表征gh4cl.基因家族揭示了一个作用gh4cl7.在耐旱性中

背景

4-香豆酸-辅酶a连接酶(4 - coumarte - coa ligases, 4CL)在非生物胁迫下的功能已经在植物中进行了研究，但目前对其功能的了解有限4CL.棉花的基因（G. HirsutumL.）及其作用以应对干旱胁迫。

结果

我们进行了全基因组识别4CL.基因在G. Hirsutum并研究了各种棉花组织中所鉴定基因的表达谱，并响应应力条件，旨在识别4CL.与干旱耐受相关的基因。我们确定了34个推定4CL.基因在G. Hirsutum那个被聚集成三类。同一类的基因通常共享类似的基因结构和基序组合物。许多CIS.- 与应激和植物激素反应相关的 - 在启动子中发现gh4cl.基因。34岁的gh4cl.其中26个基因是由至少一种非生物胁迫诱导的，10个(包括gh4cl7.）在聚乙二醇（PEG）模拟干旱胁迫条件下进行上调。病毒诱导的棉花和过表达（OE）中的基因沉默（Vigs）拟南芥应用于研究生物学功能gh4cl7.在耐旱宽度。这gh4cl7.-沉默棉花植株对干旱胁迫更为敏感，可能是由于相对含水量（RWC）、叶绿素含量和抗氧化酶活性降低、气孔孔径增大、丙二醛（MDA）和过氧化氢（H₂O.₂)。拟南芥过度表达线gh4cl7.然而，对干旱治疗更耐受，这与改善的抗氧化酶活性有关，减少MDA和H的积累₂O.₂在干旱胁迫条件下和上调应激相关基因。另外，与各自的控制相比，gh4cl7.- 纯棉植物和gh4cl7-overexpressing拟南芥线路分别减少〜20％〜20％，分别增加了木质素含量〜10％。与木质素生物合成有关的基因的表达水平，包括朋友那CCOAOMT.那COMT.那CCR.和CAD.，在gh4cl7.-使植物比控制组更安静。综上所述，这些结果表明gh4cl7.可以积极地应对干旱胁迫，因此可能是候选基因，用于改善棉花的耐旱性。

结论

我们的特点是4CL.在高地棉花的基因家庭揭示了一个角色gh4cl7.在木质素生物合成和耐旱性。

棉是许多发展中国家的重要现金作物，经常在干燥的土地或补充灌溉中生长[1]，因为由于家庭、工业和农业用户之间的水资源竞争，农业用水量不再扩大[2]．棉花生产纤维的数量和质量与其发育阶段的有效水分直接相关。当棉花缺水时，特别是在开花和结实期，产量会出现明显的损失，有时会比灌溉的棉花减产50% [3.那4.]．

在长期进化史上，植物形成了复杂的基因代谢网络以适应各种环境变化。作为一个重要的代谢物，木质素对抗生物和非生物胁迫的重要作用[5.那6.那7.]．通过苯丙烷途径合成木质素。4-香豆素-CoA连接酶（4CL，EC 6.2.1.12）是苯丙烷型途径的主要分支点酶，其催化肉桂酸产生相应的COA硫代酯[8.]．4Cl的产品随后用作各种氧酶的底物，用于木质素，黄酮类化合物，花青素，Aurones，斯蒂芬，香豆素，Suberin，Cutin，Sporopolenin等的生物合成的底物，还原剂和转移酶[9.]．这4CL.基因家族在许多植物中已经有了特征，如拟南芥[10]， 白饭 [11]和白杨[12].人类的基因4CL.Dicots中的家庭可以分为两个不同的群体，I型和II型[8.]．I型基因主要涉及木质素生物合成，而II型基因涉及除木质素以外的苯基丙醇的生物合成中。一些含有相同保守基序的额外基因4CL.与4CL蛋白具有高度相似性的被分类为4CL样基因(13]．

研究表明4CL.基因在植物中发挥着重要的作用，如调节生长发育、抵御生物和非生物胁迫[11那14那15].在拟南芥那AT4CL1那AT4CL2,AT4CL4被发现参与木质素形成，是4 CL1 4 CL2双,4 CL1 4 CL2 4 CL3三重突变植株表现出矮化和浓密的表型[10].在rice,OS4CL2在花药中特异性表达并被UV辐射诱导[16]．PlagioChasma阑尾素Thallus.植株表现为PA4CL1当用脱落酸（ABA）处理时，细胞凋亡率升高PA4CL1当用水杨酸和meja治疗时[17].在B.oth poplars and拟南芥的表达水平4CL.通过盐胁迫和伤害诱导基因[7.]．这4CL样基因也可能响应非生物应激的作用[18那19]．过度表达FM4CL样1在烟草中，由于增加木质素的积累和抗氧化酶的活性，以及上调胁迫相关基因的表达水平，增加了耐旱性[19]．尽管如此，我们的知识4CL.棉花的基因家庭非常有限。

了解棉花4CL.基因家族及其在非生物胁迫耐受性中的作用，在本研究中，我们做了全基因组鉴定4CL.基因在G. Hirsutum并分析了基于公开可用的RNA-SEQ数据集的各种非生物应力的表达变化。我们确定了34个推定gh4cl.基因在G. Hirsutum其中26个被发现至少一个应力诱导，包括gh4cl7.在聚乙二醇（PEG）渗透胁迫下上调。我们进一步调查了这个功能gh4cl7.利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)沉默其在棉花中的表达，并获得转基因植株拟南芥植物过表达gh4cl7.．我们的结果表明gh4cl7.响应干旱胁迫的持续作用，是通过基因工程改善棉花抗旱性的潜在候选基因。

基因组鉴定和生物信息学分析gh4cl.基因

使用材料和方法中描述的方法，我们确定了34gh4cl.基因在G. Hirsutum. 它们随机分布在22条染色体和一个未分配给特定染色体的未固定支架上（图。1一张桌子1)。我们把它们命名为Gh4CL1来Gh4CL34根据他们的染色体位置。两双gh4cl.基因，GH4CL10 / 11.和GH4CL21 / 22.，分别在染色体A09和D03上串联排列。节段性重复可能参与12个基因的产生Gh4CLs基于McScanx分析。使用34的系统发育分析gh4cl.基因和4CL.基因A. Thaliana.那g·马克斯那P. Tremuloides.那p . trichocarpa那伊达乌斯,即tinctoria显示它们被聚集成三组（图。1b）。每个同源/副偶像的Ka / ks比gh4cl.对<1（附加文件2:表S1)，表明这些gh4cl.基因在进化过程中经历了净化选择压力，以消除有害突变。

Gh4CLs蛋白长度为129 ~ 576个氨基酸(aa)， ORF为390 ~ 1731 bp，分子量为14.11 ~ 63.08 KD, pI为5.3 ~ 9.77。根据亚细胞定位预测，大多数Gh4CLs似乎与各种生物膜有关(见表)1)。基因结构和基因的分析显示gh4cl.有多个外显子，内含子和图案（附加文件1：图S1;附加文件2：表S2）。所有GH4CL蛋白质都有两个结构域，推定的AMP绑定域“SSGTTGLPKG”（盒I）和保守域“GEICIRG”（BOX II）（附加文件1：图S2）。

CIS.-元素与转录因子结合调控基因的转录水平。识别潜在的CIS.-Elements参与转录的调节gh4cl.基因，我们扫描了CIS.- 在每个启动子区域（ATG上游的2 kB）中gh4cl.基因使用在线工具plantcare [20.]．许多gh4cl.基因患有植物激素响应性和/或应力响应元件，包括ABA响应元件（ABRES），Auxin响应元件（AUXRRR-Core，TGA元件和TGA盒），MEJA响应元件（CGTCA-MOTIF，TGACG-图案），胃肠杆菌素响应元件（TATC-BOX，GARE-MOTIF和P盒），水杨酸响应元件（TCA元素），低温响应元件（LTR），防御和应力响应性元素（富含TC的重复）和干旱响应元素（MBS）（附加文件1：图S3）。

组织特异表达模式gh4cl.基因

各种组织中的表达模式提供了用于感兴趣基因的可能生物学功能的线索。因此，我们分析了对成绩的丰富gh4cl.利用RNA-seq数据(BioProject Accession: PRJNA248163)分析了正常生长条件下不同组织(根、茎、叶、花、胚珠和纤维在花期后5、10、15和20天(DPA))中的基因。21]．我们发现10gh4cl.在所有测试组织中表达基因[基于每百万映射读数（FPKM）≥1]和4个基因每千碱基碱基的片段（Gh4CL3那Gh4CL5那Gh4CL18和Gh4CL27）在分析的所有组织中显示出弱或没有表达（图。2)。此外,8gh4cl.基因(Gh4CL2那Gh4CL4那Gh4CL8那Gh4CL12那Gh4CL17那Gh4CL24那Gh4CL29和Gh4CL30)在茎中高表达(FPKM≥20)，表达水平最高Gh4CL17（FPKM≥84）和6个基因（gh4cl7-8那Gh4CL12那Gh4CL20和Gh4CL30-31）在叶子中强烈表达，观察到最高的表达水平Gh4CL20（FPKM≥202）。

表达分析gh4cl.不同非生物胁迫条件下的基因

自4CL.基因能够应对各种植物物种中的生物和非生物胁迫，我们进一步研究了对成​​绩的丰富gh4cl.使用转录组数据的冷，热，PEG和盐胁迫下的基因G. Hirsutum（Bioproject加入：Prjna248163）[21].我们发现gh4cl.由一个或多个压力显着诱导基因，剩下的8gh4cl.基因(Gh4CL3那Gh4CL5那Gh4CL10那gh4cl18-19那Gh4CL23那Gh4CL28和Gh4CL34)均不是由四种应力中的任何一种引起的(图。3.一种）。比较四个压力条件，更多gh4cl.基因表达响应于盐度，冷和热应力而不是PEG胁迫。值得注意的是，十gh4cl.基因(Gh4CL2那gh4cl7-9那gh4cl11-13那Gh4CL17那Gh4CL22那Gh4CL25和Gh4CL31）表现出增加的表达（治疗FPKM /控制FPKM≥1.5），响应于3小时至12小时的PEG应力。要验证这些结果，我们调查了所选的表达式模式gh4cl.使用定量实时聚合酶链反应（QRT-PCR）在模拟干旱处理下的基因。如图1所示。3.b，表达水平gh4cl7.-8.那Gh4CL12-13那Gh4CL17那Gh4CL22和Gh4CL24在PEG胁迫后3 ~ 24 h，棉花叶片中表达上调，这与基于rna测序的结果一致。

gh4cl7.在木质素生物合成中起重要作用

基于上述启动子的分析结果CIS.- 干旱胁迫下的元素和表达模式，三gh4cl.基因，包括gh4cl7，gh4cl8和Gh4CL13，被认为是候选基因，在调节棉花干旱胁迫反应中具有潜在作用。在这项研究中，我们选择了gh4cl7.通过沉默于棉花和过度表达中的表达来进一步的功能分析拟南芥．

我们用重点沉默的表情gh4cl7.使用TRV矢量（TRV：GH4CL7;附加文件1:图S4)。和富:GhCHLI被用作对Vigs实验的积极控制（附加文件1：图S5）。拟南芥植物过表达gh4cl7.（gh4cl7.- 通过花浸法获得。gh4cl7.属于I类，其基因已被证明可以调节木质素生物合成[10那22]．因此，我们首先研究了是否gh4cl7.也参与了木质素的生物合成，通过比较gh4cl7-OE拟南芥行和TRV：GH4CL7棉花植物具有相应的对照植物。木质素含量增加约10％gh4cl7.- 与野生型（WT）植物相比的 - 一线（图。4.A)，而下降了大约20%TRV：GH4CL7植物与...相比和富:00植物(图。4.b).此外，茎TRV：GH4CL7用甘油糖醇-HCl染色植物以检测木质素的存在（图。4.c).我们发现TRV：GH4CL7降低木质素含量的植物表现出浅红色，但是和富:00植物均显示甘油酸-HCL-HCl染色后的紫红色。这些结果表明gh4cl7.与木质素合成有关。我们还分析了与木质素生物合成相关的苯基丙烷途径基因的表达水平，包括GHPAL.那ghccoaomt1那GHCOMT1那GHCOMT2那GHCOMT3那ghccr1那ghccr2.,GHCAD.．这些基因的相对表达水平较低TRV：GH4CL7植物比在植物和富:00（无花果。4.d），表明gh4cl7.可以通过调控木质素生物合成途径下游基因的转录水平来影响木质素的积累。

沉默的gh4cl7.危及棉花的耐受性

在...之间的表型差异TRV：GH4CL7和和富:00在缺水治疗20天后观察到植物。与这一点相比和富:00植物，植物TRV：GH4CL7植株表现出严重的萎蔫和黄化(图。5.a），与下叶相对含水量（RWC）一致（图。5.b）和减少叶绿素含量（图。5.c).此外，气孔的大小和宽长比也显著增加TRV：GH4CL7植物(图。5.D-F），其可能在干旱条件下加速蒸腾速率，与观察到的更高的水损失相对（WLR）一致（图。5.G）。过氧化氢（h₂O.₂）测量含量和丙二醛（MDA）水平以反映细胞损伤或损伤TRV：GH4CL7和和富:00植物。在干旱压力期间，TRV：GH4CL7植物累积更多MDA（图。5.h）和h₂O.₂（无花果。5.i）与...相比和富:00植物。超氧化物歧化酶（SOD），过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（猫）的活性TRV：GH4CL7和和富:00还测量植物以探索功能gh4cl7.抗氧化酶的调节作用(图。5.j).如预期的那样，在干旱胁迫条件下TRV：GH4CL7与此相比，植物显示出SOD，POD和CAT的活性显着减少和富:00植物。此外，6个与压力相关的基因(Ghabi4.那ghabf4.那GHLEA14那ghrd22.那GHRD29.和ghnced1.)在过去的十年中，这些公司受到了下调TRV：GH4CL7经过干旱处理的植物(附加文件1:图S6)。这些结果表明，沉默gh4cl7.降低棉花的耐受性。

过度表达gh4cl7.在拟南芥增强耐旱性

我们进一步调查了这个功能gh4cl7.对干旱胁迫的反应拟南芥植物过表达gh4cl7..三个独立的gh4cl7-OE线路显示升高的水平gh4cl7.（无花果。6.A）被选择用于在干旱胁迫条件下进行表型。与wt植物相比，这三个gh4cl7-OE系的发芽率降低(图。6.b)，但在甘露醇胁迫条件下，根长显著增加(图2)。6.c、 d）。三周龄的树苗gh4cl7-OE和WT用于水缺乏治疗。之间没有观察到明显的表型差异gh4cl7-由模拟治疗oe和wt。然而gh4cl7-在水缺乏10天后，OE植物显示得比wt不那么损伤（图。6.e）。在干旱胁迫条件下，h₂O.₂的含量和MDA水平gh4cl7-植物比较低于WT的植物（图。6.f-g)，但SOD、POD和CAT活性显著升高(图3)。6.H）。另外，宽度与气孔长度的比率显着下降gh4cl7.-拟南芥植物(图。7.a-b)，与在这些植物中观察到的较低的WLR一致(图。7.C）．进一步阐明可能的机制gh4cl7.在干旱胁迫下，四个已知ABA应答基因的转录水平(AtRD29B那AtRD22那ATABI4.那ATCOR15A.）和两个aba-biosynthesis基因（AtNCED3和AtNCED5)进行了分析gh4cl7-OE系和WT系经过干旱胁迫处理后的植株。qRT-PCR数据显示，这些基因的表达量均被诱导gh4cl7-OE，但没有或只是在WT中略微诱导干旱压力（附加文件1:图S7)。这些结果表明gh4cl7.可以增强转基因的耐受性拟南芥植物对抗压力。

这4CL.基因家族的特征在几种植物中，包括拟南芥，populus trichocarpa，oryza sativa和甘氨酸最大[11那23那24那25]．据报道，这个家族的基因不仅在植物的生长和发育中起作用[16那22那26，而且也是对生物和非生物压力的反应[7.那27]．但是，没有全面分析4CL.基因已经被记录在G. Hirsutum．在这项研究中，我们做了全基因组的鉴定4CL.基因在G. Hirsutum并研究了它们在不同组织和不同应力条件下的表达谱，以期鉴定4CL.在耐受性方面具有潜在作用的基因。总的来说,34gh4cl.成员的身份在G. Hirsutum基因组（表1).在其他植物物种中，例如A. Thaliana.那4CL.基因分为三个课程，即I. I级，II级和4CL样[13]．34gh4cl.基因也可以聚集成三类。我们命名为4CL样类别为III类，其中包含数量最多的gh4cl.基因(共25个)一起AT4CL6-9那At4CL11,II4CL1（无花果。1b）。III级Gh4CLs不能将任何羟基氨基酸基质催化到相应的COA酯中，它们的功能与I类（与木质素生物合成相关）和II类（与黄酮类化合物的生物合成有关）不同的功能4CL.基因(13那18那28]．多个序列比对显示所有4CL样蛋白质含有类似的结构部件，例如，保守箱I和盒子II域没有已知的特定生化功能（附加文件1:图S2) [29]．基因结构分析表明gh4cl.同一类的基因共享类似的内外外显子结构（图。2B)，类似于其他基因家族的观察结果[30.那31那32]．

CIS.-位于基因启动子区域的元件在基因表达的发育和环境调控中起关键作用[33]．根据CIS.- 分析，启动子区域gh4cl.基因具有与应激反应相关的元素，例如ABRE，富含TC，LTR，MBS，TGA元素，TCA元素，CGTCA-MOTIF和TGACG-MOTIF [34那35那36]，建议潜在的作用gh4cl.基因与这些CIS.对干旱、盐、热、ABA和低温等胁迫的调控。4CL.已显示基因涉及应对其他植物的应力[14那27]．基于转录组数据，26gh4cl.基因在胁迫处理和模拟处理之间有差异表达，而且很多gh4cl.干旱诱导基因，包括gh4cl7.（无花果。3.a).发起人gh4cl7.包含MBS.CIS.- 可以与上调相关的元素gh4cl7.干旱治疗（图。3.b）。除此之外gh4cl.基因在不同组织中显示出不同的表达曲线（图。2)，表明它们可能在棉花的生长发育中发挥着广泛的作用。

非生物胁迫经常破坏电池中活性氧物质（ROS）产生和间隙之间的平衡，导致ROS浓度和生物膜，蛋白质，DNA和RNA对氧化损伤，从而抑制植物生长和发育[37那38]因此，清除活性氧对植物抵抗非生物胁迫至关重要。H₂O.₂是ROS之一，其在植物细胞中的积累可能导致氧化损伤，而H水平低₂O.₂浓度与旱耐耐药性相关[39].在thegh4cl7.基因沉默植物，H₂O.₂发现内容在干旱胁迫下显着增加，MDA水平所以是ROS破坏性效应的指标[40]．SOD，POD和CAT是植物细胞中的抗氧化酶，其清除毒性ROS并导致压力条件下的耐受性[41]．我们发现SOD，POD和猫的活动较低TRV：GH4CL7植物比和富:00表明植物的能力降低了gh4cl7.通过沉默植物来清除可能导致膜损伤和叶绿素含量降低的ROS。另一方面Arabodopsis植物过表达gh4cl7.h较低的h水平₂O.₂与干旱胁迫条件下的WT相比，MDA和抗氧化酶（SOD，POD和猫）的更高活性。这些结果与以前的发现一致Fm4CL通过调制ROS的水平，在耐旱耐受中发挥作用[19]．

干旱应激通过对种子萌发，幼苗生长，光合作用和蒸腾的负面影响影响作物产量和质量[1]．我们发现A. Thaliana.植物过表达gh4cl7.在渗透胁迫条件下，具有比WT植物更长的根，但萌发率低于WT植物，表明这一点gh4cl7.在种子萌发中发挥了负面作用，但在渗透胁迫条件下促进根伸长的积极作用。具有繁荣和更深的根系系统的育种作物是遗传学家和育种者的目标，因为它可以在干旱条件下提高作物的生产力[42]．根系变长可能是ABA信号通路改变的结果，ABA信号通路在干旱胁迫下根系发育中起着至关重要的作用[43那44]以及与干旱反应有关的许多其他因素，包括气孔闭合和应激基因调节[45那46.]在干旱胁迫条件下，关闭气孔可以降低蒸腾速率，有助于植物抵抗不利的环境条件。我们的结果表明，在干旱胁迫条件下，气孔的大小更大TRV：GH4CL7植物，表明积极作用gh4cl7.在降低蒸腾速率方面，使棉花保持更有利的水分平衡，并有效提高抗旱性。这是由观察到的较高的WLR在叶TRV：GH4CL7而野生型植株则没有。

木质素是植物中仅次于纤维素的第二大聚合物[47.]．它通过增加细胞壁硬度并提高细胞的压缩强度来为植物提供机械支撑[48.那49.]．我们发现压抑表达水平gh4cl7.在G. Hirsutum降低木质素含量，导致抗旱性降低，这与木质素含量降低的水稻植株更易受到干旱胁迫的结果一致[50.]．研究水曲柳还表明，降低木质素含量导致抗旱性降低[19]．木质素的疏水性被认为对干旱条件下对植物组织的蒸腾产生抑制作用[51.，这可能是原因拟南芥植物过表达gh4cl7.随着木质素含量的水平增加，对干旱更具抗性。

这项研究的结果表明gh4cl7.-沉默的棉花植株对干旱胁迫的敏感性增加，而过表达的棉花植株对干旱胁迫的敏感性增加gh4cl7.增强干旱压力的耐受性拟南芥。gh4cl7.通过增加木质素含量，改善抗氧化系统，闭合气孔和um-ancorcation基因的转录水平来赋予干旱胁迫的耐受性。虽然确切的机制gh4cl7.- 介绍的干旱耐受仍未被发现，我们的结果为此提供了证据gh4cl7.打击干旱胁迫。

身份证明4CL.家庭基因棉花

的注释蛋白序列G. Hirsutum[21]下载自科通根(https：//www.ctongen.org/)。与AMP绑定域（PF00501）对应的隐马尔可夫模型文件从PFAM蛋白质族数据库下载（http://pfam.xfam.org/）并用作查询（P. < 0.001) [52.]搜寻4CL.基因在G. Hirsutum使用HMMER 3.0 [53.]．利用Pfam、SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/）和国家生物技术信息中心（NCBI）保守域名（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）数据库[54.那55.]．

基因结构，保守的主题和启动子分析

长度，分子量（MW）和等电点（P.i）使用扩展网站工具计算已识别的GH4CL蛋白质（http://web.expasy.org/protparam/） [56.]．Psort软件（https://psort.hgc.jp/）用于预测亚细胞定位[57.]．基因结构显示服务器2.0（GSD，http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）用于内含子和外显子分析[58.]．使用Modif Elicitation（MEME）计划的多重期望最大化来识别GH4CL蛋白序列中的保守基序（第5.0.5版，http://meme-suite.org/tools/meme） [59.].潜力CIS.的启动子序列(上游至2000 bp ATG)gh4cl.使用PlantCare计划确定基因（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)。

系统发育树、染色体分布及同线关系分析

GH4CLS的多个序列对准由Clustal X完成[60.]和DNAMAN（版本5.2.2）。大肠杆菌4CL同源蛋白序列拟南芥(At4CL1: OAP14948;At4CL2: OAP07084;At4CL3: AEE34324;At4CL4: AY376731;At4CL5: AY250839;At4CL7: AY376733;At4CL9: AF360250 At4CL11: AY376735)甘氨酸最大（Gm4CL1:AF279267；Gm4CL2:AF002259；Gm4CL3:AF002258；Gm4CL4:X69955），悬钩子属植物idaeus（RI4CL1：AF239687; RI4CL2：AF239686; RI4CL3：AF239685），Populus Temuloides.（Pt4CL1:U12012；Pt4CL2:U12013）和Isatis Tinctoria（II4CL1：ADG46006; II4CL2：KC430622; II4CL3：KC430623）从NCBI下载（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，于2018年7月7日访问）并使用Mega 6.0中的邻居加入方法（NJ）来用于系统发育树分析[61.]引导测试有1000个重复。

所有的gh4cl.基因被定位到G. Hirsutum使用TBTOOLS的基于其物理位置信息的染色体[62.]．两种或更多的同源/副寄生4CL.位于染色体< 200 kb区域的基因被认为是由串联复制事件产生的[63.]．多个CollineAreity Scan Toolkit（MCScanx）用于使用默认参数分析基因重复事件[64.]．每种副寄生的非同义（KA）和同义词（KS）替代品gh4cl.使用Kaks_calculator 2.0计算基因对[65.]．

载体构建和遗传转化

生成拟南芥过表达线，编码序列gh4cl7.使用基因DNA聚合酶（Takara，Takara，Tokyo，Japan）扩增，具有基因特异性的正向和反向引物，并连接到由CAMV35S启动子驱动的PCAMBIA2300载体中。表达载体pcambia2300-gh4cl7.被转化为农杆菌肿瘤术菌株GV3101。拟南芥生态型Col-0（野生型，由中国科学院微生物研究所提供，北京，中国）通过花浸法用于遗传转化[66.]．在1/2 Murashige和Skoog（MS）培养基上选择收获的T0代种子，其中50mg / L卡那霉素，通过PCR进一步验证耐药植物。选择分离率为3：1的单拷贝线，并植入直至T3代。转基因拟南芥在具有16小时光/ 8小时黑暗方案的生长室中生长OE线，并且生长温度设定在约23°C左右[67.]．

PTRV1和PTRV2 VIGS VICTS由华中农业大学龙富朱教授善。来自编码序列的287-BP片段gh4cl7.从cDNA中扩增G. Hirsutum品种茎随后克隆到PTRV2中使用BAMH1和Kpn1 .双重消化产生TRV：GH4CL7向量。经PCR和双酶切确认TRV：GH4CL7构建体变成了根癌电穿孔法分离菌株GV3101。G. Hirsutum简历。将“jun勉-1”(由新疆石河子市石河子大学棉花研究所提供)用在VIGS上，盆栽中填充土壤混合料(腐殖质:蛭石)，置于24±1°C、16 h光照/8 h (200 μmol/m)的生长室内²/s光子通量密度)。VIGS是按照Xiong及其同事先前描述的那样完成的[67.]．

耐旱性分析

进行佩格和天然干旱处理以研究gh4cl7.响应渗透和干旱胁迫。对于PEG治疗，TRV：GH4CL7（Vigs）和和富:00（对照）三叶阶段的植物受到20％PEG6000（w / v）的应力。在处理RNA提取后，在0（CK），1,3,6,6,9,12,24小时，24小时收集叶样品。对于天然干旱治疗，TRV：GH4CL7和和富:00植物未灌溉3周，然后再浇水一次。在水缺失15天后，收集植物叶子以进行RNA提取和生理参数的测定。

为了分析种子萌发和根伸长，种子或3日龄幼苗gh4cl7 -OE拟南芥品系和WT在添加0(对照)、200、300 mM甘露醇的1/2 MS板上生长6天。在营养生长期，7日龄转转基因拟南芥并且将WT植物移植到土壤中，每3天浇水2周，然后在没有灌溉的情况下保持2周，然后再浇水一次。干旱治疗10天后，收集莲座叶以进行RNA提取和生理参数的测定。

测定干旱胁迫相关的生理参数

采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法，按照丙二醛定量试剂盒(苏州科敏生物化学有限公司，中国苏州)的说明书测定丙二醛含量。H₂O.₂用H₂O.₂通过遵循制造商的指示，确定套件（苏州Cominchemistry有限公司）。使用0.1g叶片样品根据荚，SOD和CAT测定套件（苏州），苏州，中国苏州生物化学有限公司）使用0.1g叶样品进行抗氧化酶活性的测量。根据Porra及其同事描述的方法计算叶绿素的总含量[68.]．通过U-5100 UV / Vis分光光度计（日本，日本日本）测量不同波长的吸光度。

WLR，RWC和气孔孔的测量

用于防水测定，离开G. Hirsutum和拟南芥立即称重并在室温下置于生长室，湿度水平约为60％。叶子每小时称重一次。估计WLR相对于初始新鲜重量损失的鲜重量的百分比[69.]．为了测量RWC，从植物中分离出新鲜叶子，并立即记录其新鲜重量（FW）。然后，将叶片在25℃下置于蒸馏水中，在黑暗中，并测量凝结重量（Tw）。通过在65℃下干燥样品直至恒定重量来记录干重（DW）。RWC计算为（FW-DW）/（TW-DW）×100 [70]．

利用快速印迹技术测定气孔面积和大小[71.]．附带叶片覆盖有透明的指甲油，在室温下干燥。指甲油印记被制成临时切片并被蔡司显微镜（立体声发现，德国）拍摄，具有300×放大率。使用图像J软件测量气孔孔的长度和宽度，并且基于宽度与长度的比率计算相对孔区域。

木质素含量测量和组织化学染色

通过乙酰溴法测定木质素含量[72.]和甘油酸-HCL- HCL显色法。茎（上舌上方）的转化gh4cl7.使用剃刀刀片手工切割后28天在播种后28天进行棉花植物。将横截面浸入1ml 1M盐酸中3分钟，然后通过将1ml 10％氟葡糖醇乙醇 - 盐酸溶液转移1分钟，并立即可视化在显微镜下（Zeiss，Stereo Discovery.v20，德国）拍摄[73.]．

RNA提取及实时定量PCR分析

为研究其基因表达模式，提取叶总RNAG. Hirsutum和拟南芥随着EasySpin Plus植物RNA套件（AIDLAB，北京，中国）。使用M-MLV逆转录制系统（Takara，Da Lian）逆转录CDNA的RNA逆转录。在以下条件下，使用电源Sybr Green PCR母混合物（Roche，Rotkreuz，瑞士）在灯圈®480II系统（Roche，Rotkreuz，Switzerland）下进行QRT-PCR：初始预孵育在95°C上5分钟，其次在94℃下进行40次，10 s，59℃，10 s，72℃。通过2分析基因的相对表达水平^-△△Ct方法。结果显示为三次生物复制的平均值。这g .分子histone3基因和拟南芥EF-lα基因用作参考基因。本研究中使用的所有引物使用NCBI底漆设计工具设计（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/，于2018年8月27日访问），并列入了其他文件2:表S3。

统计分析

分别使用SPSS和Graphpad Prism 5进行统计分析和数据绘图。**和*表示在以下方面的显著差异：P.< 0.01和P. < 0.05, respectively.

在“加入号PRJNA248163下，序列数据可在NCBI序列读取存档（SRA）数据库中使用。本研究期间生成或分析的所有其他数据都包含在此手稿中。

• 2021年1月28日

  这篇文章的修订本已经发表，可以通过原始文章访问。

4CL：

4-香豆酸盐 - COA连接酶

中收取:

病毒诱导基因沉默

OE：

超表达

RWC:

相对含水量

MDA:

丙二醛

H₂O.₂：

过氧化氢

WLR：

水损失相对

钉：

聚乙二醇

分区:

开花后的天数

QRT-PCR：

定量逆转录聚合酶链反应

猫：

催化剂

荚：

过氧化物酶

草皮：

超氧化物歧化酶

活性氧：

反应性氧气

WT：

野生型

TRV：GH4CL7：

gh4cl7.vigs植物

和富:00:

空矢量VIGS植物

FPKM:

每千碱基的片段每百万映射读取

不适用。

这项工作得到了中国国家自然科学基金的支持（Grant No：31960438,31360347），中国的国家重点研发计划（Grant No：2016YFD0100200）和石岛大学的繁殖计划（授予No：Yzzx201601）。资金机构在研究和收集，分析和解释方面没有作用，数据和撰写手稿。

隶属关系

1. 新疆石河子大学农业学院绿洲生态农业重点实验室，中国新疆832000

   Shi-Chao Sun，Xian-Peng Xiong，萧丽张，杰孙＆延君李

2. 中国农业科学院棉花研究所棉花生物学重点实验室，安阳，455000，河南

   洪杰峰

3. Csiro农业和食品，GPO盒1700，堪培拉，2601，澳大利亚

   Qian-Hao朱

贡献

S-C S和X-P X设计了实验。S-C S，X-P X和X-L Z执行了实验，分析了数据并准备了稿件。HF贡献了有价值的讨论。Q-H Z，Y-J L和JS读取并修改了稿件。所有作者都提供了有用的讨论并批准了最终版本。

相应的作者

对应于杰太阳或闫君李．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版物

不适用。

利益争夺

提交人声明他们没有竞争利益。

出版商的注意

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。

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