FLA14.GydF4y2Ba在高湿度条件下，花粉发育和防止花粉过早萌发需要什么GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

作为阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGPs）的一个重要亚家族，筋膜层蛋白样AGPs（FLAs）对生长、发育和适应的各个方面都有贡献，但它们的功能在很大程度上仍然是难以捉摸的GydF4y2BaFLA3.GydF4y2Ba和大米GydF4y2BaMTR1GydF4y2Ba据报道，都与有性生殖有关。在这项研究中，另一个拟南芥的fla编码基因，GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba，并对其作用进行了调查。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

拟南芥GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba被发现是花粉谷物特异性基因。用绿色荧光蛋白的融合结果表达结果显示，FLA14沿细胞膜和Hechti股线局部定位。一个功能突变突变体GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba在雄性配子发生过程中没有显示出可辨别的缺陷，但在高水分条件下，在成熟的花药中发生了早熟的花粉萌发。过度的GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba引起了39.2％的花粉颗粒，出现了萎缩和枯萎的外观，导致大量降低了肥力，短的成熟体积和较低的种子集。细胞学和超微镜下观察表明异位表达GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba在单核期引起分裂，导致没有内含物的塌陷花粉或外观正常但内含物增厚的花粉。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

综上所述，我们的数据表明GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba在较高的相对湿度下，对花粉发育和防止花粉在花药内过早萌发具有重要作用。GydF4y2Ba

在开花植物中，花粉是雄性精子的生物保护剂，负责通过花粉管将双精子细胞输送到胚囊进行双重受精[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba］.Angiosperm Pollen Ontobise由两个连续阶段组成：发育阶段，导致成熟花粉晶粒和功能阶段[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba］.雄性配子体的发育发生在雄蕊的花药室中。它是一个复杂的过程，由小孢子细胞开始减数分裂，从而形成单倍体小孢子四分体，并在花期释放成熟花粉粒结束[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba］.四分体阶段后，由小孢子本身和孢子体绒毡层控制的多层花粉壁的精确构建是花粉发育的主要事件[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba］.花粉壁的基本结构在不同物种间高度相似，包括一个内果胶纤维内层和一个外孢子粉质基的外壁层，外壁层充满了三乙醇胺(花粉被)[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba］.外泌体主要成分为孢粉素，由内外泌体和外泌体组成，形成由杆状茎和顶盖组成的三维结构[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba］.内层是花粉壁的最后一层，由水解酶、疏水蛋白、纤维素、半纤维素和果胶聚合物组成[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba］.成功的雄性配子体发育需要不同的配录和孢子素细胞的协调活性，并且涉及广泛的特定基因的适当表达[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba］.花粉个体发生的功能阶段开始于花粉粒在柱头表面复水活化，随后萌发和花粉管爆裂性生长，最后完成双受精[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba］.在拟南芥中，小孢子增殖到最终分化花粉的进程模式非常清楚[GydF4y2Ba10GydF4y2Ba，通过大量的遗传和转录组学研究，分离出了与这一独特过程相关的几个关键成分，有助于揭示雄性配子发生、花粉萌发和花粉管生长的调控机制[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11GydF4y2Ba那GydF4y2Ba12GydF4y2Ba］.GydF4y2Ba

Arabinogalactan蛋白质（AGPS）是高糖基化糖蛋白，其各自包含O-糖基化的核心骨架和主要由半乳糖和阿拉伯糖组成的阿拉伯半乳酰胺多糖链[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba那GydF4y2Ba14GydF4y2Ba］.AGPS在所有植物组织和细胞中都是普遍的，在细胞壁，质膜，痉挛性空间和细胞外基质中特别丰富[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba］.修饰蛋白质主干的多糖的多样性使agp在高等植物中成为一个庞大而复杂的家族。迄今为止，在拟南芥基因组和拟南芥基因组中分别鉴定了85和282个推测的agpGydF4y2Ba奥雅萨苜蓿GydF4y2Ba基因组分别[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba那GydF4y2Ba17GydF4y2Ba］.之前的研究表明，AGPS在不同条件下的不同植物生长和开发过程中，如性生殖（微孔发育，女性配子发生，胚胎发育，花粉 - 瘟疫相互作用，花粉萌发和花粉生长），营养生长（茎发育，血管组织功能和根部发育），细胞死亡，细胞分裂和扩张，对非生物胁迫的反应[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18GydF4y2Ba那GydF4y2Ba19GydF4y2Ba那GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba21GydF4y2Ba那GydF4y2Ba22GydF4y2Ba那GydF4y2Ba23GydF4y2Ba那GydF4y2Ba24GydF4y2Ba那GydF4y2Ba25GydF4y2Ba那GydF4y2Ba26GydF4y2Ba那GydF4y2Ba27GydF4y2Ba］.GydF4y2Ba

agp根据其核心蛋白骨干序列结构域成分的差异被分为7个亚家族:经典agp、富含赖氨酸的agp、AG多肽、束状蛋白样agp (FLAs)、结节蛋白样agp、木质素样agp和非经典agp [GydF4y2Ba13GydF4y2Ba那GydF4y2Ba22GydF4y2Ba那GydF4y2Ba28GydF4y2Ba］.FLAS与其他AGP亚壳不同，因为它们含有一个或两个筋膜结构域（Fas结构域），其可以在细胞通信和粘附（物理相互作用）中起作用[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba那GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba31GydF4y2Ba］.具体地，Fas结构域由110-150个氨基酸组成并且具有低序列相似性，它们含有保守的中央YH基序和两个高度保守的区域（H1和H2），并且每个区域包含10个氨基酸[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba32GydF4y2Ba那GydF4y2Ba33GydF4y2Ba］.在高等植物中已鉴定出许多不同的假定FLAs。例如，在拟南芥中鉴定出21个FLAs，在拟南芥中鉴定出27个FLAsGydF4y2Bao .漂白亚麻纤维卷GydF4y2Ba和34 inGydF4y2Ba普通小麦GydF4y2Ba[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba31GydF4y2Ba那GydF4y2Ba34GydF4y2Ba］.拟南芥FLA分为四组（A-D），基于FAS和AGP样结构域的数量和位置以及糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚肌的存在或不存在[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba］.然而，通过成员的冗余，FLA的功能调查受到挑战，导致许多人GydF4y2Ba弗拉GydF4y2Ba没有可辨别表型的突变体。目前，FLA的效果已与植物二级细胞壁和木材，芽和根部发育，细胞粘附以及对非生物应激的反应相关的影响[GydF4y2Ba32GydF4y2Ba］.此外，研究GydF4y2BaFLA3.GydF4y2Ba在拟南芥和GydF4y2BaMTR1GydF4y2Ba研究表明FLAs参与植物生殖发育，特别是花粉形成[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba那GydF4y2Ba36GydF4y2Ba］.然而，尽管弗拉斯的多样性，但是对弗拉斯的生物学功能和植物的分子机制的了解仍然难以捉摸。GydF4y2Ba

在这项研究中，一个花粉特异的FLA基因，GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba，被分离并进行了特征描述。的失去功能的突变体GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba在标准生长条件下显示出没有可辨别的表型，但在高湿度条件下，在花药内发生过早的异位花粉萌发，表明了重要作用GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba维持花粉萌发的适当时机。GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba- 发现转基因植物产生约39.2％的塌陷和缩小的花粉颗粒，其显示出降低的花粉萌发和花粉管生长。细胞学观察和电子显微镜显示，在无核阶段发生花粉流产，并且异常花粉晶粒失去了所有细胞质材料，核和内部内，具有通过Compofluor白色染色所看到的纤维素样多糖的异常分布，而外部的基本结构层和试鼠正常。这些结果强烈表明异位表达GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba可能影响小孢子的发育，特别是花粉内壁的形成。GydF4y2Ba

表征GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba

所有21条FLA蛋白序列均来自拟南芥信息资源(TAIR) [GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba］.使用对齐的全长FLA序列，构建显示其系统发育关系的无发电树发育树（附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：图。S1A）。基于系统发育分析和成对序列比较，GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba（AT3G12660），其在注释的拟南芥基因组中鉴定为FLA亚家族的组C组（附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：图S1a），这与先前的结果一致[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba］.根据拟南芥eFP Browser的基因表达数据和以往拟南芥雄性配子体和幼苗的转录组数据[GydF4y2Ba37GydF4y2Ba那GydF4y2Ba38GydF4y2Ba]，GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba是一个花粉特异基因，在未成熟的三细胞花粉中特别高表达(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：图。S1B-D）。它具有768-BP长的开放式读取框架（ORF），没有内含子，编码富含Pro（5.9％），ALA（9.0％），SER（14.5％）和THR的255-氨基酸蛋白（6.3％）（附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba：图。S2A）。FLA14仅包含一个Fas结构域（117个氨基酸长）作为关键区分特征，并且在域的任一端具有两个相对节省的区域（H1和H2）（10和11个氨基酸）（附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba：图S2）。此外，该蛋白质包括一个N端分泌信号肽，该肽在位置21（Ser）和22（Asn）处的氨基酸之间有一个裂解位点，由SignalP 4.0服务器、TMHMM服务器v预测。2.0和SMART，以及GPI-SOM和BIG-PI植物预测器预测的氨基酸位置225（Ser）处的潜在GPI修饰位点（附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba：图。S2B）。GydF4y2Ba

FLA14.GydF4y2Ba具体表现在花粉粒中GydF4y2Ba

遵循时间和空间表达GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba，实时荧光定量PCR首先在不同的组织中进行。结果表明GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba表达在花中特别丰富，但在成熟根，茎，叶或发芽体积中勉强可检测到（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Baa)拟南芥表达GydF4y2Ba格斯GydF4y2Ba报告基因和GydF4y2Ba表皮生长因子GydF4y2Ba基因驱动GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba启动子(GydF4y2BaproFLA14:：eGFP-GUSGydF4y2Ba)的构造和分析。根据Smyth等人描述的阶段定义[GydF4y2Ba39GydF4y2Ba]首先在花阶段11的花盆中检测到GUS信号，在花卉级12的完整花药组织中快速达到高水平（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Bab）。花粉囊和其他花器官中的扩展蓝色信号可能是从花粉晶体扩散的GUS酶活性的反应产物的结果，因为花药中的EGFP荧光信号仅限于花粉颗粒，因为在单独染色时花瓣无色（无花果。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba在花期12和开花期，GUS信号不仅在花粉粒中可见，在柱头和传输道中也有明显的表达(图2)。GydF4y2Ba1GydF4y2Bab-d）。在任何其他非生产性组织中均未检测到GUS活性（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Bae、 与实时定量PCR结果一致GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba在花粉粒中，强烈提示其可能参与花粉发育和功能。GydF4y2Ba

FLA14沿着等离子体膜和Hechti股线本地化GydF4y2Ba

目的研究fl14的亚细胞定位GydF4y2Ba表皮生长因子GydF4y2Ba基因融合到GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba形成一个GydF4y2BaeGFP-FLA14GydF4y2Ba在组成型CaMV 35S启动子控制下构建。为了避免FLA14主干信号肽的潜在干扰，eGFP被插入FLA14的21（Ser）和22（Asn）位氨基酸之间的信号肽裂解位点我们的结果显示，FLA14与eGFP融合后的荧光信号呈斑点状细胞质模式，并沿细胞边界广泛分布，可见于质膜、细胞间隙和合胞丝中（植物中从原生质体延伸到细胞壁的拉伸质膜）质膜分离细胞（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba而在对照细胞中，荧光信号被限制在细胞膜内GydF4y2BapFGC-eGFPGydF4y2Ba空向量(无花果。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba广告）。这些结果表明FLA14是血浆膜结合蛋白。GydF4y2Ba

一代的GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba功能丧失突变体和过度表达转基因植物GydF4y2Ba

研究生物学功能GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba2个T-DNA插入突变体(CS1014037和SALK_123695)，其中1个位于编码区GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba起始密码子(ATG)下游699 bp，另一个位于ATG上游945 bpGydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba确定了mRNA起始位点（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba一种）。此外，我们生成了GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba过表达（OE）转基因植物（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bab） .纯合子CS1014037突变体GydF4y2Bafla14-1GydF4y2Ba，纯合Salk_123695突变体GydF4y2Bafla14-2GydF4y2Ba14个oe阳性转化子通过基因组DNA PCR进行验证(附加文件)GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba：图。S3）。在定量实时PCR结果，弱或几乎没有GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba可以在整个花序中检测mRNAGydF4y2Bafla14-1GydF4y2Ba和GydF4y2Bafla14-2GydF4y2Ba（无花果。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bac） ，带有三对特定引物（附加文件GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba：表S1和图3。GydF4y2Ba3.GydF4y2BaA)，表明转录的GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba基因被T-DNA插入强烈抑制，并且，与野生型（WT）花序相比，显著增强GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba确认了来自13个OE线的花序中的转录水平（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bad） 。GydF4y2Ba

突变GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba导致花粉在高水分条件下在花药内萌发GydF4y2Ba

失去功能的突变体GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba那GydF4y2Bafla14-1GydF4y2Ba和GydF4y2Bafla14-2GydF4y2Ba显示一致的植物生长和生殖发育表型。此外，我们观察到在标准生长条件下，之间没有明显的形态学差异GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba（无花果。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bab)和WT植物(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba一种）。开口小花GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba具有正常的外观，黄色和丰满的阴茎（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bae, h)，类似于WT小花(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2BaD，G）和成熟的单片机显示长度或种子组的减少（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bak，n）。在花草中观察到具有精确定位的生发孔的正常出现的花粉颗粒GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba（无花果。GydF4y2Ba5.GydF4y2Baf，g）与wt花粉晶体相似（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Baa，b）。细胞学观察显示GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba花粉颗粒显示正常的花粉活力，核分布和纤维素样多糖的沉积（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba在体内的自我和相互交叉GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba和WT植物进一步证实，既不是男性也不是雌性的杂种GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba受损(附加文件GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba：图。S4）。GydF4y2Ba

然而，值得注意的是，确定花粉萌发和伸长率被改变GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba被转移到相对空气湿度为85%的高湿度条件下GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba，在85%的湿度下，花药内一致观察到相当数量的高度伸长的花粉管(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba相反，在两种对照（50%）下，野生型植物的花药中从未观察到花粉管的早熟萌发（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Baf-h)或高(85%)(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2BaA-D）相对湿度条件。GydF4y2Ba

FLA14.GydF4y2Ba转基因植株中的过表达导致单核期小孢子败育GydF4y2Ba

没有任何明显营养缺陷的OE植物与WT植物相比显示出严重的无菌（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Baj，l，m，o）。我们随机选择了三个OE线（5,9和11），明显增强GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba转录水平进一步分析。OE植物的成熟单位（8.66±1.26mm）明显短于WT植物（15.11±0.92mm）（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bap)，产生的种子(23.9±13.5个/角果)远少于野生型(60.9±4.4个/角果)(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Baq）。OE植物展示了一种部分雄性无菌表型，具有约39.2％的扭曲的花粉晶粒（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bak, l, v)，而WT植株花粉败育率仅为5.5%(图2)。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba细胞学观察表明，这些来自开放花朵的塌陷花粉粒是不能活的，缺乏细胞含量和细胞核，钙荧光白染色显示纤维素样多糖的沉积似乎是异常的(图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bam-o，t，u）。GydF4y2Ba

用苯胺蓝追踪胼胝质，进一步分析自交和互交的花粉管行为。当WT花粉作为雄性供体时，OE的比较(图。GydF4y2Ba7.GydF4y2BaM-O，S-U）和WT（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2BaA-c, g-i)雌蕊未能揭示花粉管行为的差异。然而，当以野牡丹花粉为供体时，野牡丹花粉管的数量(图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Bap-r, v-x)和WT(图。GydF4y2Ba7.GydF4y2BaD-F，J-L）雌蕊明显低于两个OE中的WT花粉管（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2BaM-O，S-U）和WT（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2BaA-C，G-I）雌蕊，但OE和WT雌蕊中的花粉管行为相似。因此，苯胺蓝染色分析证明了OE植物的雄性配子体被损害。GydF4y2Ba

调查精确阶段，在这种情况下，花粉崩溃因增强而开始GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba转录水平，将OE植物的花芽固定、嵌入和切片以分析花药发育。OE花药的孢子体绒毡层正常，在四分体阶段完全发育，并在小孢子发育过程的后期逐渐退化（图。GydF4y2Ba8.GydF4y2BaF-J），与WT花药的脚趾纹相比没有明显的区别（图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Baa-e）。然而，从单核期开始，OE花粉粒在花药开裂之前的成熟过程就有所不同（图。GydF4y2Ba8.GydF4y2BaH）。总共27.6-61.9％的OE植物梭菌伴有所有细胞质内容物的广泛变性（图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Bai)，并在开裂阶段形成残余(图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Baj） 因此，半薄切片分析表明，OE植株中只有小孢子发育过程受损，绒毡层的形成和降解没有缺陷。GydF4y2Ba

透射电镜进一步证实了OE小孢子及其在花粉发育过程中逐渐形成的花粉壁结构的异常。OE植物中大多数异常的花粉粒呈现塌陷的外观（图。GydF4y2Ba9.GydF4y2Baq)，而WT植株的花粉粒大致呈圆形(图。GydF4y2Ba9.GydF4y2Bag).从小孢子母细胞阶段到四分体阶段，OE花药室中所有发育的细胞(图4)。GydF4y2Ba9.GydF4y2Bai, j)表现出与WT植物相同的形态和花粉壁图案(图。GydF4y2Ba9.GydF4y2Baa、 在四分体阶段，被胼胝质壁包围的小孢子开始外壁形成。然而，在单核阶段，细胞质明显降解（图。GydF4y2Ba9.GydF4y2Bak），与单独的单倍体WT微微孢子的观察不同（图。GydF4y2Ba9.GydF4y2Bac).此时OE小孢子的内层无法形成(图2)。GydF4y2Ba9.GydF4y2Bal）与几乎完全的基本内有线和WT幼儿中的外部结构的存在相比（图。GydF4y2Ba9.GydF4y2Bad).随后，胞质含量的下降和内部形成的失败导致核的消退和双细胞小孢子的坍塌(图2)。GydF4y2Ba9.GydF4y2Bam）。通过改性阶段，OE阴道释放出空洞和缩小的花粉颗粒，其完全没有细胞内容物和内部层，但具有完整的外出层和发育良好的试酮（图。GydF4y2Ba9.GydF4y2Baq、 r）。此外，在OE花粉囊内观察到一些散发的异常花粉粒，其外观正常，但内层显著增厚（图。GydF4y2Ba9.GydF4y2Bao, s)。在单核期之前，这类花粉粒的发育过程与WT花粉相似。然而，从双细胞期开始，内层明显过度沉积(图。GydF4y2Ba9.GydF4y2Bap、 所有这些结果表明，OE植株的小孢子败育发生在单核期，并提示了小孢子败育的作用GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba在拟南芥小孢子发育和花粉壁模式，特别是在内部形成。GydF4y2Ba

在花粉壁形成过程中纤维素样多糖的沉积在细胞内受到损害GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba-过表达转基因植物GydF4y2Ba

来确定GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba影响内部形成，我们使用Coprofluor白色染色来追踪在OE植物中的花粉壁的形成期间纤维素样多糖的沉积。在OE中首先首先检测到非常微弱的钙荧光白色荧光（图。GydF4y2Ba10GydF4y2Baj，o）和wt microcowes（图。GydF4y2Ba10GydF4y2Baa, f)，在单核早期迅速形成明显的荧光斑，在单核晚期迅速形成明显的荧光斑(图。GydF4y2Ba10GydF4y2Bab, g, k, p)。在WT小孢子中，在双细胞和三细胞时期，细胞质外的内壁显示出一个明显的荧光环(图2)。GydF4y2Ba10GydF4y2Bac、 d，h，i）。然而，在OE植物的双细胞和三细胞阶段发现了一些没有检测到钙氟白色荧光信号的小而败育的花粉粒（图。GydF4y2Ba10GydF4y2Bal，m，q，r）。另外，在OE植物中的非常低的比例下也观察到正常但具有增强的钙荧光白色荧光信号的花粉颗粒（图。GydF4y2Ba10GydF4y2Bae、 这种荧光信号异常增强的现象在野生型花粉粒中从未被观察到。钙氟白色荧光的异常分布（无荧光或荧光信号显著增强）与异常的内质图案（未能形成或明显增厚）之间的相关性透射电镜（图。GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba）表明异位表达GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba可能通过扰乱纤维素样多糖的沉积，影响拟南芥花粉中形成。GydF4y2Ba

异位表达GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba导致小孢子受损，花粉内质形成缺陷GydF4y2Ba

近年来，一套调查已经确定了一批具有特异性表达和在雄性生殖组织中的特异性和功能的AGP，证明了AGP在花粉中的无疑重要作用[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba34GydF4y2Ba那GydF4y2Ba35GydF4y2Ba那GydF4y2Ba40GydF4y2Ba那GydF4y2Ba41GydF4y2Ba那GydF4y2Ba42GydF4y2Ba］.但是，对于我们的知识，目前只有两个弗拉斯，拟南芥GydF4y2BaFLA3.GydF4y2Ba和大米GydF4y2BaMTR1GydF4y2Ba据报道，据报道，在微孔发育中具有特定作用[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba那GydF4y2Ba36GydF4y2Ba］.在这项研究中，我们鉴定了一个fla编码基因，GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba显示了严格的花粉特异性表达模式（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba).研究GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba，含有T-DNA插入和CaMV 35S启动子驱动的突变体GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba-OE转基因拟南芥植株。CaMV 35S启动子在拟南芥花粉中的活性一直存在争议。然而，CaMV 35S启动子仍被广泛应用于花粉表达基因的功能分析。以AGP家族成员为例，在拟南芥中生成CaMV 35S启动子驱动的RNAi植株，研究其功能GydF4y2BaAGP6.GydF4y2Ba和GydF4y2BaAGP11GydF4y2Ba，两者都被发现在雄蕊，花粉颗粒和花粉管中具体表达[GydF4y2Ba41GydF4y2Ba那GydF4y2Ba43GydF4y2Ba］.Downregulation的GydF4y2BaFLA3.GydF4y2Ba，在花粉粒和花粉管中特异表达，在CaMV 35S启动子驱动的RNAi植物中引起花粉异常[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba］.过度的GydF4y2BaFLA3.GydF4y2Ba在CAMV 35S启动子下也导致明确的无菌[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba].此外，转基因植物GydF4y2Ba芸苔CameStris.GydF4y2Ba表达反义GydF4y2BaBCMF8.GydF4y2Ba和/或GydF4y2BaBcMF18GydF4y2Ba在CaMV 35S启动子控制下，在花粉粒和/或花粉管中特异表达的，表现出部分雄性不育和结实率下降[GydF4y2Ba42GydF4y2Ba那GydF4y2Ba44GydF4y2Ba].在我们的研究中GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba突变体,GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba利用CaMV 35S启动子过表达转基因拟南芥植株。GydF4y2Ba

这里呈现的数据表明膜结合的FLA14与花粉发育的适当进展相关（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）.虽然早期结果GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba零突变体特征显示，在标准生长条件下，植株表型没有变化(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba），效果GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba早表达早在微孔发育过程中早期就明显成为无核阶段（图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba）.值得注意的是，OE植物中外进入的开始和定时正常并且与WT植物中的相似（图。GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba）.然而，与WT植物不同，OE植物中的内部没有正常形成，然后是微孔细胞质的退化。此外，根据内部缺陷，我们的钙荧光白色染色结果显示OE植物中产阶级花粉颗粒中的荧光信号的不存在或过量，这表明了花粉晶粒中的纤维素样多糖的异常分布（图。GydF4y2Ba10GydF4y2Ba).所有这些结果表明GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba可能会干扰发育中花粉细胞中纤维素样多糖的分布。GydF4y2Ba

因此，问题就产生了，如何异位表达GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba影响植物花粉中纤维素样多糖的分布。作为包围小孢子的最内层，内层由多种成分(纤维素、半纤维素、果胶、水解酶和结构蛋白)组成，它们以共价键和非共价键连接[GydF4y2Ba45GydF4y2Ba］.蛋白质糖基化是碳水化合物链向多肽骨架的分类或后翻译的共价附着，这是适当蛋白质结构和雄性配子体中的功能的基本修饰[GydF4y2Ba46GydF4y2Ba］.蛋白多糖是花粉壁的重要组成部分，其中agp是高度糖基化糖蛋白的一个重要家族[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba]然而，AGPs在花粉壁系统内的组装以及与其他细胞外基质成分的联系尚不清楚。先前的研究表明，AGPs可作为细胞壁的共价交联剂和增塑剂，并与细胞壁的其他成分（主要是果胶和阿拉伯木聚糖）形成连接[GydF4y2Ba47GydF4y2Ba那GydF4y2Ba48GydF4y2Ba]这种连续的蛋白多糖结构网络因此影响细胞外基质的完整性，并有助于维持细胞扩张[GydF4y2Ba48GydF4y2Ba那GydF4y2Ba49GydF4y2Ba］.例如，提出了一种拟南芥AGP（AGP57C）与果胶和半纤维素共价相互作用。此外，GydF4y2BaBcMF18GydF4y2Ba在里面GydF4y2BaB. Campestris.GydF4y2Ba被认为是花粉内壁形成的组成部分，可能是蛋白多糖结构形成的交联剂[GydF4y2Ba50GydF4y2Ba］.因此，我们假设Periplasm-AGPS是花粉信息中的蛋白内酯结构的良好候选者，并且可能有助于维持内部完整性，为微孔发育提供安全的室内环境。因此，过度表达GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba在小孢子扩张过程中，蛋白多糖的稳态水平被打乱，导致结构成分的改变和内部结构的异常(图。GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba）.随后，花粉内部结构的异常进一步影响花粉内部环境，导致OE花粉粒中细胞质含量的降解(图2)。GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba)，因为内层被认为对花粉的稳定性和完整性起着重要作用[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba那GydF4y2Ba50GydF4y2Ba那GydF4y2Ba51GydF4y2Ba］.GydF4y2Ba

FLA14.GydF4y2Ba对于在拟南芥中的高相对湿度下预防过早的花粉萌发是必不可少的GydF4y2Ba

花粉管内的AGPS在不同的植物物种中记载了AGPS，主要是在他们的尖端中[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba那GydF4y2Ba52GydF4y2Ba那GydF4y2Ba53GydF4y2Ba］.表明特定AGP的子集不仅对花粉发育很重要，而且是调解花粉管生长的好候选者。此外，据报道，一些特定的AGP成员对于预防过早的花粉晶萌发至关重要。AGP6和AGP11是拟南芥花粉发育中涉及的一对冗余AGP，并且是适当的花粉管生长所必需的，以及在高相对湿度下预防花粉内花粉颗粒的过早萌发[GydF4y2Ba54GydF4y2Ba］.AGP40是AG多肽，在花粉粒和花粉管中表达量较高。虽然AG多肽是非常不同的分子，通常由少于30个氨基酸残基组成，但AGP40与AGP6和AGP11具有高度的相似性，并与AGP6和AGP11密切相关。的单一零突变体GydF4y2BaAGP40GydF4y2Ba与野生型植株相比，缺乏明显的表型差异。然而，在野生型植株中观察到花药内的早期萌发花粉管数量显著增加GydF4y2Baagp6 agp11 agp40GydF4y2Ba三突变体(GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba].在我们的研究中，敲除突变体的初步鉴定结果GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba湿度对小孢子发育没有影响，而湿度对小孢子发育没有影响GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba表型，导致具有相当多的预热花粉颗粒，在成熟的花药内具有细长的花粉管（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba）.野生型植株即使在较高的相对湿度条件下也未观察到花粉早熟萌发。有人建议GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba负责预防花药内的过早花粉萌发。GydF4y2Ba

在以往的研究中，已经报道了一些在拟南芥花药中具有花粉早发的突变体和过表达转基因植株。已知的第一个有这种新缺陷的突变体，GydF4y2BarGydF4y2Ba，以湿度依赖的方式在花药内展示前萌发的花粉;不幸的是，尚未确定含有这种突变的基因迄今尚未确定[GydF4y2Ba55GydF4y2Ba］.拟南芥GydF4y2BaplantacyaninGydF4y2Ba过度表达导致花药裂开的缺陷，导致封闭的花药内的较低水平的预先发芽的花粉粒。提出了一种假设，花粉可以将蘑菇素的存在解释为成熟的花药作为耻骨信号，因此通过发芽来响应[GydF4y2Ba56GydF4y2Ba］.另外，是一个丧失功能的突变体GydF4y2Ba调用合成酶9.GydF4y2Ba和转基因植物过表达GydF4y2Ba调用合成酶5.GydF4y2Ba两者含有微生物发生过程中的胼舌沉积，并显示出早熟花粉萌发[GydF4y2Ba57GydF4y2Ba］.在拟南芥中对这些特征明显的突变体或过表达植物的研究表明，花粉的早熟可能是由遗传改变引起的。然而，不同于这些突变体或过表达系的花粉在正常培养条件下能萌发，花药中的花粉提前萌发GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba和GydF4y2Baagp6 agp11GydF4y2Ba这取决于高湿度。GydF4y2Ba

通常，花粉管萌发和定向生长发生在开花后发生，并且没有发生过早萌发[GydF4y2Ba54GydF4y2Ba］.迄今为止，脱水被认为是维持花粉休眠和预防预吞并萌发的主要因素[GydF4y2Ba58.GydF4y2Ba］.花粉粘附和复水合作用打破休眠，被认为是触发花粉萌发的初始步骤[GydF4y2Ba59.GydF4y2Ba］.然而，对这些事件的潜在机制仍然知之甚少。据报道，在GydF4y2BaOsOSC12GydF4y2Ba/GydF4y2BaOsPTS1GydF4y2Ba，编码双环三萜合酶，导致水稻在低湿度条件下有缺陷的花粉粘附和水化[GydF4y2Ba60.GydF4y2Ba］.高湿度可以拯救由函数突变体造成的缺陷的花粉水合GydF4y2BaOSGL1-4GydF4y2Ba，稻谷家族的一员[GydF4y2Ba61.GydF4y2Ba］.改变的环境湿度导致预焦花粉萌发GydF4y2Ba肌醇多磷酸5-磷酸酶12GydF4y2Ba突变体[GydF4y2Ba58.GydF4y2Ba］.花粉缺乏GydF4y2Banmnat.GydF4y2Ba基因，编码NAD生物合成中的关键酶，通常在高湿度条件下在当局中引发术语[GydF4y2Ba62.GydF4y2Ba］.这些结果表明，水合/湿度对花粉萌发至关重要，影响花粉黏附和水合的各种成分对环境湿度的响应也是必要的。一种有趣的表型，花粉在里面萌发GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba（无花果。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba),GydF4y2Baagp6 agp11GydF4y2Ba花药[GydF4y2Ba54GydF4y2Ba]表明在高湿度条件下，花粉成熟过程中AGPs的积累对抑制花粉管萌发具有重要意义。GydF4y2Ba

在花粉萌发过程中，花粉粒需要水分，柱头作为水分和其他因素的来源。同时，花粉被膜必须提供这一关键水合作用步骤所需的脂质和蛋白质[GydF4y2Ba54GydF4y2Ba］.显微镜观察GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba未见女性器官功能缺损(图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba）.而且，突变GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba似乎没有根据突变花粉颗粒的TEM观察结果对花粉涂层沉积的任何显眼效果（图。GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba）.所有这些结果表明，与耻辱的花粉接触可能不会在突变植物中损害。有人提出，AGPS涉及对花粉萌发的控制，可能是通过对水合的进入或干扰某种信号通路来调制水合的进程来控制花粉萌发。GydF4y2Ba23GydF4y2Ba]因此，早期萌发的花粉管在GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba花药的形成可能与水分的早期吸收或其他因素有关。GydF4y2Ba

据报道，在花粉萌发过程中，花粉首先被水和钙离子（CaGydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}）进入花粉晶粒，然后是Ca的细胞质梯度GydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}种子萌发部位下方的形态[GydF4y2Ba63.GydF4y2Ba］.与此相一致的是，双缺失突变体中钙和信号转导相关基因的表达水平发生了改变GydF4y2Baagp6 agp11GydF4y2Ba花粉管，表明AGPs通过钙调素参与信号级联[GydF4y2Ba64.GydF4y2Ba］.进一步调查证实，AGPS可以染色CAGydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}，其在花粉萌发和管伸长的特定阶段释放，形成AGP-CA.GydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}振荡器[GydF4y2Ba65.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba66.GydF4y2Ba］.此外，AGPS与Hechtian Stranc介导的粘合性结合的性质提供了基于Hechtian振荡器的溶液，该溶解器解离周质AGP-CAGydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}，产生CaGydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}涌入[GydF4y2Ba67.GydF4y2Ba］.Hechtian假说提出AGP的功能是CaGydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}调节花粉尖端的电容器和花粉管指南[GydF4y2Ba67.GydF4y2Ba］.FLA14的亚细胞定位显示FLA14分布于质膜和Hechtian链中(图2)。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.该结果与来自基因预测的推定的GPI锚信号序列一致（附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba：图。S2）。粘附区域中的Hechtian股线将电池壁连接到质膜，机械地转换细胞壁应力信号与位于质膜中的受体，并建议涉及信号转导，细胞 - 细胞通信事件和感测细胞壁完整性[GydF4y2Ba68.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba69.GydF4y2Ba］.一些AGP家族成员，如番茄中的LeAGP1和拟南芥中的FLA4, AtAGP17和AtAGP18，已经被发现分布在质膜和Hechtian链上，并被认为是一种连接质膜和细胞壁的培养基[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba那GydF4y2Ba68.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba70GydF4y2Ba那GydF4y2Ba71.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba72.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba73.GydF4y2Ba］.fl14的质膜和Hechtian链定位可能介导花粉萌发过程中细胞粘附和信号转导的功能[GydF4y2Ba36GydF4y2Ba］.已经假设了周质AGP通量电容器的外部动态存储可以与细胞改变到改变条件的适应性及其对应力因子的响应相关联[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba那GydF4y2Ba66.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba67.GydF4y2Ba］.基于这一假设，我们推测了质膜和Hechtian Stranc局部化FLA14的干扰可能会使外部信号的感测和破坏周质AGP-CAGydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}解离，以及在花粉颗粒和花粉管中稳定网络，导致花粉管的衰竭对花药内的高湿度和预防过早的花粉萌发。调查是否是有趣的GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba突变体可能在表达钙和信号相关基因中具有任何缺陷，这对花粉萌发和管生长至关重要。GydF4y2Ba

在这项研究中，我们对拟南芥FLA成员fl14进行了表征，fl14是一个花粉特异蛋白，定位于质膜和Hechtian链。此外，我们演示了一个角色GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba在高相对湿度下的雄性配子体发育和花粉萌发中。这些调查结果为AGPS在植物生殖发展中的影响提供了新的见解。GydF4y2Ba

植物材料和生长条件GydF4y2Ba

一个生态型的拟南芥与哥伦比亚-0背景，以及T-DNA突变体和转基因植物，是在盆栽混合培养在一个22 ± 2°C生长柜，相对湿度50%，光照16小时，暗循环8小时。GydF4y2Ba

拟南芥FLA基因的系统发育分析及表达分析GydF4y2Ba

21条FLA蛋白序列从TAIR (GydF4y2Bahttps://www.arabidopsis.org/GydF4y2Ba）数据库。使用Clustal X（1.83）程序进行氨基酸序列的多次对准。具有邻近邻接算法方法的Mega X软件中构建了系统发育树。Bootstrap值为1000.然后将生成的.NWK文件用作输入以使用OmicStudio工具构建最终的系统发育树GydF4y2Bahttps://www.omicstudio.cn/tool/GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

所有21个FLA的基因表达数据是从ATGENEXPRESS联盟（拟南芥EFP浏览器）获得的GydF4y2Bahttp://www.bar.utoronto.ca/GydF4y2Ba)的ATH1和Klepikova数据来源和以前发表的文章[GydF4y2Ba37GydF4y2Ba那GydF4y2Ba38GydF4y2Ba那GydF4y2Ba74.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba75.GydF4y2Ba］.制备分层聚类热线图以使用OMICStudio工具可视化基因表达水平GydF4y2Bahttps://www.omicstudio.cn/tool/GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

生物信息分析GydF4y2Ba

使用ProtParam工具计算FLA14的氨基酸组成（GydF4y2Bahttp://web.expasy.org/protparam/GydF4y2Ba）.使用Align工具(GydF4y2Bahttp://www.ebi.ac.uk/GydF4y2Ba）.signalp4.0服务器(GydF4y2Bahttp://www.cbs.dtu.dk/services/signalp-4.0/GydF4y2Ba)，TMHMM服务器版本2.0(GydF4y2Bahttp://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/GydF4y2Ba）和智能（GydF4y2Bahttp://smart.embl-heidelberg.deGydF4y2Ba)用于确定FLA14 N端信号序列的预测长度。GPI修饰位点的原始预测使用GPI-SOM进行(GydF4y2Bahttp://gpi.unibe.ch.GydF4y2Ba)和BIG-PI植物预测器(GydF4y2Bahttp://mendel.imp.ac.at/gpi/plant_server.htmlGydF4y2Ba）.的GydF4y2BaCIS.GydF4y2Ba-在GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba使用PlantCare鉴定启动子序列（GydF4y2Bahttp://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html.GydF4y2Ba）.狼Psort（GydF4y2Bahttp://wolfpsort.org/GydF4y2Ba）用于确定蛋白质亚细胞定位。其他信息GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba从NCBI获得(GydF4y2Bahttp://www.ncbi.nlm.nih.govGydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

RNA提取，cDNA合成，实时荧光定量PCRGydF4y2Ba

总RNA提取采用Trizol®试剂(Invitrogen，GydF4y2Bahttp://www.lifetechnologies.comGydF4y2Ba）用含有GDNA橡皮擦的Primescript®RT试剂盒转录到cDNA中（Takara，GydF4y2Bahttp://www.takarabiomed.com.cnGydF4y2Ba）.然后，使用CDNA作为具有特定引物的PCR分析模板（附加文件GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba：表S1）。GydF4y2Ba微管蛋白β4GydF4y2Ba（GydF4y2BaTUB4.GydF4y2Ba)作为正常化对照[GydF4y2Ba52GydF4y2Ba］.实时荧光定量PCR检测SYBR®Premix Ex TaqTM (TliRNaseH Plus) (TaKaRa，GydF4y2Bahttp://www.takarabiomed.com.cnGydF4y2Ba）在Biorad CFX96实时RT-PCR检测系统（BIO-RAD，GydF4y2Bahttp://www.bio-rad.comGydF4y2Ba）.进行了三种技术重复和三种生物重复。该值表示三个生物重复的平均值±SD（标准偏差）。相对表达水平由2计算GydF4y2Ba^{-GydF4y2Ba△GydF4y2Ba△GydF4y2BaCT.GydF4y2Ba}方法[GydF4y2Ba76.GydF4y2Ba］.GydF4y2Ba

GUS染色分析和GFP荧光显微镜GydF4y2Ba

进行分析的GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba启动子活性，我们首先构建了GydF4y2BaPBI101-EGFP-GUSGydF4y2Ba空向量如下GydF4y2Ba增强的绿色荧光蛋白GydF4y2Ba（GydF4y2Ba表皮生长因子GydF4y2Ba)利用特异性引物PCR扩增出含有修饰终止密码子的ORF基因片段，并将其克隆到质粒pBI101中GydF4y2BaSmaGydF4y2Ba我承认该网站的上游GydF4y2Baβ-葡萄糖醛酸酶GydF4y2Ba（GydF4y2Ba格斯GydF4y2Ba)基因。的GydF4y2BaproFLA14:：eGFP-GUSGydF4y2Ba结构是通过放大GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba启动子序列2074 BP从第一ATG的上游GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba使用基因特异性引物编码ORF片段。片段插入上游GydF4y2Ba表皮生长因子GydF4y2Ba基因在GydF4y2BaBamh.GydF4y2Ba我在pBI101质粒中发现了一个识别位点，其中包含GydF4y2BaNPTII.GydF4y2Ba卡那霉素抗性基因。所有引物在附加文件中列出GydF4y2Ba4.GydF4y2BaS1:表。转基因纯合植株用5-溴-4-氯-3-吲哚基-进行GUS染色GydF4y2BaβGydF4y2Ba- 葡萄糖酸和GFP观察。使用荧光显微镜（Eclipse 90i;尼康）收集GUS染色和表达GFP表达组织的图像。GydF4y2Ba

亚细胞本地化GydF4y2Ba

为了观察fl14亚细胞分布，我们扩增fl14亚细胞GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba信号肽序列和其余的GydF4y2BaFLA14.GydF4y2BaORF片段。然后，将这两个序列亚克隆到3'-和5'-termini中GydF4y2Ba绿色荧光蛋白GydF4y2Ba在GydF4y2BapFGC-eGFPGydF4y2Ba矢量在组成型Camv 35s启动子的控制下，以避免扰乱信号肽的潜在功能，导致修饰的载体GydF4y2BapFGC-NSGydF4y2Ba^{FLA14.GydF4y2Ba}-eGFP-FLA14GydF4y2Ba．所有引物都列在附加文件中GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba：表S1。然后通过粒子轰击将修饰的载体瞬时转化为洋葱表皮细胞[GydF4y2Ba77.GydF4y2Ba]洋葱表皮层在导入24小时后剥皮，并在0.3 g·mL中进行等离子体分离GydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba荧光显微镜分析egfp融合蛋白的表达(ECLIPSE 90i;尼康)和LSM780共聚焦显微镜(德国蔡司)。GydF4y2Ba

突变验证GydF4y2Ba

两条线，CS1014037和Salk_123695的突变种子是从拟南芥生物资源中心获得的（GydF4y2Bahttp://www.biosci.ohio-state.edu/pcmb/facities/abrc/abrchome.htm.GydF4y2Ba).使用十六烷基三甲基溴化铵提取法从新鲜幼叶中分离基因组DNA[GydF4y2Ba78.GydF4y2Ba].用PCR方法筛选纯合子系GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba- 特异性底漆（附加文件GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba:表S1)和T-DNA引物(5 ' -TTCTCATCTAAGCCCCCATTTGG-3 ')。PCR产物经测序确认。从纯合突变体中提取总RNA，采用实时荧光定量PCR分析表达GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba根据上面描述的方法，具有三个特定的引物对（附加文件GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba：表S1）。GydF4y2Ba

建设GydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba-过表达重组质粒与植物转化GydF4y2Ba

对于过度表达构建体，ORFGydF4y2BaFLA14.GydF4y2Ba在组成型CAMV 35S启动子的控制下被扩增并亚克隆到PBI121载体中GydF4y2BaXbaGydF4y2Ba我和GydF4y2BaSmaGydF4y2Ba我识别网站，侧翼了GydF4y2BaNPTII.GydF4y2Ba卡那霉素抵抗基因。测序后，使用花卉DIP方法将重组构建体转化为拟南芥[GydF4y2Ba79.GydF4y2Ba］.T.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba验证后，利用发电装置进行进一步实验。所有使用的引物在附加文件4:表S1中列出。GydF4y2Ba

光学显微镜GydF4y2Ba

在第一个开花前一周后，用Leica Mz16FA立体显微镜收集并观察到小花（GydF4y2Bahttp://www.leica.com/GydF4y2Ba）.用1:9乙酸/乙醇固定硅片，4℃过夜，室温下转入90%乙醇1小时，70%乙醇4℃过夜[GydF4y2Ba80GydF4y2Ba]在徕卡MZ16FA立体显微镜下观察乙醇固定的西力克(GydF4y2Bahttp://www.leica.com/GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

细胞学分析采用4'，6-二氨基-1-苯基吲哚（DAPI）溶液检测花粉粒的细胞核[GydF4y2Ba81.GydF4y2Ba］.通过用亚历山大污染染色来观察花粉活力[GydF4y2Ba82.GydF4y2Ba]为了观察胼胝质壁，花粉粒在0.1MK下用0.1%（w/v）苯胺蓝标记GydF4y2Ba_2GydF4y2BaHPO.GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba-KOH缓冲液（pH 11）根据制造商的说明（德国Roche）。为了追踪花粉壁的纤维素样多糖的沉积，在乙醇中以5％（v / v）福尔马林和5％（v / v）冰醋酸固定在乙醇中过夜，然后在Calcofluor白色染色5分钟 [GydF4y2Ba83.GydF4y2Ba］.用Leica DMLB荧光显微镜观察染色的标本（GydF4y2Bahttp://www.leica.com/GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

对于半薄切片分析，按照Lin等人的描述固定和制备花蕾[GydF4y2Ba50GydF4y2Ba]。将其包埋在spurr树脂中后，在LKB 11800吡咯烷酮超显微切片机（瑞典斯德哥尔摩）下获得半薄切片（1μm），置于玻片上，用0.5%甲苯胺蓝染色，并用徕卡DMLB荧光显微镜拍照(GydF4y2Bahttp://www.leica.com/GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

电子显微镜GydF4y2Ba

对于扫描电子显微镜（SEM），在开花阶段和成熟花粉晶粒中的花药涂布，在Eiko模型离子涂布机（Ibaraki，Japan）中涂有金钯5分钟，然后在日立模型TM-1000中观察到SEM（东京，日本）。对于透射电子显微镜（TEM），如上所述固定并嵌入花药。使用超微网（Reichert-Jung Ultracut E，Vienna，奥地利）获得超薄部分（70nm），并用乙酸铀和碱性柠檬酸盐染色15分钟。用日立模型H-7650 TEM（日本东京）记录图像。GydF4y2Ba

花粉萌发测定GydF4y2Ba

对于花粉萌发试验，三周龄的拟南芥植株在50%相对湿度的受控条件下生长，而另一部分植株转移到85%相对湿度的生长柜中。在高湿度处理3天后收集花药，并进行如上所述的显微镜观察。GydF4y2Ba

自我和互惠的十字架GydF4y2Ba

对于自交和互交，小花在开花前2天被阉割和授粉。雌蕊切除4、12和24小时授粉后,固定在Carnoy的解决方案(乙醇:酒精乙酸= 3:1)2 h,用水洗了三次,软化与8 M氢氧化钠一夜之间,用水洗了三次,孵化3 h在0.1% (w / v)苯胺蓝在0.1 KGydF4y2Ba_2GydF4y2BaHPO.GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba-KOH缓冲液(pH 11)。每个杂交进行3个重复。采用Leica MZ16FA立体显微镜(GydF4y2Bahttp://www.leica.com/GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

在当前研究期间使用和/或分析的数据集可从相应的作者获得合理的请求。GydF4y2Ba

AGP：GydF4y2Ba

阿拉伯半乳聚糖蛋白GydF4y2Ba

加利福尼亚州GydF4y2Ba^{2GydF4y2Ba+GydF4y2Ba}：GydF4y2Ba

钙离子GydF4y2Ba

DAPI：GydF4y2Ba

4'，6-二氨基-1-苯基吲哚GydF4y2Ba

eGFP:GydF4y2Ba

增强的绿色荧光蛋白GydF4y2Ba

FAS：GydF4y2Ba

筋膜层GydF4y2Ba

FLA：GydF4y2Ba

筋膜样AGPGydF4y2Ba

谷歌价格指数:GydF4y2Ba

糖基磷脂酰肌醇GydF4y2Ba

格斯：GydF4y2Ba

β-葡糖突酶GydF4y2Ba

OE:GydF4y2Ba

过度表达GydF4y2Ba

ORF：GydF4y2Ba

开放阅读框架GydF4y2Ba

SEM：GydF4y2Ba

扫描电子显微镜GydF4y2Ba

SD：GydF4y2Ba

标准偏差GydF4y2Ba

透射电镜:GydF4y2Ba

透射电子显微镜GydF4y2Ba

TUB4.GydF4y2Ba：GydF4y2Ba

微管蛋白β4GydF4y2Ba

WT：GydF4y2Ba

野生型GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

该工作得到了中国国家自然科学基金的支持[31972418,31501764和31572126]。GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

1. 温州大学生命与环境科学学院生命科学研究所，浙江温州325000GydF4y2Ba

   苗颖菁，林苏GydF4y2Ba

2. 浙江大学蔬菜科学研究所细胞与分子生物学实验室，杭州310058GydF4y2Ba

   英晶苗族，嘉禾曹＆李黄GydF4y2Ba

3. 浙江农林大学农业与食品学院，浙江临安311300GydF4y2Ba

   余有健GydF4y2Ba

4. 浙江省生物医学协作创新中心，温州，325000GydF4y2Ba

   林苏GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

JC和SL构思并设计了这项研究。YM、LH和YY进行了实验。YM和SL分析了数据并撰写了手稿。所有作者都阅读并批准了最终手稿。GydF4y2Ba

通讯作者GydF4y2Ba

对应到GydF4y2Ba林苏GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

同意出版GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

利益争夺GydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。GydF4y2Ba

出版商的注意GydF4y2Ba

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。GydF4y2Ba

开放获取GydF4y2Ba本文根据创意公约归因于4.0国际许可证，这允许在任何中或格式中使用，共享，适应，分发和复制，只要您向原始作者和来源提供适当的信贷，提供了一个链接到Creative Commons许可证，并指出是否进行了更改。除非信用额度另有说明，否则本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创造性公共许可证中，除非信用额度另有说明。如果物品不包含在物品的创造性的公共许可证中，法定规定不允许您的预期用途或超过允许使用，您需要直接从版权所有者获得许可。要查看本许可证的副本，请访问GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba．创作共用及公共领域专用豁免书(GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba）适用于本文中提供的数据，除非另有用入数据的信用额度。GydF4y2Ba

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