利用综合代谢谱和RNA-seq分析从三个甘蔗品种的果皮和髓中发现涉及花青素生物合成的基因gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

甘蔗(gydF4y2Ba蔗糖officinarumgydF4y2Ba）是糖生产最有价值的原料之一。除了生产工业原料等酒精，造纸，牲畜饲料的纤维，甘蔗可以产生生物活性化合物，如花螺蛋白。花青素生物合成途径的阐明对于具有有利性状的甘蔗品种的分子育种至关重要。我们旨在通过转录组和代谢分析识别参与花青素生物合成的候选基因。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

本研究选用3个不同颜色的甘蔗品种:FN15(绿皮)、ROC22(红皮)和Badila(紫皮)。采用UPLC-Q-TOF/MS和RNA-seq对样品进行代谢组学分析。代谢组学分析结果表明，花青素、花青素(6′-丙二酰葡萄糖苷)、花青素o -葡萄糖苷和芍药o -葡萄糖苷是影响果皮颜色的主要成分。然后，通过RNA-seq分析，分别鉴定出相应品种Badila皮、ROC22和FN15的皮髓组织间差异表达基因(DEGs) 3137、3302、3014个。然后比较了3个品种的皮组织中基因的表达水平。在Badila皮与ROC22皮、Badila皮与FN15皮、ROC22皮与FN15皮之间分别鉴定了2901、2821和3071个deg。我们确定了两种富集途径，包括苯丙素生物合成和类黄酮生物合成。通过序列相似性搜索，共鉴定出15个酶家族的50个unigenes可能与甘蔗皮花色苷生物合成有关。通过与甘蔗花青素含量的共定位分析，鉴定出7个与甘蔗外皮花青素生物合成相关的候选基因。共筛选出25个unigenes进行RT-qPCR分析，qRT-PCR结果与RNA-Seq实验结果一致。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

提出了甘蔗皮中花青素的生物合成途径。这是第一个利用转录组学和代谢组学相结合的方法在甘蔗中生物合成花青素的报道。本研究结果将为培育花色苷含量高的紫髓甘蔗品种奠定基础。gydF4y2Ba

甘蔗(gydF4y2Ba蔗糖officinarumgydF4y2Ba)是制糖最有价值的原料之一[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．年代ugar extracted from sugarcane represents 70 % of global sugar production. The processed by-products of sugarcane can be used as industrial raw materials such as alcohol, papermaking, fiber, and livestock feed, respectively [2gydF4y2Ba］．甘蔗是一种已被证实的生物燃料原料，约占全球生物燃料产量的40% [gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．此外，甘蔗还可以为人体提供大量的生物活性化合物。从甘蔗皮(gydF4y2Ba甘蔗gydF4y2Ba)显示，在浓度为0.625 μ g/ml的HT29细胞系中抑制51.2%可降低结肠癌的风险[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．Duarte-Almeida等人发现甘蔗秆中主要的酚类物质是与抗氧化活性相关的苯丙素[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．然而，甘蔗中的酚类化合物等生物活性物质尚未得到充分的利用和开发。gydF4y2Ba

类黄酮是一类重要的含花青素，黄酮，原花青素广泛存在于植物的叶子和果实酚类化合物。花青素是天然存在的负责颜色在大多数花卉和植物的果实多酚。花青素的膳食消费已经显示出，以减少心脑血管疾病，动脉粥样硬化，癌症，糖尿病和视力失败的风险。这样的有益效果可能与花青素化合物的有效的抗氧化剂活性gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．花青素、芍药苷、malvidin、天竺葵苷、芍药苷和飞燕草苷是六种常见的天然花青素。在正常情况下，花青素主要积聚在植物的器官中，使植物具有丰富的色彩，具有观赏和经济价值[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

花青素对保护植物的生长发育也起着不可缺少的作用。当植物遭受低温胁迫时，CFBs转录因子被激活，影响花青素合成基因的表达，使植物花青素含量增加，抗寒性增强[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．在低温胁迫下，甘蔗叶片花青素含量显著增加，弥补了低温环境中抗氧化剂的缺乏[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．黄酮类化合物在植物中的生产响应光强度而变化[gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba］．当植物暴露于强烈的阳光时，花青素以大量生产，以保护植物叶片免受氧化[gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

此外，花青素对身体的抗氧化和抗癌方面有特定的作用[gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba］．例如，花青素可以降低血脂和胆固醇[gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba］．同时，花青素在治疗青光眼和保护视力方面也有特殊的作用[gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba］．对于所描述的花青素的生物活性作用，在各种植物中增加其内容是最受欢迎的研究主题之一。gydF4y2Ba

甘蔗是一种优良的育种材料，在中国大规模种植。花青素具有很高的经济价值，通过栽培紫心甘蔗可以快速获得富含花青素的甘蔗。天然的花青素和黄酮类化合物已在gydF4y2Ba甘蔗gydF4y2Ba物种如gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba．gydF4y2BaofficinarumgydF4y2Ba，gydF4y2BaS粗壮gydF4y2Ba，gydF4y2Ba芭比尔利gydF4y2Ba以及他们的品种间，跨越的交叉的交叉。例如，Mabry等人。使用光谱和化学证据构建两种黄酮类化合物gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba．gydF4y2BaofficinarumgydF4y2Ba［gydF4y2Ba15.gydF4y2Ba］．Li等从中国甘蔗中系统分离出黄酮类和花青素(gydF4y2Ba美国sinensis RoxbgydF4y2Ba）[gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba］．Li等人测定了黄酮类化合物的含量gydF4y2Ba美国sinensis RoxbgydF4y2Ba［gydF4y2Ba17.gydF4y2Ba]. 赵等发现，不同甘蔗品种的花色苷含量和变异显著，鉴定出13种花色苷及其糖基衍生物[gydF4y2Ba18.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

3-脱氧花青素在甘蔗中的积累已被证实可增强对红腐病菌的抗性gydF4y2Ba炭疽菌falcatumgydF4y2Ba［gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba］．Ganesh等人利用高效液相色谱分析揭示了9种3-脱氧花青素化合物的抗氧化机理gydF4y2Ba炭疽菌falcatumgydF4y2Ba不同甘蔗品种抗性差异[j]。gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．Ganesh等通过研究3-脱氧花青素的抗真菌特性揭示了花青素代谢途径关键基因差异表达的机制[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]. 此外，研究人员还表明，3-脱氧花青素黄酮类化合物可增强玉米蚜虫的抗性gydF4y2Ba高粱二色的gydF4y2Ba［gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．总之，增加花青素含量可能会增加对病原体感染和昆虫攻击的抵抗力。gydF4y2Ba

几个天然红斑gydF4y2Ba甘蔗gydF4y2Ba克隆已描述gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．Chandran等报道了9个红肉糖精种质无性系资源gydF4y2Ba罗布斯坦斯gydF4y2Ba(28 NG 219、NG 77−73、NG 77−75、NG 77−76、NG 77 - 78、NG 77 - 84、NG 77 - 88、NG 77 - 90、NG 77 - 132)。详细讨论了其在产量和形态性状方面的育种价值和应用[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．这些红肉的手杖有很大的育种价值。红肉的存在gydF4y2BaS粗壮gydF4y2Ba克隆人让我们假设繁殖红闪族gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba．gydF4y2BaofficinarumgydF4y2Ba也是可能的。gydF4y2Ba

野生型甘蔗(gydF4y2BaS. Spontaneum L.gydF4y2Ba)已由Jisen Zhang等进行测序和组装[gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba］．然而，迄今为止甘蔗中花青素的生物合成，已经报道了很少的研究。本研究旨在通过将基因表达水平甘蔗品种与不同的外皮颜色进行比较来揭示甘蔗中的花青素 - 生物合成基因。从该研究获得的结果将为紫心心肠培养提供理论依据，并为后续基因克隆，基因功能验证，分子标记筛选和甘蔗品种遗传改善提供基础。gydF4y2Ba

植物材料gydF4y2Ba

我们用了三根甘蔗(gydF4y2Ba美国officinarumgydF4y2Ba)品种:FN15、ROC22和Badila，分别具有绿皮、红皮和紫皮。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.我们收集了福建省农业和林业大学国家甘蔗工程研究中心的甘蔗种质资源苗圃收集了三种品种（26.0886，119.2435 e）。我们用DEPC水重复清洁甘蔗皮的表面。将甘蔗样品的外皮和内髓与锋利的刀分开，切成小块，用锡箔纸包装，在液氮中冷冻，储存在-80℃直至使用。gydF4y2Ba

使用UPLC-Q-TOF / MS分析花青素gydF4y2Ba

如前所述，我们制备了花青素[gydF4y2Ba17.gydF4y2Ba］．该方法包括以下步骤：我们称重200mg样品，然后加入1ml 1％甲醇乙酸溶液，通过摇动混合，使溶液在低温下静置过夜，收集提取物，用1ml 1％甲烷萃取三次将乙酸盐溶液转移到烧瓶中，由1％甲醇乙酸溶液的最终体积为50ml。总之，有三种品种。样品从每个品种的三个个体植物的外皮和髓组织中取出。然后，我们将样品从生物学复制中进行进一步分析。每个样品都有三种生物学重复。标准化合物是Cyanidin，Malvidin，Pelargonidin，芍药蛋白。gydF4y2Ba

我们配备有二元溶剂递送管理器和样品管理器的Waters UPLC I级系统，耦接有Waters VION IMS Q-TOF质谱装备有电接口（Waters公司，米尔福德，USA）光谱仪上进行LC-HRMS分析．我们所使用的柱的Acquity BEH C18柱（100毫米×2.1毫米内径，1.7微米;沃特斯，米尔福德，USA）。The separation was achieved using the following gradient: 5–20 % B over 0–2 min, 20–60 % B over 2–8 min, 60–100 % B over 8–12 min. The composition was held at 100 % B for 2 min, then at 100 to 5 % B for 14–14.5 min, and at 5 % B for 14.5–15.5 min at a flow rate of 0.40 mL/min. Here A is aqueous formic acid (0.1 % (v/v) formic acid) and B is acetonitrile (0.1 % (v/v) formic acid). The injection volume was 3.00 µL, and the column temperature was set at 45.0 °C. ESI ion source was used to ensure the data collected in a negative ion mode.

RNA分离和测序gydF4y2Ba

我们使用mirVana miRNA Isolation Kit (Cat。AM1561, Invitrogen公司，赛默飞世尔科学公司，美国)。使用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)对RNA纯度进行评估和定量。然后，使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)对RNA完整性进行评估。转录组测序和分析由OE Biotech Co.， Ltd (Shanghai, China)进行。简单地说，在Illumina HiSeq X Ten平台上对文库进行了测序，并生成了150 bp的配对端序列。使用Trimmomatic对FASTQ格式的原始数据进行了修正，以去除适配器序列，并过滤掉低质量的读取[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．使用参数“前导= 3”，“尾随= 3”和“minlen = 50”滤除Ploy-N和低质量读取。gydF4y2Ba

de novo装配和功能注释gydF4y2Ba

干净的读数是gydF4y2Ba新创gydF4y2Ba根据配对结束拼接方法将Trinity软件（版本：2.4）组装成转录物[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．我们选择每个单基因的最长转录本进行后续分析。将unigenes与NR (gydF4y2Baftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/FASTA/nr.gzgydF4y2Ba）;SWISS-PROT (gydF4y2Bahttp://www.uniprot.org/gydF4y2Ba)和KOG (gydF4y2Baftp://ftp.ncbi.nih.gov/pub/cog/kog/kyva.gydF4y2Ba）使用爆炸的数据库具有1E-5的电子值截止值。通过将它们的序列映射到基因和基因组的京都百科全书中的序列来分类转录物（Kegg：gydF4y2Bahttp://www.genome.jp/kegg/gydF4y2Ba）数据库[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．根据其最佳命中序列推断出KO数和KEGG参考代谢通路。类似地，unigenes被映射到SwissProt的蛋白质上。他们的基因本体(GO，gydF4y2Bahttp://www.geneontology.org/gydF4y2Ba）从最佳命中的人推断出分类。gydF4y2Ba

基因表达定量和差异基因表达分析gydF4y2Ba

fpkm [gydF4y2Ba26gydF4y2Ba] (fragments Per kb Per Million reads)，使用bowtie2软件计算每个unigene的片段数[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]及eXpress [gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．差异表达的基因（DEGS）使用的DESeq [识别gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]，基于负二项分布的模型。使用Benjamini和Hochberg错误发现率的多次检验对所有统计检验的结果进行了修正。通过|Log检测基因表达显著差异gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba折叠|≥1和根据Deseq中的默认设置，调整后的p值<0.05。我们用TBTOOLS进行了对DEG的分层集群分析[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

富集分析gydF4y2Ba

我们对差异表达基因进行了基因本体（GO）和KEGG富集分析，以描述它们的功能。GO分类是通过使用BLASTN将我们的蛋白质映射到Swissprot中的蛋白质来进行的。然后从SwissProt中hit蛋白的注释中提取相关GO术语。使用KOBAS数据库进行KEGG富集分析(gydF4y2Bahttp://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3gydF4y2Ba）.之后，我们统计了每个GO通路和KEGG通路中包含的差异基因的数量。然后利用超几何分布检验方法计算各GO条目和KEGG中差异基因富集的显著性。对得到的p值进行修正，以计算错误发现率(FDR)或调整后的p值。以调整后的p值< 0.05作为显著富集的截止值。gydF4y2Ba

rna测序实验验证gydF4y2Ba

我们对用于RNA测序实验的RNA样本进行了逆转录-定量实时PCR (RT-qPCR)分析。每个实验有三个技术重复。1µl总RNA用带有gDNA橡皮擦的PrimeScript™RT试剂试剂盒处理。反应包括两个步骤。首先，基因组DNA去除反应包括1µL RNA、1µL gDNA橡皮、2µL 5×gDNA橡皮缓冲液、16µL RNase Free水。逆转录反应包括1µL PrimeScript RT酶Mix、1µL RT引物Mix、4µL 5×PrimeScript Buffer 2,4µL RNase Free water。基因特异性引物由IDT (gydF4y2Bahttps://sg.idtdna.com/Primerquest/Home/IndexgydF4y2Ba）[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．所有引物见表gydF4y2BaS1gydF4y2Ba．我们选择NADPH基因作为内源性控制。逆转录定量实时PCR反应含有10μL2×主混合物，2μLcDNA，0.5μL10μMPCR基因特异性前引物，0.5μL10μMPCR基因特异性反向引物，7μLRNase游离水。循环条件为30秒，30秒，具有40个循环。为了建立PCR产物的熔化曲线，在扩增反应结束后，压（95ºC，10秒; 60℃，60℃;95ºC，15）;并慢慢加热60ºC至99ºC。对每个样品的靶基因和内部参考进行实时PCR反应，对每个样品测试三个复制孔，并通过2分析数据gydF4y2Ba^{-gydF4y2Ba△gydF4y2Ba△gydF4y2BaCtgydF4y2Ba}方法(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在甘蔗的外皮与花色苷的生物合成结构基因的2.8分析gydF4y2Ba

与甘蔗果皮花青素生物合成相关的结构基因鉴定如下。首先，我们从KEGG途径下载id为ko00941（类黄酮生物合成）和ko00942（花青素生物合成）的基因序列，以构建本地参考数据库。然后，使用BLASTX算法（v2.7.1+）在本地参考数据库中搜索从本研究RNA-seq实验中获得的单基因序列[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba， e值的截止值为1e-5。第三，使用带有默认参数的TransDecoder程序(v5.5.0)对选定的unigenes进行开放阅读框(ORF)识别。最后，使用orf对CD-search数据库进行检索gydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgigydF4y2Ba与1E-5的e值截止。我们确定基于CD-搜索结果全长蛋白质序列。使用TBtools软件（版本1.05）进行了计算相关花青素生物合成的基因的表达谱和花青素的甘蔗的衍生物的含量之间的Pearson相关系数。gydF4y2Ba

我们使用肌肉进行全长序列的多个序列对齐[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．我们使用GeneDoc软件将多序列比对结果可视化[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．全长基因系统发育分析采用MEGA7软件中的最大似然估计方法[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．我们根据1000次重复计算了引导评分。我们使用加权相关网络分析(WGCNA)来确定表型和差异基因之间的关系，并使用WGCNA的R包[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

花青素与甘蔗有关gydF4y2Ba

采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF/MS)获得了皮蔗品种和髓蔗品种的总离子色谱图，比较了三个甘蔗品种中黄酮类化合物和花青素的含量。我们通过保留时间、准确相对分子质量、MS/MS裂解片段以及之前报道的数据对甘蔗的化学成分进行了鉴定。数字gydF4y2Ba2gydF4y2Ba显示Cyanidin O-葡萄糖苷（A），甘油蛋白O-葡萄糖苷（B），甘油蛋白（6'-丙酰硫代葡萄糖）（C）的甘油蛋白的光谱。Cyanidin O-葡萄糖苷显示C21H21O11的公式，并具有M / Z 449的保留时间为6.65，其产生位于M / Z 287的一个片段。过渡449> 287表示葡萄糖（M / Z 162）的损失（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa).芍药苷o -葡萄糖苷的分子式为C22H23O11，保留时间为7.53,m/z为463。形成m/z 301片段，对应peonidin C16H13O6 (m/z 301.07051)。gydF4y2Ba2gydF4y2BaB）。花青素（6'- malonylglucoside）显示C24H23O14的公式和7.99具有m / z 535.10814，这就产生一个片段M / Z 448和287的保留时间（图gydF4y2Ba2gydF4y2Bac).过渡535 > 448代表丙二酰(m/z 87)的损失，过渡535 > 287产生cyanidin (m/z 287)是由于葡萄糖和丙二酰的损失。gydF4y2Ba

如表所示gydF4y2Ba1gydF4y2Ba在甘蔗果皮和果髓中，共鉴定和定量了7种花色苷。甘蔗果皮和髓中的花青素主要为花青素，包括花青素、花青素(6′-丙二酰葡萄糖苷)和花青素o -葡萄糖苷。果皮样品的总花青素含量高于髓样品。皮中花青素、花青素(6′-丙二酰葡萄糖苷)、花青素o -葡萄糖苷和芍药苷o -葡萄糖苷peonidin_C6含量高于髓中含量。紫色Badila皮中芍药苷、花青素(6′-丙二酰葡萄糖苷)、花青素o -葡萄糖苷、芍药苷o -葡萄糖苷含量显著高于ROC22和FN15皮中含量。因此，花青素衍生物是甘蔗外皮中含量最丰富的成分，是影响甘蔗外皮颜色的主要因素。gydF4y2Ba

3个甘蔗品种果皮和髓组织的RNA-seq分析gydF4y2Ba

我们构建了6组cDNA文库从三个甘蔗品种具有不同颜色果皮探索甘蔗皮穰组织花青素生物合成和积累的分子机制。六个样品被命名为Badila_rind（紫色），Badila_pith;ROC22_rind（红色），ROC22_pith;FN15_rind（绿色），FN15_pith。去除适配器，低质量序列，并且读取小于35个碱基后，我们获得了55.5，57.1，55.2，59.9，6.1 5，和5720万干净读取的六个样品。这些干净的数据，使用三位一体的组合，我们得到73916个Unigenes超过300基点。那些个Unigenes的平均长度为646个碱基，和N50的长度为1398碱基对。分布为个Unigenes的长度示于图。gydF4y2BaS1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

为了了解这些基因的推测功能，我们使用BLASTN和BLASTX将73,916个unigenes与5个公共数据库进行了比较。数据库包括:NR、GO、SWISSPROT、KEGG、KOG。最后，在NR、KOG、KOG、KEGG、SWISSPROT和GO数据库中分别注释了43,546、21,210、8,297、27,966和23,821条unigenes。所有数据库注释的unigenes有6114个，而只有一个数据库注释的unigenes有43827个(图)。gydF4y2BaS2gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

23 821个带有GO术语的unigenes被划分为64个功能组，分别属于3个主要的GO分类:生物过程、细胞成分和分子功能(图)。gydF4y2BaS3gydF4y2Ba）.相比之下，16,133个独特的序列被分配到KEGG通路(图。gydF4y2BaS4gydF4y2Ba）。前10名最映射的途径是“运输和分解代谢”（1,013序列），“细胞生长和死亡”（1,022序列），“信号转导”（3,005序列），“翻译”（1,027序列），“碳水化合物代谢“（1,748序列），”氨基酸代谢“（1,057序列），”脂质代谢“（994序列），”折叠，分选和降解“（944序列），”复制和修复“（776序列），”能量代谢““（714序列）（图。gydF4y2BaS3gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

实时PCR验证血清素相关基因的表达水平gydF4y2Ba

为了验证RNA-seq数据，我们选择了25个unigenes进行RT-qPCR分析。这些基因属于花青素和类黄酮生物合成途径，其序列显示在supplementary file1中。三个基因(CL22745Contig1 CL1Contig881 CL19401Contig1)属于CHS的家庭,两个基因(CL1Contig5298 CL19316Contig1)属于气的家庭,一个基因(CL6788Contig1)属于LDOX家庭,三个基因(CL15263Contig1、CL186Contig2 CL1Contig6521)属于F3’5是什么家庭,两个基因(CL3124Contig1,CL3124Contig2)属于F3'H家庭,三个基因(CL1Contig2216、CL576Contig1 CL576Contig2)属于FLS的家庭,五个基因(CL6042Contig1、CL23185Contig1 CL28592Contig1, CL28006Contig1, comp35647_c0_seq1_2)属于LDOX家庭,四个基因(comp62628_c0_seq1_1、comp72111_c0_seq1_1 comp74241_c0_seq1_2,comp131906_c0_seq1_1基因属于UFGT家族，CL19110Contig1基因属于BZ2家族，comp74919_c0_seq1_2基因属于MYB家族gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.我们以同一品种甘蔗的皮中基因表达量减去髓中基因表达量作为基因的相对表达量。如图所示。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba64%的qRT-PCR结果与RNA-seq实验结果一致。这些数据表明，在我们的转录组分析中，从FPKM值推导出的表达模式是可靠的，可以用于下游基因表达分析。gydF4y2Ba

甘蔗果皮和果髓的差异表达基因gydF4y2Ba

为了鉴定甘蔗果皮和髓组织中的差异表达基因(DEGs)，我们首先分析了甘蔗果皮和髓组织之间的差异表达基因(DEGs)。badila_皮与badila_髓之间有上调的基因2559条，下调的基因703条。相比之下，roc22_pind与roc22_piith之间有2138个上调的基因，999个下调的基因。最后，FN15_rind与fn15_piith之间的unigene上调1687个，下调1732个。甘蔗果皮和髓间共有1872个DEGs的表达谱与花青素含量相关，Pearson相关系数为阈值0.9(表1)gydF4y2BaS2gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

然后，我们在三个品种的皮组织中鉴定了DEGs。Badila(紫色果皮)与FN15(绿色果皮)之间有1760个上调的转录本和1061个下调的转录本;ROC22(红色果皮)和Badila(紫色果皮)之间有1,922个上调转录本和1149个下调转录本;FN15(绿皮)和ROC22(红皮)之间有1668个上调转录本和1233个下调转录本(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.甘蔗果皮间共有1746个DEGs的表达谱与花青素含量相关，Pearson相关系数阈值为0.9(表1)gydF4y2BaS3gydF4y2Ba）.其中，ScLDOX (CL6788Contig1)、ScF3H (comp30564_c0_seq2_1)、ScGT1_7 (comp43983_c0_seq1_2)与花青素生物合成相关。gydF4y2Ba

接下来，我们确定了三个品种的皮穰组织之间的当选总监。这些当选总监的比较结果显示在维恩图（图gydF4y2BaS5gydF4y2Ba）.如图所示，在所有三种甘蔗品种中共用637次抗凝血。在Badila和Roc22，Badila和Fn15，ROC22和FN15之间共享200,250和426次，分别在（图。gydF4y2BaS5gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

最后，我们比较了三个品种的皮组织中的基因表达水平。以FN15在甘蔗外皮的表达水平为对照，测定了Badila与FN15、ROC22和FN15之间的dge。结果如图所示。gydF4y2BaS6gydF4y2Ba．Badila / FN15有2821次频率。相比之下，ROC22 / FN15有2901次频率。最后，两组之间有574个分享。gydF4y2Ba

富集分析DEGSgydF4y2Ba

从六对比较鉴定的次数进一步进行了Kegg途径富集分析与RIND组织和髓组织中与花青素生物合成相关的筛选基因。含有以下20个富集的途径：类固醇生物合成，类固醇激素生物合成，苯丙酮化生物合成，黄酮类生物合成，色氨酸代谢，脂肪酸伸长，亚油酸伸长率，吲哚生物碱生物合成，吲哚氧基化物和二羧酸二羧酸酯代谢，氰基氨基酸代谢，Sesquinoid代谢，Sesquina酸代谢，和三萜类生物合成，不饱和脂肪酸的生物合成，斯蒂屈甲骨，二芳基酮和姜醇生物合成，MAPK信号途径，视黄醇代谢，碳固定途径，煤炭信号通路，间隙交界处，Cutin，Suberine和蜡生物合成，泛醌和另一种三萜 -醌生物合成（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.特别是，苯丙烷化生物合成是最富集的途径。在所有上述比较中，都富集了花青素生物合成和黄酮类生物合成。结果表明，在许多代谢过程中富集，包括类黄酮和花青素生物合成途径。gydF4y2Ba

候选基因的鉴定果皮与花青素合成gydF4y2Ba

基于与类黄酮合成KEGG通路(ko00941)和花青素合成KEGG通路(ko00942)的序列相似性，我们确定了可能与花青素合成相关的基因。如表格所示gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，我们鉴定了总共51个基因。These included the following: three CHS (chalcone synthase), two CHI (chalcone–flavanone isomerase), one F3H (Flavanone 3-hydroxylase), two F3’H (flavanone 3’-hydroxylase), three F3’5’H (flavonoid-3’,5’-hydroxylase), one LDOX (leucoanthocyanidin dioxygenase), one MYB (myeloblastosis), one BZ2 (Bronze 2), seven ANR (anthocyanidin reductase), three FLS (flavonol synthase), eight BZ1 (anthocyanidin 3-O-glucosyltransferase), eleven GT1(anthocyanidin 5,3-O-glucosyltransferase), three 5MaT (malonyl-CoA: anthocyanidin 5-O-glucoside-6’’-O-malonyltransferase), one 3MaT (malonyl-coenzyme A: anthocyanin 3-O-glucoside-6’’-O-malonyltransferase) and two MF (O-methyltransferase). To validate the full-length coding sequences, we conducted multiple sequence alignment and phylogenetic analysis for these genes: CHS (Fig.S7gydF4y2Ba)、气(无花果。gydF4y2BaS8gydF4y2Ba), F3H(无花果。gydF4y2BaS9gydF4y2Ba), LDOX(无花果。gydF4y2BaS10gydF4y2Ba），BZ2（图gydF4y2BaS11gydF4y2Ba)，MYB（图。gydF4y2BaS12gydF4y2Ba), ANR(图。gydF4y2BaS13gydF4y2Ba），BZ1（图gydF4y2BaS14gydF4y2Ba), GT1(无花果。gydF4y2BaS15gydF4y2Ba), 5垫(无花果。gydF4y2BaS16gydF4y2Ba), 3垫(无花果。gydF4y2BaS17gydF4y2Ba）.多序列比对显示，这些基因在甘蔗和其他植物中具有高度的保守性。gydF4y2Ba

为了研究与花青素生物合成有关的这些推定基因的共表达模式，我们使用欧几里德距离作为度量和病房的方法进行了这些51基因的表达谱的分层聚类和Cyanidin的衍生物的含量。如图所示。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，两个主要的星团很容易辨别，它们被命名为C1和C2。包含7个单基因的C1簇在果皮中的表达水平最高，其中含有最高水平的氰基衍生物。这7个单基因分别为ScCHS1、ScF3H、ScLDOX、ScMYB、ScBZ2、ScBZ1_2、ScBZ1_4。除ScBZ1_4外，所有基因均具有完整的编码序列。这些基因可能在花色苷生物合成中发挥重要作用，其确切功能将是未来研究的主题。gydF4y2Ba

为了进一步研究DEGs与花青素化合物丰度之间的关系，我们进行了WGCNA分析。如图所示。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，所有果皮样品聚集在一起，所有果髓样品聚集在一起。在紫色外壳中，基因模块成员的表达水平上调。基因模块与这些花青素化合物的丰度具有最高的相关性，包括花青素、天竺葵素、芍药素、花青素（6’-丙二酰糖苷）、花青素O-葡萄糖苷和芍药素O-葡萄糖苷。有趣的是，在绿皮甘蔗中，malvidin的丰度与基因表达谱高度相关。gydF4y2Ba

甘蔗果皮和髓中花青素的鉴定gydF4y2Ba

花青素是植物次生代谢产物，广泛分布于蔬菜、水果、药用植物等植物中。为了提高特定植物组织中的花青素含量，已经做了一些努力。例如，紫心甘蓝的花青素含量增加了[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．花色苷糖基化修饰影响花色苷在细胞中的稳定性。在紫色马铃薯和拟南芥中，花青素生物合成后的第一步是糖基化形成花青素-3- o -葡萄糖苷。然而，下游的糖基化修饰完全不同。在拟南芥中,木糖集团转移到C2位置anthocyanin-3-O-glucoside由糖基转移酶催化At3GGT (UGT79B1),而在紫色的土豆,一个葡萄糖分子可能转移到C2位置anthocyanin-3-O-glucoside催化的糖基转移酶(Ib3GGT)形成anthocyanin-3-O-sophoroside [gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

我们的长期目标是培育紫心肌糖含量，具有高花青素含量。在这里，我们进行了组合的代谢组和转录组分析，以鉴定参与花青素生物合成和调节的基因。通过UPLC-Q-TOF / MS在甘蔗的外皮和髓中鉴定了总共7个花青素（表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.结果表明，花青素衍生物是甘蔗果皮颜色的决定因素。gydF4y2Ba

本研究的结果可能与其他花青素的影响有关。首先，增加苯丙氨酸途径所涉及的基因的表达导致多酚的增加水平[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．多酚化合物，如花青素，在糖提取过程中可能会因多酚氧化酶的作用而发生褐变[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]. 然而，以前的报告发现蔗糖浓度在20%左右 % 对花青素褐变有保护作用[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．此外，pH和单体花青素含量对富花青素果汁的褐变也有影响。外源施用抗坏血酸对韧皮部变色有预防作用。［gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．综上所述，甘蔗提取过程中花青素的富集会导致褐变。同时，可以采取有效措施，显著降低褐变程度。gydF4y2Ba

有三个问题需要注意。首先，有六种天然花青素。然而，我们检测到其中四种及其糖基衍生物，因为我们没有检测到两种天然花青素，飞燕草苷和矮牵牛苷。有两个可能的原因：（1）样品制备方法不是提取物质的最佳方法，并且物质不在提取溶液中(2） 该物质提取成功，但含量太低，可能低于仪器的检测限。gydF4y2Ba

其次，通常认为麦芽蛋白的含量与组织颜色相关。然而，麦比蛋白的含量高于髓中（较小）比外皮（更丰富多彩）更高，特别是对于FN15和ROC22（表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）与一般思想相反。这可能是由于植物的复杂颜色形成机制。例如，在不同的花青素组合或pH值下植物组织中花青素的共色沉着可以显示出不同的结果[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba］．具体原因目前尚不清楚，需要进一步调查。gydF4y2Ba

其三，由于花色苷有许多不同形式的异构体，缺乏标准化合物，质谱分析无法推断花色苷的准确结构。因此，只有通过对花青素质谱信息的分析，才能对花青素的组成和含量进行初步的定性和定量分析。gydF4y2Ba

甘蔗花青素生物合成候选基因gydF4y2Ba

通过在甘蔗中具有含有花青素含量的相关分析，我们发现7个基因的表达谱与花青素丰富的那些相互作用。七个基因是SCCHS1，SCF3H，SCLDOX，SCMYB，SCBZ2，SCBZ1_2，SCBZ1_4。CHS基因在水稻中的过度表达导致花青素积累[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba］．由R2R3-MYB、basic-helix-loop-helix (bHLH)和WD40蛋白组成的转录激活复合物(命名为MBW复合物)已被证明可以控制花青素结构基因的表达[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．F3H突变细胞不能合成花青素并保持白色[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．拟南芥TDS4基因编码白花青素双加氧酶(LDOX)。它是原花青素合成和液泡发育的关键[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．由Bronze2 (BZ2)编码的谷胱甘肽s -转移酶执行玉米花青素生物合成的遗传定义的最后一步，是将色素隔离到液泡中所必需的[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba］．基于以上结果，我们推测花色苷生物合成及相关调控基因的不同表达模式对甘蔗颜色的影响。这些信息揭示了其他植物花青素糖基化的进化过程，为通过基因工程生产特定的花青素化合物提供了新的思路。gydF4y2Ba

甘蔗皮中花青素生物合成的可能途径gydF4y2Ba

花青素的生物合成途径在高等植物中是保守的(Naing和Kim, 2018)。我们鉴定了几个参与花青素生物合成的酶编码结构基因[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．它们包括:苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)， 4-香豆素:辅酶a连接酶(4CL)，查尔酮合酶(CHS)，查尔酮异构酶(CHI)，黄酮-3 ' -羟化酶(F3 ' h)，黄酮-3 '，5 ' -羟化酶(F3 ' 5 ' h)，黄酮3-羟化酶(F3H)，二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)，花青素合酶(ANS)，和udp -葡萄糖:类黄酮3- o -葡萄糖基转移酶(UFGT) [gydF4y2Ba51gydF4y2Ba］．到目前为止，花青素在甘蔗外甘蔗中的生物合成机制尚不清楚。在这项研究中，我们发现Cyanidin的衍生物是影响甘蔗外皮颜色的主要因素。通过用不同的外皮颜色分析三种不同的甘蔗品种的转录组数据，我们假设甘蔗皮下的花青素生物合成的推定途径（图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba）.推测途径包含15个蛋白家族，包括CHS、CHI、F3H、F3 ' h、F3 ' 5'H、ANR、BZ2、MYB、GT1、FLS、BZ1、ANS、5MaT、3MaT和MF。在本研究中，我们没有在甘蔗的果皮和髓中发现DRX基因，这可能与该基因的组织特异性表达有关[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba］．这些结果将进一步加深对甘蔗皮中花青素生物合成途径的认识。gydF4y2Ba

本研究采用转录组学和代谢组学相结合的方法研究了甘蔗皮和髓中花青素和类黄酮的生物合成。通过对甘蔗中花青素类化合物的UPLC分析，发现花青素类衍生物是导致甘蔗果皮色泽差异的主要因素。其次，通过比较转录组分析，鉴定甘蔗品种的果皮和髓间的差异表达基因。第三，根据序列相似性鉴定了51个可能与花青素和类黄酮合成相关的基因。第四，通过与花青素衍生物含量的相关性分析，筛选出7个与花青素和类黄酮生物合成相关的候选基因。最后，我们提出了一个假设的分子模型来解释花青素在甘蔗中的生物合成及其苷衍生物。这些结果为通过基因工程和分子育种提高甘蔗花色苷产量奠定了基础。本研究为甘蔗花色苷的研究提供了宝贵资源，为甘蔗花色苷遗传育种的改进提供了分子基础。gydF4y2Ba

本研究生成的原始读取数据已保存在BioProject中，登录号为PRJNA573557 (gydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/prjna666228gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

RNA-SEQ：gydF4y2Ba

RNA-seq测序gydF4y2Ba

UPLC-Q-TOF/MS：gydF4y2Ba

超高效液相色谱 - 四极杆飞行时间质谱法gydF4y2Ba

度:gydF4y2Ba

差异表达基因;RT-qPCR:实时定量逆转录聚合酶链反应gydF4y2Ba

ORF：gydF4y2Ba

开放阅读框架gydF4y2Ba

WGCNA:gydF4y2Ba

加权相关网络分析gydF4y2Ba

国家创新药物[2019ZX09735-002]、国家科技基础资源调查计划[2018FY100705]、国家自然科学基金[81872966]资助项目。中国医学科学院医学科学创新基金(CIFMS) [2017-I2M-1-013]。国家甘蔗工程技术研究中心开放基金[KJG16005R]。福建农林大学科技创新专项基金[KFA17263A]， [KF2015080]， [KF2015118]。gydF4y2Ba

作者笔记gydF4y2Ba

隶属关系gydF4y2Ba

1. 福建农林大学遗传、育种与综合利用教育部重点实验室，福建农林大学农业工程国家工程研究中心，350002，福州，福州，P.，福建省R中国gydF4y2Ba

   倪杨，刘迪，曾丽辉，陈平华gydF4y2Ba

2. 中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京100193gydF4y2Ba

   陈海梅，刘畅gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

刘畅、陈平华构思了该研究;倪杨、陈海梅进行数据分析并起草手稿;采集甘蔗样本，提取RNA进行测序;刘畅对手稿进行了批判。所有作者已阅读并同意手稿的内容。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

通信gydF4y2Ba陈平华gydF4y2Ba要么gydF4y2Ba刘张gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

杨妮和陈海梅是第一作者gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文是基于知识共享署名4.0国际许可,允许使用、共享、适应、分布和繁殖在任何媒介或格式,只要你给予适当的信贷原始作者(年代)和来源,提供一个链接到创作共用许可证,并指出如果变化。本文中的图像或其他第三方材料都包含在本文的知识共享许可中，除非在该材料的信用额度中另有说明。如果资料不包括在文章的知识共享许可协议中，并且你的预期用途没有被法律规定允许或超过允许用途，你将需要直接从版权所有者获得许可。如欲查阅本许可证副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．Creative Commons公共领域奉献豁免（gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba）适用于本文中提供的数据，除非另有用入数据的信用额度。gydF4y2Ba

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