赤霉素对黄羽扇豆花药开裂的调控(黄羽扇豆（法律）

背景

导致花粉粒释放的花药开裂受到多种因素的时空调控。在黄色羽扇豆(黄羽扇豆L.），一个展示克里斯科克明的物种，花药在花之前分裂，但这个过程的过程和调节是未知的。通过荷尔蒙途径进行特定对特性发展的控制，可确保生殖成功的广泛作用。在我们以前关于黄羽羽的花和早期豆荚开发的研究中，我们表明了最低的成绩单水平Lldella1.赤霉素（GA）信号的主要阻遏因子，大约发生在花药开放时；因此，本研究的主要目的是对赤霉素（GA）进行精确的研究_3.） - 依赖于该物种中的花药裂开的调节。

结果

本文研究了黄羽扇豆花药开裂过程中花药结构的特殊变化，包括木质纤维素沉积引起的药室内壁二次加厚、隔膜/口处的酶促细胞壁破坏和程序性细胞死亡（PCD）引起的细胞变性，并确定了几个与这个过程广泛相关的基因。基因的表达谱随着时间的推移而变化，在花药开放前或开放时，mRNA的积累最为强烈。转录活性也显示这些基因以GA依赖的方式高度共表达和调控。GA的细胞和组织定位_3.结果表明，这些分子在花药开放前就已经存在，主要存在于隔细胞、维管束附近和药室内壁，随后就不被检测到。GA公司_3.本地化与与GA生物合成和失活相关的基因的转录活动强烈相关。结果也表明了GA_3.控制llgamyb.通过利米尔159依赖的途径。

结论

结果表明，遗传算法有明显的贡献_3.在对黄羽羽的广泛花药脱屑过程中的控制中的控制。理解在激素和分子水平下的花粉释放的过程是控制这种经济上重要的豆科作物物种中生育能力的重要方面，并且对育种者越来越令人感兴趣。

雄蕊的发育和活花粉粒的释放是影响植物生殖的关键因素，其次是授粉、受精和结实发育。由于对产量的影响，这对包括豆科在内的作物尤其重要。对雄蕊发育的认识正在增加，但大多数的信息来自于对雄性不育突变体的分析拟南芥和米饭（水稻) [1那2那3.那4.那5.］．模型植物雄蕊发育有14个早期和晚期阶段答:芥[1那6.那7.]. 成熟雄蕊发生的基本和广泛的过程是花药开裂，通常包括以下几个阶段：（I）药室内壁扩张和负责药室内壁和连接细胞壁增厚的物质沉积(二） 绒毡层和中层退化（7-11期）(三） 两室间隔膜的酶促开放及其进行性退化（11-12期）(四） 由修饰表皮细胞形成的口破裂（12期）；在第13阶段，花粉粒从小室中释放出来。最后，花药衰老并与花分离（第14a-14c阶段）[1那2］．许多种，如答:芥、烟草(烟草)而水稻则表现出相似的花药开裂过程[1那8.那9.那10]. 鼻中隔的分化和退行性变n .烟草）和裂口是保守的[8.];然而，发育存在差异，例如，在花药结构或键入endothecial增厚[11那12］．许多证据表明次生细胞壁增厚在花粉释放中起着至关重要的作用。有人认为，这与释放力量破坏口孔细胞密切相关[2那4.那11］．二次细胞壁的关键部件是木质素，纤维素和半纤维素（XYLAN和Glucomananan）。木质素由三个亚基组成，即对羟基苯基（H），胍（G）和霉菌，最重要的酶催化，即木质素生物合成的最后一步是褐煤脱氢酶（CAD）[13］．在答:芥， 二无赖基因（计算机辅助设计那计算机辅助设计)这些基因的突变体表明药室内壁缺乏木质素，导致花药不开裂[14]. 在参与次生细胞壁形成的基因中，不规则木质部1/6/8（IRX1/6/8号）也可以区分[15那16那17］．IRX1型，具有替代名称纤维素合酶A催化亚基8（塞萨8)，是合成纤维素所必需的[16];IRX6型（同义词COBRA样4那钴)编码眼镜蛇家族的一员，用于纤维素的沉积IRX8型（同义词半乳糖醛酸转移酶12那GAUT12)糖基转移酶（GT8）属于CAZy家族，参与木聚糖和木质素在次生细胞壁的沉积[15那18]. 花药开裂的主要事件之一是果胶降解导致细胞分离，这涉及多聚半乳糖醛酸酶（PGs）等酶。QUARTET2（QRT2）是一个小家族endo-PGs的一部分，参与花药开裂过程[4.那19］．许多论文表明，隔膜和浮雕通过发育编程的细胞死亡（PCD）的过程，作为裂开的一部分，经历退化和细胞死亡的过程。此外，植物细胞通常响应激素介导的信号通路进行PCD [8.那20.]. 在与PCD相关的基因中答:芥那促进细胞生存1（保时捷中心1)被认为是一种重要的编码天门冬氨酸蛋白酶的因子，在生殖和胚胎发生过程中起作用。使用过表达的转基因植物保时捷中心1， Ge等人发现该基因抑制花药中PCD通路的单个元件[21］．

对晚裂突变体的检测表明，花药开放时间受植物激素等多种因素的严格控制。通常情况下,答:芥在植物激素生物合成或感知方面有缺陷的突变体是雄性不育的，其花药分裂太晚，无法进行有效的授粉和受精[8.那9.那22那23］．赤霉素(GAs)在控制花粉形成和生活力、花丝伸长和花药开裂方面起着重要作用[5.那24那25那26那27那28］．晚期Ga生物合成阶段由吉伯塞林3-氧化酶（GA301）催化，其负责生产活性植物激素分子和胃纤维蛋白2-氧化酶（Ga 2氧钛），其失活。GA信号通路中的中心因素是伽米布，属于R2R3-MYB亚家族。大麦(大麦芽)显示过度表达HvGAMYB导致具有贴心的表型[29]. 另一项研究显示伽米布与MicroRNA合作，特别是mir159合作30.]. 这些事实表明，需要一组复杂的相互作用来协调花内导致花药开裂的事件。

与异花授粉相比，花药开放发育时间影响授粉类型和自花授粉程度。这对育种计划和农业的种子生产很重要。一般来说，花粉释放发生在花朵完全开放的时候答:芥花期13[31];但是，在一些植物中，包括黄羽豆（黄羽扇豆在闭花中发现了一种特殊的自花授粉类型(闭花授粉)。黄羽扇豆还具有固定大气氮的能力，种子中蛋白质含量高;因此，它在世界范围内被用作食物和饲料来源。然而，这种豆科植物存在过早脱落的问题[32那33那34那35］．多年来，有一个假设，过度花脱落的原因可能是不正确的雄蕊发育，因此，授粉不足，施用和豆荚设置，降低产量。我们之前的研究表明，改变了级别Lldella1.MRNA，编码GA信号的主要压缩机，支持正确的花和POD开发[34]. 有趣的是Lldella1.在花蕾期相对较高，然后略微下降，直到花药开口;在授粉期间，施肥和早期荚开发，观察到转录水平的逐步增加。这是间接地表明气体在花发育中的参与。在不同的植物物种中，对雄蕊发展中的气体作用的研究专注于早期阶段，并且有很少或没有可用的数据在晚期阶段的效果，包括花药裂开。因此，本研究的主要目的是了解黄羽磺胺的GA调后花药开发的未开发过程，这可能导致未来的男性生育率，并有助于消除低产的问题。我们专注于基因和蛋白质，这可能是在黄色羽扇豆的发育变化的潜在标志。在施用各种化合物后，在施用各种化合物后与裂开的基因表达谱的检查（赤霉酸，GA_3.和多效唑(PAC)联合使用GA_3.免疫定位为黄羽扇豆花药发育过程的调控提供了广阔的视野。预测蛋白的功能是基于保守结构域、基序和特定氨基酸的存在来定义的。本研究辅以组织学分析，以确定黄羽扇豆花药在大面积开裂过程中结构的变化。

不同发育阶段羽扇豆花药结构的特异性变化

选择黄羽扇豆花药发育后期（LAD）发生开裂的个体阶段（图。1一种）。在LAD的第一阶段（1个LAD），其对应于答:芥第11期，分离出4个带花粉的房室。1b）。因此，花药是在线切片和四孢子。在黄羽羽的中心，发现含有两侧的隔膜的血管束的结缔组织（其分开该当地）。此外，隔膜细胞的特征在于根据其位置的不同尺寸，其倾向于更靠近花药中心的细胞要大得多。围绕花药局的壁由以下细胞层组成：表皮，内皮，中间层和绦虫。外部定位的表皮由一层纵向细长的细胞组成。分化的表皮细胞形成与隔膜细胞相邻的呼吸区域。下一层由具有可见的二级细胞壁增厚的横向细长的内皮细胞组成。另外，在当地中可见Tapetum的遗体（图。1B).在LAD 1期，也注意到鼻中隔从吻合口破裂(图。1C).这产生双房花药，隔细胞在LAD第二期(2 LAD)明显恶化(对应于答:芥阶段12）（图。1D).气孔形成一个单细胞区域，其位置决定了花药开口的位置。隔膜后期收缩和破裂似乎有助于破口，从而导致花粉释放(这些过程同时发生)。分裂过程不影响中央结缔细胞，使其保持连接。2 LAD发生黄色羽扇豆花药开放，对应于第13期答:芥(无花果。1E） 是的。开裂后，花药发生衰老（3 LAD，Fig。1F/G），其特征是细胞进一步退化和收缩，以及整个花药结构（4 LAD，Fig。1你好）。

内皮细胞壁的次生增厚

在黄色羽扇豆花药开裂的第一阶段，位于子房室周围的内皮层发生次生增厚。2A） 是的。细胞壁呈U形增厚。同样的情况也发生在结缔组织细胞壁上，但程度要小得多。其它的花药细胞，例如产生表皮、隔或口部的细胞，不经历加厚，这表明次生加厚的区域严格地局限于药室内壁。

次生壁相关基因的表达谱(图。2B） 有无GA_3.建立了黄羽磺丁的所有LAD相的应用（图。2C） 是的。在LAD的第一和第二阶段，表达水平明显升高LLCAD.和所有LlIRX与第三和第四LAD期的基因进行比较。此外，GA_3.处理增加了木素/纤维素/木聚糖生物合成基因的数量，特别是在LAD第二阶段。可见，黄羽扇豆内皮细胞壁次生增厚相关基因表达共同上调，其转录活性主要与黄羽扇豆LAD第1和第2期的变化有关。此外，似乎所有被识别的基因的转录水平都是GA依赖的。

隔膜/口孔细胞破裂

细胞分离是在黄羽羽花药中发生的重要事件。Dehiscence涉及相邻电池之间的细胞壁材料的中断（图。3.A).很可能内切蛋白和植物激素参与了这一过程。在LAD的选定阶段，我们检测了转录活性LlQRT2型，编码参与细胞之间果胶衰弱的标记酶（图。3.b）。结果表明金额LlQRT2型当隔膜/口腔阵风的崩溃发生时，MRNA在第一和第二个阶段高。在第三和第四个阶段检测到较低水平的转录物。有趣的是，LlQRT2型表达被Ga刺激_3.尤其是在第二阶段。

中隔/口细胞经PCD相关过程的变性

黄褐色花药隔膜和浮雕接受退化和细胞死亡，以促进花粉释放通过GA依赖性PCD相关方法（图。3.C).为了证明这一点，我们确定了的表达谱LlPCS1公司，编码天冬氨酸蛋白酶，是一种抗细胞死亡成分。一如预期，GA_3.应用降低的转录活性LlPCS1公司尤其是在LAD的第一和第四阶段（图。3.d）。这是间接地表明了GA_3.通过抑制抗PCD因子，在黄色羽扇豆间处理中得到这种过程。

赤霉素在黄羽扇豆花药发育过程中的细胞和组织定位

我们对GA进行了细胞和组织免疫定位_3.在黄色羽扇豆中的所有选定阶段的花药成熟的阶段（图。4.)．结果表明GA的最高累积_3.发生在花药开放前的第一个LAD期（图。4.A).在细胞水平，在双房花药形成时，变性的隔室细胞的整个细胞质中发现最强的荧光信号(细胞充满GA)_3.; 图。4.A1)。维管束附近、中间层和内膜细胞中均有较高水平的植物激素分子，表皮中含量较低。在LAD第二阶段，当气孔细胞被破坏，花粉室打开时，荧光信号表明GA_3.内容几乎是不可察觉的（图。4.B） 是的。GA公司_3.在逐步退化隔膜，中间层的细胞中发现的，附近的维管束（图4.B1）。在花药开放和成熟花粉粒释放后（3 LAD期），没有荧光信号表明GA的存在_3.观察到（图。4.GA C)。_3.当完全细胞变性和发生时间的老化时，也没有检测到信号（4个LAD阶段）。缺乏细胞核也是明显的，这表明了花药的整个细胞的变性和死亡的快速进展过程（图。4.d）。

GA公司_3.定位与GA代谢相关

的表达谱llga3ox.参与形成活性植物激素分子和LlGA2ox1型负责GA失活(图。5.)来验证它们是否与内源性遗传相关_3.等级。在LAD的后续阶段，减少llga3ox.观察mRNA水平(图。5.一种）。如果是LlGA2ox1型，发现了相反的情况(图。5.b）。此外，使用PAC，其抑制GA生物合成的早期阶段的，显著减少两个研究的基因的表达。

GA公司_3.在花药发育后期通过miR159依赖的途径控制LlGAMYB的表达

佐治亚州黄羽扇豆_3.在调控可能参与llgamyb.通过控制利米尔159表达式级别。这个llgamyb.和利米尔159LAD的四个阶段以及GA后的转录活性_3.和PAC应用，检查(图。6.)．这llgamyb.无论有无GA，表达量几乎相同_3.治疗，但缺乏ga_3.由于PAC应用导致增加llgamyb.特别是在LAD的第一和第二阶段(图。6.一种）。这些结果表明，GA_3.可能是间接调节llgamyb.表达。因此，我们检查了利米尔159表达谱(无花果。6.B） 是的。GA公司_3.治疗增加利米尔159mRNA水平，重要的是，PAC的应用显著降低了利米尔159．通过在不应用任何化合物的情况下分析自然条件，可以得出结论llgamyb.在LAD的前两个阶段表达量高，然后降低。这与基因的转录活性呈负相关利米尔159在LAD的第二阶段显著增加。这可能是细胞mRNA含量减少的原因llgamyb.在第三和第四阶段。结果表明llgamyb.与共同表达利米尔159在黄色羽扇豆花。它还如此llgamyb.转录物水平可能由MiR159在黄色羽扇豆的麻花中调节。

研究基因的电子分析

许多基因编码酶与花药开裂促使我们进行生物信息学分析。从黄羽扇豆中鉴定出的全长cDNA序列、推导的氨基酸序列、分子量、预测的等电点和NCBI登录号(图S1,年代2,年代3.,年代4.,年代5.,年代6.,年代7.,年代8.,年代9.a).构建与预测的黄色羽扇豆中蛋白质相似性/同属度最高的不同蛋白质的最大似然系统发育树(图S1b、 S码2b、 S码3.b、 S码4.b、 S码5.b、 S码6.b、 S码7.b、 S码8.b、 S码9.b） 是的。在所有情况下，黄羽扇豆蛋白与豆科植物尤其是窄叶羽扇豆蛋白的关系最为密切(L. Angustifolius.). 为了更好地理解所有黄羽扇豆蛋白的功能，我们发现并定位了保守的结构域、基序和特定的氨基酸（图3）11A'-F'；图S12一个“c”)。利用许多植物中存在的相似蛋白的背景，确定了黄色羽扇豆中所有保守结构域、基序和氨基酸的位置(图S1CS2CS3.CS4.CS5.CS6.CS7.CS8.CS9.C）。另外，预测的黄羽磺丁蛋白基于其他植物物种中描述的那些（表1). 黄羽扇豆蛋白的三级结构是用Robetta服务预测的（图S）11A-F；图S12A-C）。另外，与其他植物物种的氨基酸序列进行比较。包括相同氨基酸的相似性和数量（图。1d,年代2d,年代3.d,年代4.d,年代5.d,年代6.d,年代7.d,年代8.d,年代9.d）。遵循植物王国中的蛋白质如CAD，CESA8，COBL4或GAUT12，而剩余的蛋白质（PG / QRT2，PCS1，GA3OX，GA2OX和GAMYB）在密切相关的物种中表现出更大的亲和力，但相同程度更低/类似物种的相似之处答:芥. 完整的cDNA序列Ll-MIR159在黄羽扇豆中鉴定（图10)与…相比MIR159在其他植物物种中克隆的序列显示出最高的相似性。在此基础上，构建了系统发育树（图。7.一种）。更多Ll-MIR159分析显示，形成成熟miRNA的21nt片段与在不同植物物种中鉴定的另一个片段具有非常高的相似性。在比较的12个物种中，有11个物种的这些序列片段是100%相同的（图。7.B） 是的。Ll-pre-miR159的二级茎环结构片段和成熟的miR159在前体序列的茎上的定位（图。7.C） 是的。Ll-pre-miR159与成熟miR159的核苷酸序列比对Manihot Esculenta.那Dimocarpus龙眼那Populus Trichocarpa.那Populus tomentosa那Cucumis梅洛那柑橘sinensis.和答:芥显示了（图。7.D） 是的。基因的某些核苷酸序列的排列llgamyb.(Ll-miR159靶基因)的同源基因甘氨酸Soja.那G最大值和答:芥还提供了（图。7.e）。

在闭花受精黄羽扇豆的花药结构的变化

花药的开裂是一种多级过程，这些过程已经在诸如答:芥、大米、玉米(Zea Mays.)、烟草和番茄(番茄茄) [4.］．在我们以前的一项研究中，我们表明黄色羽扇豆花药开口发生在花发育的第四阶段[34]. 因此，研究受试植物的花药发育后期及其伴随的变化具有重要意义。在本文中，我们确定了花药壁由表皮、药室内壁、中层和绒毡层组成，类似于其它植物的组成，包括大麦和小麦等闭花受精植物(小麦属植物L.)和合花种，如番茄和水稻[10那54那55那56］．黄色的羽扇豆表皮保护着花药的所有组织，并发育气孔，气孔是花药开放的重要部位，而气孔内壁的修饰在花粉释放中起着关键作用。黄羽扇豆其他花药组织的作用与几种植物相似;因此，花药开裂过程被广泛保存[1那4.那8.那10那54那57］．尽管如此，有一些例外[12]. 与黄羽扇豆不同的是，黄羽扇豆的匍匐茎断裂和花药开放的过程在时间上是相互联系的三叶葱，这些过程是分开的。在同时破裂两座浮雕之后答:三棱的螺纹没有完全开放，由于表皮细胞未被释放，花粉不会释放[58］．豆类是克里安伯斯植物最大的家庭之一，虽然有不同类型的克莱斯科米[59］．羽扇豆属植物在花蕾期授粉时，通常会出现花前闭花受精，但花朵最终开放。大多数一年生羽扇豆物种通过自花传粉繁殖，但异花传粉也可能在较小程度上[60］．如花生(花生)，有二型/真闭花配花，包括花的二型性和同一个体或物种内不同的发育途径[59那61］．还有只有Cleistogamous Flowers（完整的克莱斯焦），包括许多兰花和草[59］．

黄羽扇豆花药内壁木质纤维素沉积导致次生加厚

内皮细胞壁的二次加厚根据种类有四种基本形式：（I）环状肋，（II）形成U形加厚模式的螺旋肋，（III）网状肋和（IV）掌状肋[4.那11］．有些物种可能有两种增厚，但内膜壁通常只显示一种类型[11］．例如，在答:三棱的有螺旋形和U形增厚，而番红花（鸢尾科）种。加厚物以重复的连续环的形式改变[58那62]. 药室内壁的位置和形状也可能因物种而异。在黄羽扇豆中，药室内壁部分包围着小室；在番茄中，药室内壁位于花药的上三分之一[54]，玉米内皮层环状附着于子房室[4.那63]. 此外，在黄羽扇豆属植物中，次生加厚主要存在于药室内壁细胞（很少有药隔），而在某些种类中，次生加厚也存在于其他类型的花药细胞中。答:三棱的内膜以及间隔细胞和房室周围的结缔组织增厚[58]. 在某些种类中，加厚的表皮可能发挥与药室内壁相似的功能，从而提供机械力来支持花药开放[64]. 众所周知，裂开机制在家系之间和给定家系内部都是可变的。花药的开放可能是通过细胞裂解和/或机械力引起的；在次生细胞壁增厚和干燥的帮助下，匍匐茎破裂，释放花粉粒。

内皮层中木质素的存在决定了次级细胞壁增厚的形成。在大多数物种中，CAD酶参与木质素单体的生物合成，并将肉桂醛转化为其相应的醇。这答:芥突变的缺乏无赖显示雄性不育，与野生型（WT）植物相比，木质素含量降低，木质素结构极大地破坏了[14]. 这些changes cause a sterile mutant due to the lack of lignification of the endothecium, which does not result in secondary thickenings and hence does not release pollen. In our paper, we examined the transcriptional activity ofLLCAD.在黄色羽扇豆的晚期开发期间。最高水平LLCAD.在细胞壁木质化的第一和第二阶段有表达。与第三和第四个LAD阶段相比，发现了大约20倍的基因转录物。这表明LLCAD.参与黄金植物组织的木质素生物合成。

除了内皮癣的瘫痪，纤维素增稠也对于花药裂开也必不可少。突变的答:芥CesA8/IRX1型负责纤维素合成的基因，不影响初生细胞壁增厚的形成，这使得我们可以利用该基因作为次生增厚的特异性标记[15那16］．在黄色羽扇豆中，表达的是LlIRX1/法学学士8在小伙子的前两个阶段都很高。这与基因的转录活性密切相关LLCAD.和其他被识别的基因LlIRX6/LlCOBL4型和LlIRX8/LlGAUT12. 一般来说，眼镜蛇编码植物特异性糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白的基因是次生细胞壁中纤维素沉积的关键调控因子[65］．反过来，木聚糖和果胶缺陷irx8型有变异的GAUT12该基因的缺失导致G木质素的减少，其沉积的变化，以及花药分裂的缺乏[18］．

不同的植物激素控制许多植物物种中二次增厚的形成和沉积。例如，Cytokinins（CKS）涉及二次壁形成的调节，因为AHP4（含有拟拟拟征氨酸组氨酸的磷酸酯4），其是CK信号传导的元素，负调节内皮中的增稠[66]. 另外，基因的转录活性AHP4型对应于IRX1型/IRX6型/IRX8型表明CKs控制纤维素的生物合成[4.那66］．到目前为止，我们对GAs对二次增稠形成的影响知之甚少;因此，它成为了我们研究的对象。这种植物激素处理对所有次生增厚相关基因表达的影响非常相似，包括增加转录本数量，特别是在LAD的第二和第三阶段。在Cucumis梅洛，几种激素响应性CIS-SCOLUSINATION元素无赖启动子区域被识别，包括GAs的GAREs、TATC box和p -box特性[40］．它还证实了天然气在通往交通的综合进展中发挥的重要作用。

中隔/口被酶解并经历PCD介导的变性

在黄羽扇豆花药，从裂口细胞隔膜的分离似乎通过类似于器官脱落过程的机制，其涉及在单元之间的中间薄片的酶促裂解而不损害其发生[35]. 在我们的研究中LlQRT2型研究了编码在黄色羽扇豆类中的小管道中涉及果胶分解的标记酶的基因。当隔膜和口腔分裂时（分别和第二个LAD相），转录物水平最高。如果解离是机械的，例如通过拉伸膨胀的花药墙壁，它会损害所涉及的细胞[62］．Ogawa等人(2009)研究表明，细胞分离事件的调控涉及PGs和植物激素的组合[19］．答:芥和番茄第页突变体显示延迟或阻塞花药裂开;因此，已知细胞壁酶裂解的作用重要[19那67]. 另外，基因的转录活性答:芥PG-QRT2.由JA，ET和ABA监管[19］．在黄羽羽内，已经揭示了Ga_3.ET前体调节花脱落区的功能；但是，GA_3.在这个过程中独立于ABA发挥作用[33］．在本文中，我们证明了LlQRT2型转录水平由GA阳性控制_3.．水平LlQRT2型mRNA表达增加，尤其是在LAD第二阶段，这表明GA依赖于对植物隔/口中断的调控。天然气对环境影响的数据PG.缺乏不同植物物种中的表达。在答:芥花药，另一种植物激素的应用Ja，导致增加QRT2.那ADPG1型（拟南芥裂开带多聚半乳糖醛酸酶1)以及ADPG2公司表达约10倍[19］．在小麦（T. Aestivum.），启动子序列中的顺式作用元素磁带基因被预测[68]. 重要的是，它们包括由植物激素和诸如脱落酸（ABA；ABRE）、GAs（P-Box）、生长素（TGA元素）、茉莉酸甲酯（MeJA；CGTCA、TGACG）和MYB结合位点参与干旱诱导（MBS）。类似的研究也在中国进行芸苔属植物oleraceaMeJA（CGTCA）、生长素（TGA-box和AuxRR-core）、GA（GARE、P-box、TATC-box）、水杨酸（TCA-element）和ABA（ABRE）为激素反应顺式元件[69］．

黄羽扇豆分离的隔细胞逐渐退化。隔膜首先退化形成双目花药，然后匍匐细胞退化破坏花药壁。在其他植物中，这些发生在特定细胞中的过程是由PCD辅助的[1那8.］．Ge等人。（2005）表明PCD抑制因子基因保时捷中心1编码天冬氨酸蛋白酶，在胚胎发生和配子体形成过程中促进细胞存活。保时捷中心1不是在组织中连续表达，而是参与各种特定的发育过程。一种典型的模式保时捷中心1表达已被证明在发育中的花，年轻的西力克和花药。进一步的分析揭示了保时捷中心1花粉和花药壁中的mRNA，除了绒毡层，没有提供任何信息[21］．过度的保时捷中心1在答:芥花药对裂开过程有抑制作用；因此，我们致力于建立该基因在黄羽扇豆组织中的表达。我们的结果表明LlPCS1公司在小伙子的不同阶段波动。这非常有趣LlPCS1公司转录活动由GA控制_3.. 正如预期的那样，激素分子减少了LlPCS1公司mRNA，尤其是在LAD的第一和第四期，间接证明了黄羽扇豆隔/口细胞退化的GA依赖性。总之，这些结果表明，黄羽扇豆花药发育过程中存在PCD相关的过程，但这些严格控制的过程的机制有待进一步研究。在不同的植物种类中，有两种主要类型的气孔破裂，基本的机械破裂和活动性PCD相关的退化[8.那9.那70］．发育PCD由植物激素控制。桑德斯等人。（2000）表明，与JA生物合成途径相关的突变体opr3.其特征在于肿瘤细胞变性的延迟，剧中脱裂脱裂[9.]. 因此，有强有力的间接证据表明这些激素参与PCD和花药开放过程。

赤霉素是黄羽磺胺的花药的调节剂

在花药发育的早期阶段，主要是绒毡层和花粉，气体的多功能性是通过分析答:芥和水稻突变体。然而，由于早期的ga缺失突变干扰阻止了进一步的花药发育，与最终分裂相关的花药发育的后期阶段还没有被很好地了解[71]. 在黄羽扇豆中，表达谱研究表明Lldella1.，它们编码了GA信号的主压缩机，促进了适当的花卉和POD开发。这Lldella1.花药开放时mRNA水平最低，受精期和荚果发育早期mRNA水平升高[34］．这鼓励我们研究遗传算法的定位_3.在黄色羽扇豆的晚期花药开发的选定阶段。我们在这项工作中获得的结果与表达模式密切相关Lldella1.基因，以相反的方式。GA的最高积累量_3.发生在第一个LAD阶段，在花药开放之前。GA_3.主要观察到信号在血管束附近的退化隔膜细胞，中间层，内皮，且较少频繁的表皮中。在第二个LAD相中，其中呼吸阵容被打开并且花粉室打开，荧光信号几乎是不明的，并且在第三和第四个阶段中没有检测到信号。在米饭的情况下，GA_4.花药在开花前积累量最高。活性激素分子水平下降，花后一周在幼子中完全检测不到[72]. 这些results suggest that GAs play an important role in specific organs (place) at a specific stage of the life cycle (time) and that they may comprise the strict regulation of reproductive growth and development in different species.

GA生物合成抑制剂PAC在矮牵牛上的应用(矮牵牛）导致从花药发育的在postmeiotic相的抑制导致雄性不育。详细的分析表明，该结缔组织细胞和绒毡层被退化，但花粉粒仍然存在。在矮牵牛转基因植物中过表达GA信号阻遏atspy.，花药表型与PAC治疗后观察到的相似[73]. 在一些植物中，GA生物合成的抑制阻碍了减数分裂后的花药发育（矮牵牛，答:芥，但在其他的情况下，堵塞发生在减数分裂之前，如番茄[71］．涉及Ga生物合成的关键和最终基因是Ga3ox.. 我们发现llga3ox.严格按照GA关联_3.黄色羽扇豆在晚些时候的发展中的本地化。最多llga3ox.在第一和第二个LAD阶段中发现了转录物，第三阶段和第四阶段的水平显着降低。此外，在施用Pac后，金额llga3ox.mRNA减少了一半以上，主要是在前三个选定的阶段。这表明llga3ox.该基因可能参与了生物活性激素分子的合成，在黄羽扇豆的研究过程中起着重要作用。此外，我们还证明了LlGA2ox1型，编码负责Ga失活的酶，表明对此的相反表达llga3ox.．在许多植物物种中，参与GA生物合成和雄蕊发育失活的基因的作用是很清楚的。的转录活性AtGA3ox1-AtGA3ox4型在雄蕊中观察到基因Atga3ox1.也在其他一些花器器官中表达。雄蕊长丝和花药都需要气体进行适当的发展，并且在两个位点确认了该激素的De Novo合成。成绩单Atga3ox1.在灯丝中发现的，和AtGA3ox2-AtGA3ox4型基因在花药和花粉中表达[26]. 天然气，主要是GA_4.，需要从雄蕊或花托运输到其它花器官以保证正常发育。尽管缺乏表达所有AtGA3ox公司花瓣中的基因Atga3ox1.和Atga3ox3.花瓣发育严重缺陷[26]. 在黄羽扇豆花药中，这可以通过观察到表明GA存在的荧光信号来解释_3.在导电束的细胞中。因此，存在活性植物激素分子从花药输送到长丝的很高的可能性，反之亦然。在Petonia中观察到一种类似的情况，其中GA申请恢复了正常的花冠图案，以前通过去除雄蕊而干扰[74］．同样，花药表达模式Ga3ox.在烟草和水稻中也观察到基因[75那76]. 综上所述，在不同的植物种类中，雄蕊是花中气体的主要来源。除了它们对雄蕊发育的局部影响外，它们向花器官邻近组织的运输也同样重要[26］．

GAMYB转录因子介导谷物糊粉层中GA信号转导。此外，还必须保证许多品种花药的育性。与GA生物合成突变体相似，gamyb表明GA信号在花药发育早期阶段的影响。的突变伽米布水稻的双突变MYB33和MYB65在答:芥中断PCD，引起绒毡层细胞异常增大，从而阻碍花粉发育[28］．然而，有关的作用的数据很少伽米布在花药发育后期。在本文中，我们研究了黄色羽扇豆llgamyb.LAD及GA后特定阶段的表达_3.和PAC的应用。这llgamyb.转录物水平几乎与或没有GA_3.治疗，但PAC的应用导致增加llgamyb.mRNA，特别是在LAD的第一和第二阶段。这表明GA_3.依赖途径可能控制llgamyb.表达但不直接的表达只能假定GA的存在_3.阻断正向调节表达的转录因子llgamyb.，但确切的机制还需要进一步研究。在其他植物中获得的结果表明HvGAMYB在大麦和GAMYB样基因在答:芥在花中表达，并受GAs正向调控[29那77］．它遵循的角色伽米布在花药期间的Ga-Curmupt基因表达中，物种之间的不同之处不同。而且，功能的功能伽米布在一个物种内，不同的发育过程也不同，例如种子萌发、营养和生殖发育[78］．有趣的是，在大麦上进行的研究结果表明转基因植物强烈过度表达HvGAMYB在花药中完全是雄性不育。这种表型的特征是一个完整的隔膜[29］．考虑到我们的研究结果在黄羽扇豆，我们观察到GA的最高水平得到_3.进行性退行性隔细胞中，可见GA的存在_3.在花药发育的这个阶段，严格调控靶基因转录水平（建立一定的平衡），从而产生特异而正确的生理反应。花粉HvGAMYB-过度表达的大麦花药具有特定的表型[29］．小而不规则的花粉发育正常，部分花粉已被证明是有活力的。观察到的雄性不育主要是由于花药壁组织的破坏，而花药壁组织没有破裂[29］．与大麦相似，在赤霉素后的小麦中观察到小的、不裂的花药表型_3.治疗 [79那80]. 赤霉素应用后雄性不育的发生_3.在小麦中，与（1）的观察结合HvGAMYB过度表达导致盲目的诱惑，（2）llgamyb.遗传算法后表达相对稳定_3.申请，但在PAC治疗后增加，建议伽米布以特定于物种的方式在花药开发期间发挥特定作用。这需要进一步的研究和更多澄清。

很多报道都认为GAMYB样基因在答:芥是由一种叫做miR159的microRNA（miRNA）转录后调控的[30.那81］．miR159是一种小（21nt），非衍生自双链RNA（dsRNA）的非分子RNA序列。AT-MIR159影响其靶基因的转录活动，包括ATMYB33那ATMYB65和AtMYB101[30.］．在米饭，Tsuji等。（2006）透露，MIR159规定了转录水平伽米布仅在花中，糊粉细胞中未观察到这种情况。因此，对伽米布表达及其功能是器官特定[78］．由于这一事实，也找到了可能确定水平的因素llgamyb.我们研究了黄羽扇豆花药发育过程中的转录本利米尔159Ga.的表达_3.和PAC的应用。有趣的是，Ga_3.治疗增加了死亡率利米尔159转录物含量和PAC处理显著降低。观察到的表达谱利米尔159部分解释了观察到的转录活性变化llgamyb.经过不同的复合应用。结果还表明，该表达式利米尔159基因是通过GA信号通路调控的。类似的情况发生在答:芥，在那里气体可以调节浓度[30.]. 花中GA的生物合成突变体GA1-3与野生型相比，miR159的含量明显减少。在突变体的花上施用GAs可使miR159的水平提高到与GA处理的野生型植株相当的水平，并且该水平高于未处理的野生型植株。由于ATMYB33过表达miR159的植株表现出雄性不育和延迟开花[30.]. 通过实验证明格斯记者基因，AtmyB33的定位：由基因编码的GUS与完整的miR159靶序列仅在年轻的花药中，而AtmyB33：在基因对miR159靶序列损伤时，在各种花器官中表达了GUS [81］．

通过在不应用任何化合物的情况下分析自然条件，可以得出结论llgamyb.在LAD的前两个阶段表达量高，然后降低。这与基因的转录活性呈负相关利米尔159在LAD的第二阶段显著增加。这可能是细胞mRNA含量减少的原因llgamyb.在第三和第四个阶段。获得的结果表明llgamyb.与共同表达利米尔159在黄色羽扇豆花。它还如此llgamyb.基因通过miR159黄色羽扇豆的花药调节。

在硅分析中

本文鉴定了9条与黄羽扇豆花药开裂过程相关的全长cDNA序列。该方法成功地鉴定和表征了所有预测蛋白的保守域、基序和特定氨基酸。这种方法使预测和分配特定的功能成为可能。所鉴定的基因编码与Fabaceae家族密切相关的功能蛋白。此外，多种蛋白质比对提供了许多植物物种中序列保存的信息。它还允许蛋白质序列片段的规范，这是它们执行功能的关键。系统发育树的构建可以对预测的黄羽扇豆蛋白的起源作出结论。

基于现有的生物信息学和实验结果，miR159介导的调控家族伽米布和GAMYB样基因多种植物，其中包括答:芥[81]， 白饭 [78]还有草莓[82]. 这些伽米布来自不同植物的基因llgamyb.在这项工作中从黄羽扇豆中鉴定出一个保守的miR159结合位点，该位点与相应的miR159序列高度互补，位于基因的框1和框2之间的保守区域伽米布基因(78那81］．这表明miR159-伽米布路径在物种间是保守的。

本文对闭花受精植物黄羽扇豆花药发育后期的激素和分子调控进行了研究(黄羽扇豆l）;这些知识是控制这种有价值的豆科作物物种中生育能力的重要方面。迄今为止，没有数据显示气体对与内皮细胞和浮雕的细胞壁和细胞变性在内皮细胞壁中的木质纤维素二次增厚相关的基因的转录活性的数据，通过PCD相关方法。因此，我们表明所识别的基因的时间表达，作为黄色羽扇豆样裂解期间发育变化的标志物在GA依赖性途径中受到调节。此外，组织和细胞定位表明GA_3.是这个过程的调节器，特别是在花药开放之前。适当的GA_3.在适当的时间和地点控制着黄色羽扇豆花药开放，可能是通过对GA代谢相关的水平的影响llgamyb.通过Ll-MIR159-依赖途径。因此，黄羽扇豆花药开裂受到高度调控，使花粉释放的时间受到严格控制，以最大限度地提高受精的机会。

植物材料、生长条件及复合处理

植物材料是黄羽羽（黄羽扇豆简历。变尖。从植物育种站Wiatrowo（波兰）获得的种子按照先前研究中所述进行制备和播种[34]在波兰中北部（53°05′02〃N 18°21′28〃E）的波美拉尼亚河Pędzewo试验场。在第5类土壤（贫瘠的耕地；按照制造商的建议对土壤进行抛光分类[83］．来自晚期开发的特定阶段的花药（1-4只，图。1a）用尖锐的手术刀从花中解剖。对于LAD的每个阶段，使用不小于80株植物，并且部分收集的材料先前用甲虫酸（GA_3., 100 μM）或GA生物合成抑制剂多效唑（PAC，100 μM）在0.05%吐温20溶液中使用喷雾器。以相应发育期的花药为对照组，仅用0.05%吐温20溶液处理。根据计划实验，3 施药后h，收获花药，新鲜处理或液氮冷冻（室温下贮藏）− 80 °C直到使用）。

识别CDNA.

不同基因的cDNA序列不同。基因的分子克隆LlGA2ox1型cDNA按照先前的研究进行[33］．的识别llgamyb.cDNA如下：1 用研钵和杵在液氮中捣碎一克黄绿色的花。然后根据制造商的说明书（德国杜伦Macherey-Nagel的NucleoSpin®RNA试剂盒）通过柱法分离总RNA，并使用1 μg RNA，寡糖（dT）₁₈引物和转录器高保真cDNA合成试剂盒（Roche，Mannheim，德国）。使用1.25 U永久Taq DNA聚合酶进行触滴PCR^热启动（EURX，GDAńSK，波兰），2μl的第一链cDNA，1x缓冲B，0.2 mm DNTP混合物，3.0 mm mg^２＋， 1 μM退化引物(Tab。年代1)去离子水（最终体积为50 μl）在T3热循环器中（德国哥廷根Biometra）。扩增的cDNA片段（704） bp，图S13A） 从琼脂糖凝胶（GeneMATRIX-agarose-Out-DNA纯化试剂盒，EURx）中分离纯化。在插入位点，将PCR产物连接到pCRII拓扑异构酶载体中（图13B, TOPO TA克隆试剂盒，Invitrogen, Carlsbad, USA)，并转入One Shot Mach1-T1大肠杆菌以质粒的形式。将细菌细胞接种在含有S-Gal/LB琼脂混合物（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）和氨苄西林（50%）的培养皿上 μg/ml）（图S13C）。Unlike dark blue bacterial colonies, white colonies were selected and cultured in liquid LB medium with ampicillin (50 μg/ml) for 12 h. Finally, plasmid DNA was isolated in accordance with the manufacturer’s guidelines (GeneMATRIX Plasmid Miniprep DNA purification kit, EURx), digested with the restriction enzyme生态RI（发酵剂）（图S）13d），由Genomed（华沙，波兰）测序。485 bp（图S14A） 和768 血压（图S14B)片段从3 ' RACE-PCR (FirstChoice rtm - race Kit, SuperTaq-Plus Polymerase, Ambion, Austin, USA)中获得，使用两对不同的引物(Tab。年代1)．分离出扩增子，纯化，克隆，消化（图S14C/D)，并按上述顺序排列。由于实验鉴定的5 '端llgamyb.cDNA，它是基于后来的RNA-Seq实验而获得的序列，该实验存放在序列读取档案(SRA)数据库中，登录号为PRJNA285604 (BioProject) [84和实验登录号SRX1069734。所有的片段都有重叠的核苷酸序列，这使得我们能够获得完整的序列llgamyb.顺序。来自RNA-SEQ实验的DE Novo组装的黄羽磺胺转录组也用于识别LLCAD.，全部llirxs.那LlQRT2型那LlPCS1公司那LlGA3ox1和Ll-miR159前体(Ll-MIR159)．

表达式分析

定量实时PCR（qPCR的）被用于建立所有鉴定的基因的表达模式。八十毫克冷冻花药的（在开发的有或无GA的特定阶段_3./PAC处理)在无菌研钵中用杵均质。根据制造商的说明，总RNA使用分离物II RNA植物试剂盒(Bioline, London, UK)分离，并与基质(2 μg)、寡核苷酸(dT)逆转录。₁₈（Roche）和转录器高保真cDNA合成试剂盒进行。使用含有0.1μgcDNA的混合物的20μl毛细管中的毛细管2.0基于转盘的系统（Roche）进行QPCR来进行含有0.1μg的CDNA的混合物，0.2μm基因特异性引物（标签。S.1), 0.05 μM通用探针库（UPL）水解探针（罗氏）（标签。S1), 1 × LightCycler TaqMan Master Mix（LightCycler TaqMan Master Kit，罗氏）和H₂O。使用以下程序：600 她96岁了 摄氏度；45 10次循环 她96岁了 摄氏度，20 在特定退火温度（表。S1)， 1 s在72°C;在40°C下30秒。阴性无模板对照(ntc)。肌动蛋白基因(LlACT，格纳银行登录号kp257588）被选中[32那33那34］．从产生标准曲线的CDNA的连续稀释液设计绝对定量，并且使用2（-Deltadeltac（T））方法测定相对基因表达（所研究的基因相对于内部对照基因和校准剂的数据）[85］．

组织学研究

含有4％多聚甲醛（W / V），0.2％戊二醛（V / V）和3％N-乙基-N' - （3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸酯（EDAC）（Sigma-Aldrich）的固定剂（Sigma-Aldrich）在1×磷酸盐缓冲的盐水缓冲液（1×PBS，pH7.2）中制备并施加在4℃下为适当的花药组织小片段12小时。将三重样品用1×PBS（pH7.2）洗涤10分钟。通过将材料放置在增加乙醇浓度（30,50,70,90,100％）（v / v）中来实现脱水。然后，在UV光下在-20℃下在-20℃下在-20℃下进行过饱和和甲基丙烯酸甲酯，甲基丙烯酸甲酯，甲基丙烯酸甲酯，甲基丙烯酸甲酯，甲基丙烯酸甲酯，0.5％（w / v）苯并素乙醚，10mM二硫代噻唑醇）（Fluka，Buchs，瑞士）。使用超微族（Reichert-Jung，德国）的半素切片，将其置于载玻片上，用0.05％甲苯胺蓝（Sigma-Aldrich）染色，并在LM Zeiss Axioplan（Carl Zeiss，Oberkochen，德国）显微镜下观察到Progres C3数码相机。

GA公司_3.免疫定位

对花药组织碎片进行固定、清洗、脱水、过饱和、包埋、聚合和切割，方法与组织学研究相同。将半薄切片用Biobond (BBInternational, Cardiff, UK)放在载玻片上，清洗后，根据制造商的说明，用BlockAid TM阻塞溶液(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)阻塞树脂。然后，切片与抗ga多克隆一抗孵育_3.（英国剑桥Abbexa）在1%牛血清白蛋白（BSA）中以1:50的比例稀释1倍 PBS（pH值 7.2）并放置在4 12°C H接下来，通过在1x PBS（pH）中洗涤3次去除一级抗体 7.2）和二级抗体（MFP488山羊抗兔IgG，MoBiTec，Goettingen，德国）在PBS缓冲液中稀释1:250，持续2小时 h 37岁 摄氏度。通过省略与一级抗体的孵育来进行阴性对照（图S）15). 最后用DAPI（1:2500）孵育10分钟 用蒸馏水冲洗。使用BP365、FT395和LP397滤光片在徕卡DMI4000B倒置显微镜下观察样品。

是silico分析

集成FastPCR V.6.5.99 [86]工具设计简并引物和RACE-PCR引物。通用探针库分析设计中心[87用于设计QPCR的QPCR特异性引物和用锁定核酸取代的短水解探针。使用基本的局部对准搜索工具（BLAST）分析所有基因和预测蛋白质的鉴定的cDNA序列[88]以及瑞士生物信息学研究所的生物信息学资源门户[89]，包括翻译工具[90]，它允许将核苷酸序列翻译成蛋白质序列，以及ProtParam工具[91]，这允许计算分子量和等电点。使用GenomeNet中实施的树探测器3（ethe3）v3.1.1程序的Python环境进行对准和系统发育重建。92］．使用PhyML v20160115进行最大似然系统发育树的推断，模型和参数为:——pinv e -o tlr -f m——bootstrap−2——nclasses 4——alpha e²基于近似似然比测试返回的参数值。在BLASTP中发现的不同氨基酸序列的多次对准，并使用CLUSTAL进行与黄羽羽序列紧密关联的相对对准[93]使用默认设置编程。通过NCBI保守域数据库（CDD）检查功能域的存在[94]，一种蛋白质注释资源，包括用于古代域和全长蛋白质的良好注释的多序列对准模型的集合。这些可作为特定于特定的分数矩阵（PSSMS），用于通过RPS-Blast快速鉴定蛋白质序列中的保守域。CDD内容包括NCBI-Cutated域以及从多个外部源数据库导入的域模型（PFAM，SMART，COG，PRK，TIGRFAM）。还使用TMHMM v预测细胞质和跨膜结构域。2.0 [95]和蛋白质的同源性/类比识别引擎2.0版（Phyre²) [96]蛋白质建模、预测和分析的门户网站。利用DiAlign程序（Genomatix）对不同植物的蛋白质进行了比较[97]使用默认参数。利用Robetta蛋白质结构预测服务构建了黄羽扇豆蛋白质的三级结构[98]，它使用PDB100模板数据库和一个基于协同进化的模型数据库(MDB)。使用UCSF ChimeraX将结果可视化[99]，这是生物计算、可视化和信息学资源(RBVI)的下一代分子可视化程序。Ll-pre-miR159序列使用microRNA数据库(miRBase)、ETE3和BLAST进行分析。RNA结构软件[100]用于计算LL-预miR159的二级结构。

统计分析

所有呈现的数据均为三个单独样本（生物复制）的结果，每个样本重复两次（技术复制），并以平均值表示 ± 标准误差（SE）。统计分析采用单因素方差分析，然后进行事后Tukey的HSD检验，差异在统计学上可以接受第页ydF4y2Ba < 0.05. 所有分析均使用R版本3.5.3进行。

支持本文结论的数据包含在本文及其附加文件中。所有已鉴定的黄羽扇豆基因的cDNA序列在genbi (genbi)上均可获得，登录号为:MW240675、MW240676、MW240677、MW240678、MW240679、MW240680、MW240681、MW240682、MW240683和MG181996。核苷酸和蛋白质序列分别从GenBank和protein database (NCBI)上下载。RNA-Seq数据可在NCBI序列读取档案(SRA)数据库中获得，登录号为PRJNA285604 (BioProject)，实验登录号为SRX1069734。

行为：

施

ADPG1 / 2：

拟南芥裂开带多聚半乳糖醛酸酶1/2

AHP4:

拟南芥组氨酸的磷酸替代4

C：

连接的

计算机辅助设计:

肉桂醇脱氢酶

CesA8:

纤维素合成催化亚基8 [形成]

CKS：

细胞分裂素

COBL4：

眼镜蛇4

电子邮件：

表皮

En:

药室内壁

GA公司_3.：

赤霉素

GA3ox:

赤霉素3-氧化酶

氧化镓：

赤霉素2-氧化酶

气体：

赤霉素类

表12：

半乳糖醛酸转移酶12

GPI：

Glycosylphosphatidylinositol

GT8车型：

糖基转移酶家族8

IRX1 / 6/8：

不规则的木质部1/6/8

小伙子：

花药发育后期

PAC：

多效唑

纤毛运动:

程序性细胞死亡

PCS1:

促进细胞存活1

P：

花粉粒

后卫:

多聚半乳糖醛酸酶

QRT2：

四重奏2.

东南方：

隔

St公司：

裂口

str：

口区

T：

毯

VB语言：

维管束

作者想感谢米莎·WiZii-Ski（NealaOUS哥白尼大学，生物和兽医科学学院，细胞和分子生物学系），以帮助制备显微镜实验的超切片。

该研究得到了波兰农业和农村发展部的支持[赠款号码149/2011和222/2015]。

隶属关系

1. 尼古拉·哥白尼大学植物生理与生物技术系生物与兽医科学学院，波兰Lwowska 1 St, 87-100, Toruń

   卡塔日娜·马尔西尼亚克和克日什托夫·普雷兹尼切克

贡献

概念与设计，KM;调查，KM和KP;分析,公里;撰写稿件，KM;编制图表，KM和KP;监督公里。作者阅读并批准了最终稿件。

通讯作者

通信卡塔日娜·马西尼亚克．

道德认可和参与同意

不适用。

同意出版物

不适用。

相互竞争的利益

作者们宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商说明

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。

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