer (1x binding buffer是50 mM HEPES pH 7.4, 500 mM NaCl, 5%甘油，10 mM咪唑，1 mM TCEP)与1 mM的PMSF，在−80°C保存。gydF4y2Ba

的suspended pellets were thawed, and the cells were lysed by sonication for 12 min (5 s ON; 10 s OFF; Amp 30%). One milliliter of 5% polyethyleneimine was added per 30 ml of lysate, and the lysate was then clarified by centrifugation at 40,000 x g; 45 min; 4 °C. The supernatant was loaded onto an IMAC column (5 ml HisTrap FF Crude, GE Healthcare, Uppsala, Sweden), and contaminants were washed with a binding buffer with 30 mM imidazole. The recombinant protein was eluted with 300 mM imidazole in binding buffer. Eluted protein was treated with TEV protease to remove the 6xHIS-tag. Contaminants and the tag were removed using nickel beads. As the last step of purification, proteins were injected onto a size exclusion HiLoad 16/60 Superdex 200 pg (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) column equilibrated with binding buffer without imidazole. Fractions of purified protein were pooled together and stored at − 80 °C.

等温量热法gydF4y2Ba

用等温量热法(ITC)测定二者的相互作用gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1-KDgydF4y2Ba^{R187-S514gydF4y2Ba}用核苷酸和小分子配体。对于核苷酸，50μm纯化gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1-KDgydF4y2Ba^{R187-S514gydF4y2Ba}（cell) was titrated with 1 mM GTP or the ATP analog AMP-PNP (injectant) in ITC buffer containing 50 mM K-phosphate pH 7.5, 500 mM NaCl, 5% glycerol, 1 mM TCEP and 5 mM MgCl_2gydF4y2Ba．对于小分子配体，50 μM的ENMD-2076(细胞)滴定，300 μM的gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1-KDgydF4y2Ba^{R187-S514gydF4y2Ba}（注射剂）在没有镁的ITC缓冲液中。在微量自动自动ITC200（GE / Malvern Panalytical，NorthAmpton，UK）上测量相互作用的热量，在25°C下滴定搅拌速度为750 rpm和300秒，每次2μl注射。单独测量倒入缓冲剂和配体的稀释热，然后从蛋白质配体数据中减去。使用EdelHock方法测量该实验中使用的蛋白质浓度[gydF4y2Ba68.gydF4y2Ba]．使用NITPIC，版本1.2.2和Sedphad，版本12.1b软件分析数据。在GUSSI版本1.3.2 [生成图gydF4y2Ba69.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

结晶、数据采集、结构测定、精制gydF4y2Ba

Zm评选gydF4y2BaDRIK1-KD以载脂蛋白形式结晶，并与ENMD-2076结合。载脂蛋白为857 μMgydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1-KDgydF4y2Ba^{R187-S514gydF4y2Ba}4°C、21,130 x g离心10分钟，将纯化蛋白和JCSG-plus HT96 (Molecular Dimension, Maumee, USA)结晶筛上的结晶液以2:1、1:1、1:2的三种比例混合，移液体积为150- hl。共结晶,提纯gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1-KDgydF4y2Ba^{R187-S514gydF4y2Ba}与ENMD-2076在三倍摩尔过量的冰上孵育30分钟。混合物在4°C、21,130 x g条件下离心10分钟，以三种比例(2:1;1:1;1:2)使用自定义优化结晶屏幕(Molecular Dimension, Maumee, USA)。结晶板在20°C孵育至结晶出现。晶体在冷冻保护剂溶液中收集(储液中添加30%甘油)，并在液氮中快速冷冻。衍射数据在高级光子源(APS)或金刚石光源(DLS)上采集。使用第一个XDS处理数据[gydF4y2Ba70gydF4y2Ba]和后者毫无目的，来自CCP4软件套件[gydF4y2Ba71.gydF4y2Ba]．phaser [gydF4y2Ba72.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba73.gydF4y2Ba用蔗糖诱导受体激酶1 (SIRK1)的激酶结构域进行分子置换(PDB: 5UV4)。模型建立后，使用Coot [gydF4y2Ba74.gydF4y2Ba]，然后使用MolProbity对结构因子和坐标进行验证[gydF4y2Ba75.gydF4y2Ba]．结构因素和坐标(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)保存在蛋白质数据库中，载铂的登录号为6CPY，共晶的登录号为6EAS。gydF4y2Ba

差示扫描荧光法gydF4y2Ba

来自Selleckchem (Houston, TX, usa;目录没有。L1200)筛选以确定扶少团团员gydF4y2BaZm评选gydF4y2BaDRIK1-KD。每一个纯化结构的一个微臼齿gydF4y2BaZm评选gydF4y2Ba将DRIK1-KD与DSF缓冲液（100mM K-磷酸盐，150mM NaCl，10％甘油和pH 7.5）混合，含有1：1000 Sypro橙蛋白质热移染料（Life Technologies Corporation，Eugene，Usu），在384--厚板含有10μm的每个文库化合物。随着在100％DMSO中储存在10mm的复合股，用0.1％DMSO的对照作为参考。使用光学透明薄膜密封板，在QuantStudio 6 QPCR仪器中以0.05℃/ s的恒定速率在25至95℃的温度梯度中测量荧光强度数据（应用生物系统，新加坡）。使用Boltzmann功能进行分析数据。与对照曲线相比，通过2℃或更高的熔融温度增加的化合物被认为是阳性。gydF4y2Ba

系统发育分析gydF4y2Ba

氨基酸序列gydF4y2BaZm评选gydF4y2Badrik1相关植物RLK/ pelle - lrr从玉米GDB中提取[gydF4y2Ba76.gydF4y2Ba], Phytozome12 [gydF4y2Ba77.gydF4y2Ba，第4.0号广场[gydF4y2Ba78.gydF4y2Ba]，TAIR [gydF4y2Ba79.gydF4y2Ba], EnsemblPlants [gydF4y2Ba80gydF4y2Ba]和NCBI数据库[gydF4y2Ba81gydF4y2Ba)(附加文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:表S2)。程序itak [gydF4y2Ba82gydF4y2Ba]和Plantsp [gydF4y2Ba83gydF4y2Ba]用来注释激酶组。使用ClustalX比对序列[gydF4y2Ba84gydF4y2Ba]，并用Mega 6产生系统发育树[gydF4y2Ba85gydF4y2Ba]使用邻居连接方法[gydF4y2Ba86gydF4y2Ba和1000个引导复制。进化距离采用泊松校正法计算[gydF4y2Ba87gydF4y2Ba，并以每个位点的氨基酸取代单位表示。这些分析包括了gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba和gydF4y2Baz梅斯gydF4y2BaLRR-VI-2亚家族代表性蛋白质和gydF4y2BaZm评选gydF4y2Ba来自其他物种的DRIK1(附加文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:表S2)。拟南芥的外群序列由其他亚家族表示:催化失活的BSK8 [gydF4y2Ba46.gydF4y2Ba]，催化活性SERK1 [gydF4y2Ba88gydF4y2Ba], BRI1 [gydF4y2Ba89gydF4y2Ba]和clv1 [gydF4y2Ba90gydF4y2Ba]．RLK / Pelle亚家族群分类为Lehti-Shiu等人提出的。2009 [gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]及2012 [gydF4y2Ba91gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

定量实时聚合酶链反应gydF4y2Ba

从3日龄和15日龄B73玉米植株的叶片和根系或干旱胁迫的B73玉米叶片中提取总RNA。样品在液氮中粉状，100-200 mg粉状与1 mL TRIzol (Invitrogen公司，美国卡尔斯bad公司)混合并旋涡。室温孵育10 min后，加入200 μL氯仿，进行短暂旋涡。样品在4°C、12,000 x g条件下离心15分钟，收集水相，并根据制造商说明使用PureLink RNA试剂盒(Life Technologies, Carlsbad, USA)纯化RNA。琼脂糖凝胶检测RNA质量和完整性后，使用SuperScript III逆转录酶(Invitrogen公司，美国卡尔斯巴德)合成cdna。将5微克总RNA与寡核苷酸dT20和dNTP在65℃下孵育5分钟，然后置于冰上冷却。加入Buffer、DTT、SuperScript酶在50℃下孵育60 min。酶在70℃灭活15 min, cDNA在- 20℃保存至使用。gydF4y2Ba

定量实时PCR（qRT-PCR）在10例患者中进行 使用5μL反应混合物 μL 2x Luna universal qPCR主配方（新英格兰生物实验室），0.5 每种底漆的μM（附加文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba:表S3)和3 μL稀释20倍的cDNA。qRT-PCR在QuantStudio 6 (Applied Biosystems, Singapore)中进行，PCR条件为:50°C for 2 min, 95°C for 10 min, 95°C for 15 s, 60°C for 1 min，共40个循环。为了分析单个产物是否形成，在qPCR结束时进行熔化曲线(从60°C开始，以0.05°C/s增加，直到95°C)。βTUB、CYP和EIF4a基因作为内参。qRT-PCR数据采用QuantStudio Real-time PCR软件(1.3版)进行分析。采用ΔΔCt方法进行3个重复的定量，以相对mRNA表达。使用双尾学生t检验计算不同组织和植物年龄之间，或干旱胁迫和复水样品之间的mRNA水平的两两比较。所有数据分析使用GraphPad Prism版本6.01 for Windows (GraphPad Software, La Jolla, USA)。gydF4y2Ba

在当前研究期间生成的晶形数据集可在PDB存储库中使用（gydF4y2Bahttp://www.rcsb.org/structure/6CPYgydF4y2Ba；gydF4y2Bahttp://www.rcsb.org/structure/6EASgydF4y2Ba）.本研究中使用和/或分析的其他数据集可在合理要求下由通讯作者提供。gydF4y2Ba

阿巴：gydF4y2Ba

脱落酸gydF4y2Ba

ATP:gydF4y2Ba

腺苷三磷酸gydF4y2Ba

DAS:gydF4y2Ba

几天后播种gydF4y2Ba

DSF:gydF4y2Ba

差分扫描荧光法gydF4y2Ba

GTP：gydF4y2Ba

三磷酸鸟苷gydF4y2Ba

IEM：gydF4y2Ba

相互作用能矩阵gydF4y2Ba

IMAC:gydF4y2Ba

固定化金属亲和层析gydF4y2Ba

美国国际贸易委员会:gydF4y2Ba

等温量热法gydF4y2Ba

KD:gydF4y2Ba

激酶结构域gydF4y2Ba

LIC：gydF4y2Ba

连接酶独立克隆gydF4y2Ba

远程雷达:gydF4y2Ba

富含亮氨酸重复gydF4y2Ba

存在:gydF4y2Ba

定量实时PCRgydF4y2Ba

RLK:gydF4y2Ba

受体激酶gydF4y2Ba

Zm评选:gydF4y2Ba

玉米gydF4y2Ba

我们感谢生命科学核心设施（Lactad）的员工（Unicamp）（Unicamp）的员工（Lactad）进行ITC分析。我们感谢Rafael M.Couñago协助晶体学和批判性地阅读这款手稿。这项工作通过Upploly MX15433-54在Diamond Light源的提议GUP-54127和BeaCline I03中使用了先进的光子源（DE-AC02-06CH11357）的NE-CAT Beamline 24-ID-E。gydF4y2Ba

本科和VCHS分别是FAPESP博士后(2017/19609-6和2018/06442-9)。FAPESP通过气候变化研究中心基因组学(2016/23218-0)和国家自然科学基金(FAPESP 2014/50897-0 / CAPES/CNPQ)资助PA。这些赠款用于支持实验室的基础设施、设备和执行实验所需的消耗品。结构生物学实验得到了注册慈善机构SGC(编号1097737)的支持，该机构获得了艾伯维、拜耳制药公司、勃林格殷格翰、加拿大创新基金会、Eshelman创新研究所、基因组加拿大、创新药物计划(EU/EFPIA)的资助。， Janssen, Merck KGaA Darmstadt Germany, MSD, Novartis Pharma AG, Ontario Ministry of Economic Development and Innovation, Pfizer, São Paulo Research Foundation-FAPESP, Takeda, and Wellcome Trust [106169/ZZ14/Z]。PA是CNPq生产力研究员。资助机构在研究的设计、数据的收集、分析和解释以及手稿的编写方面没有作用。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 结构基因组学联盟，Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP, Campinas, SP, 13083-886，巴西gydF4y2Ba

   Bruno Aquino，Viviane C. H. Da Silva，Katlin B. Massirer＆Paulo ArrudagydF4y2Ba

2. 气候变化基因组应用联合研究中心(UMIP-GenClima)， Campinas, SP, 13083-875，巴西gydF4y2Ba

   Viviane C. H. da Silva和Paulo ArrudagydF4y2Ba

3. Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)， Campinas, SP, 13083-875，巴西gydF4y2Ba

   Katlin B. Massirer和Paulo ArrudagydF4y2Ba

4. 坎皮纳斯大学生物研究所Genética e Evolução，坎皮纳斯SP, 13083-970，巴西gydF4y2Ba

   保罗阿鲁达gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

BA, VCHS, KM, PA为这个项目奠定了基础。BA和VCHS设计并完成了实验，并对数据进行了分析。BA, VCHS和PA撰写了这篇文章。所有作者均已阅读并批准本稿件。gydF4y2Ba

通讯作者gydF4y2Ba

对应于gydF4y2Ba保罗阿鲁达gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

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