在两个品种果实发育和油合成的比较研究山茶花鉴定

背景

油茶树(山茶花鉴定是一种木本树种，在种子中产生食用油。c .鉴定油具有很高的营养价值，也是一个重要的原料药和化妆品。在中国，由于对成熟期和许多的油合成机制的不确定性c .鉴定栽培品种，种植者可能过早收获果实，这不能最大限度地提高果实和油产量。在本研究中，我们的目的是探讨两者的合成机理和差异山茶花鉴定栽培果实成熟时期的精确定义和选择合适的品种。

结果

结果表明，7月份“花朔”果实和种子体积较小，干重较低，脂肪酸生物合成基因表达量较低。直到8月才在‘华硕’种子中检测到油体，7月在‘华金’种子中检测到油体。此外，10月份‘华火’种子未完全变黑，籽粒含水高达60.38%，含油37.98%左右，含油量远低于正常成熟籽粒。7 - 10月，‘华金’种子胚乳细胞油体含量始终高于‘华硕’。

结论

我们的结果证实了c .鉴定“华硕”果实成熟速度较“华金”果实慢，“华金”种子比“华硕”种子早进入合成油期。此外，“华朔”果实在霜降期间(每年10月23日至24日)不成熟。

油茶树(山茶花鉴定是一种常绿灌木山茶花在山茶科[1，2，3.］．本种广泛分布于中国南方丘陵地区，与橄榄树(齐墩果欧洲公司)、油棕(Elaeis guineensis）和椰子棕榈（Cocos Nucifera） [4，5］．茶油从C．oleifera种子是一种可食用的油，称为“东橄榄油”，具有高营养价值和保健功能[6，7］．茶油的不饱和脂肪酸含量高达90％，油酸含量大于80％，油富含小穗，维生素E，甾醇，多酚等许多具有健康促进作用的其他成分[8，9，10］．茶油广泛用于制药和化妆品行业。它不仅可以保护人体心血管系统和胃，还为一些高端化妆品提供重要原料[11，12，13］．

从1978年到2009年，我们的c .鉴定研究小组进行了84项比较区域评估c .鉴定克隆和最有利性状（果实大，产量高，种子含油量等），将其命名为“华硕”和“华锦”品种通过国家林业局的森林品种委员会[选择两个品种4］．两个品种的特征在于大的水果，高而稳定的产率和高的抗性（平均果实大小c .鉴定在中国是18.1克)[14，15］．由于其高产量，高光效，并产生强大的经济回报的能力，“华硕”和“华锦”被广泛栽培于中国红壤丘陵区。在先前的研究中，研究人员发现，水果在这两个成熟c .鉴定品种发生在霜降期间(每年10月23日至24日)[14，15，16］．但经证明，这一时期采收的‘华朔’果实的油产量明显低于其他品种，这与实验室的结果一致[17］．这种差异的原因可能是'Huashuo'水果的成熟度不是霜冻的下降期（每年10月23日至24日）。

果实是植物的贮藏器官c .鉴定在美国，大部分营养都集中在种子中。种子的发育伴随着干重的积累和含水量的降低。Contreras等人[18]表明种子的峰值干重是生理成熟的体现，并且脱水阶段是必要的种子从年轻发展到完全成熟[19］．在c .鉴定，脱水阶段会导致新鲜种子的含水量急剧下降，从大约90 - 40% [20.］．此外，脂质的积累与油量干重的增加密切相关[21，22］．脂类主要包括种子中的三酰甘油，以及脂肪酸和甘油[23］．此外，可溶性糖和淀粉作为贮藏材料，一般在种子发育初期含量较高;随着种子成熟，其含量逐渐减少[24，25］．另外，在种子胚乳细胞中的三酰基甘油分子可分散以形成油体或脂质体[26，27］．在以前的研究中，研究人员得出结论，细胞中的油体尺寸和面积与种子油含量正相关[28，29，30.］．因此，研究发展至关重要c .鉴定果实与它们的外部形态、内部营养和油体分布的关系。

基因表型方面发挥决定性的作用，转录组测序可以提供很大的洞察功能c .鉴定基因(31，32，33］．近年来,c .鉴定研究人员利用转录组测序获得了大量数据。通过使用c .鉴定“华朔”作为测试材料并分析转录组数据，Jiang等[34)发现,PLA2.，FAD2和FAD3能调节α-亚麻酸在c .鉴定种子，Zeng等[35的mRNA水平CoFBA和CoSAD与油茶树种子含油量密切相关。龚等[36探索了石油的生物合成和积累c .鉴定五个不同发育阶段的种子。此外，Peng等人[37和Lin等[38]，利用RNA-seq技术研究不同植物种子发育和脂质合成c .鉴定品种，为脂质生物合成和脂肪酸积聚机制提供新的洞察力。Wu等人。[39]进行了高油和低油的转录组比较研究c .鉴定品种并发现悲伤加速油酸合成和积累的高表达及FAD和FAE1的低表达降低了油酸的消耗转化。然而，不同品种种子发育和脂质合成的比较研究c .鉴定．因此，RNA-seq技术可能有助于阐明不同品种油茶树种子发育的差异。

本研究比较研究了不同品种‘花朔’和‘花金’果实发育过程中表型、营养成分、脂肪酸和油体的变化山茶花鉴定．对两种品种的种子进行RNA测序，以探讨脂肪酸生物合成途径中的差异表达基因。我们的目标是探讨两者之间的石油综合的机制和差异c .鉴定品种。同时，确定两个主栽品种间果实发育的差异，将为准确界定油茶树果实成熟期和选择适宜的品种奠定理论基础。

果实发育和形状指数

树体c .鉴定“华硕”是半开的，叶子是深绿色，扁平，果实扁圆形和黄褐色（图1A和B)相比之下，c .鉴定“华金”具有紧凑的树冠，深绿色的叶子具有丰富的光泽，果实为椭圆形的蒴果，果色翠绿色(如图。1故选Dc .鉴定“华金”比“华金”更成熟c .鉴定“Huashuo”基于较暗的种子的同一发展阶段（图。1e，f，g，h，i，j，k和l）。此外，'Huashuo'种子在10月份的“华金”种子显着不那么成熟（前者的种子涂层没有完全改变）（图。1H3）。基于横向直径和纵向直径的连续增加，油茶树果实的生长是显而易见的。'Huashuo'的果实具有相对较大的横向直径，而“华金”的纵向直径较大，这导致了他们不同的果实形状。此外，'Huashuo'的果实形状指数逐渐增加，这表明该水果主要沿水平轴水平地生长（表格1)．

果实发育表型性状

油茶树果实生长发育过程中，果实重(FW)、鲜粒重(FSW)、干粒重(DSW)、鲜粒重(FKW)和干粒重(DKW)增加，种子含水量(SWC)和籽粒含水量(KWC)降低。在FSW, DSW, FKW和DKWc .鉴定“华金”的比例明显高于中国c .鉴定7月份“华润”（分别为224.56,233.33,334.78和657.14％）。FSW和FKW在'Huashuo'中大于9月和10月份'华金'的FKW，但DSW和DKW'Huashuo'低于'Huajin'的DSW。这表明，与'Huajin'相比，“Huashuo”中的种子和种子核的干肿块含量较低。此外，'Huashuo'中的SWC和KWC始终高于每个给定时期'华金'的KWC。特别是，当水果几乎成熟时，与“华金”（分别）（分别为24.52和31.36％），SWC和KWC分别显着高于'Huajin'（P≤ 0.05) (Table2)．结果表明，在各个时期，‘华金’果实比‘华硕’果实成熟。

营养成分

在整个发育过程中，种子油含量（SOC）和种子核油含量（KOC）增加，而可溶性糖含量（SSC）和淀粉含量（SC）降低（图。2)．油已经在种子和籽粒中形成c .鉴定7月的“华金”，但无法提取c .鉴定在同一个月的'huashuo'。'huajin'的SoC和Koc显着高于'Huashuo'（P≤0.05)，(如10月份分别提高99.96和36.64%)。2A和B）。在“华锦”的KOC从八月同比增长216.81％，至九月，和“华硕”的那显著上升（P≤0.05）从9月到10月（图。2B)。SOC也观察到同样的趋势(图。2一种）。两种品种的SSC和SC在7月份高，随着时间的推移逐渐降低（图。2C和D)。8月，‘华津’的SSC下降了47.60%，‘华朔’的SSC显著下降(P≤ 0.05) in September (Fig.2C)。然而，对于这两个品种在SC的趋势是从七月SSC趋势九月倒数（图2D).此外，“华金”的SSC显著降低(P≤0.05)，除7月外，其余时间均高于华硕(图。2C)。

相对脂肪酸含量

我们测定了油茶树种子中6种脂肪酸:棕榈酸(PA)、硬脂酸(SA)、油酸(OA)、亚油酸(LOA)、亚麻酸(LA)和花生四烯酸(AA)。PA、SA和LA的相对含量在整个发育过程中呈下降趋势，OA和AA的相对含量呈上升趋势，LOA的相对含量呈波浪式下降趋势(图1)。3.)．PA和SA在c .鉴定“华金”在7月开始逐渐下降，而在c .鉴定8月份，《华硕》的销量有所下降。3.A和B)。9 - 10月‘华金’相对PA和LA含量变化不显著(P> 0.05)，而花朔9 - 10月分别下降54.31和86.70% (P≤0.05）（图。3.A和E)。此外，“华金”9月和10月的相对OA含量差异不显著(P> 0.05)，而‘华硕’9 - 10月增加了64.89% (P≤0.05）（图。3.C)。从8月到10月的趋势相对LOA内容为'Huashuo'密切镜面，为7月至9月的“华金”（图。3.D).我们在7月和8月未能检测到‘华硕’种子中的AA，且两个品种间的相对AA含量没有显著差异(P>(图0.05)。3.F).两个品种油茶树种子中OA含量在10月最高，油分积累速率在7月和10月增加最多(图2)。3.C)。

观察油体

油体从整个种子发育的血浆膜逐渐形成，并在细胞内涂布，直至整个细胞几乎填充有油（图。4和5)．里面没有油体c .鉴定'Huashuo'种子胚乳细胞7月，但在c .鉴定‘华金’种子胚乳细胞中含有一层油体，分布在质膜附近。4A1 A2 A3还有5A1和B1)。从8月开始，花朔种子胚乳细胞开始出现少量油体。4B1 B2和B35A2)。此外，‘华金’种子胚乳细胞中的油体始终比‘华硕’更明显。4和5)．油体在10月份填充了“华金”的整个种子胚乳细胞，而“华沙”种子胚乳细胞含有较少的油体（图。4D1，D2和D3和5A4和B4)。

DEG和GO功能诠释

总共5547个DEGS鉴定组A1和B1之间，包括2315上调的基因和3232下调的基因。总共5499个DEGS鉴定A2和B2之间，包括3551上调的基因和1948下调的基因。总共有3164度的视角进行鉴定A3和B3之间，其中包括1869上调的基因和1,295下调基因。总共1314个DEGS鉴定A4和B4之间，包括618上调的基因和696下调的基因（图6A).我们用维恩图来总结四组不同集合之间的deg数，我们发现四组共有249个deg(图2)。6b）。此外，基于GO功能注释，我们发现，与该DEGS 20个生物过程可能becategorized分为三组：生物过程，细胞组分和分子功能。生物过程类别内前三名的GO术语是代谢过程，细胞过程和单生物体过程。内的细胞成分类别，三甲词条膜，细胞和细胞部分，并在分子功能类别，三甲词条的催化活性，结合和转运蛋白活性（图6C)。

与脂肪酸生物合成途径相关的DEGs分类

对于脂肪酸生物合成（KO 00061）途径，相关度的视角可基于14个KEGG注解（ACACC，ACCA，ACCB，ACCC，FabD，的FabH，FabF，FabG，FABI，FabZ，FAB2，FATA，FATB和FADD分类)．共有26个，10个，6个和3个基因的A1-B1，A2-B2，A3-B3和A4-B4分别套富集。以确定在26个脂肪酸生物合成基因的表达的两个品种之间的差异，表达水平使用日志分析₂（FPKM）价值。日志₂（A1-B1）\（\ ge \）1表明基因上调;-1 < log₂(A1-B1) < 1表示表达差异不显著;和日志₂（A1-B1）\（\ Le \）-1表明该基因被下调。19月份在7月下调，占脂肪酸生物合成（KO 00061）途径的73.08％占所有参数的73.08％，并且所有DEG的表达均有显着差异。下调的次数的表达逐渐降低，并且具有非显着差异的次数逐渐增加。10月份下调的果酒的数量降至零，而具有微不足道的差异的差异升至23次，占脂肪酸生物合成（KO 00061）途径所有参数的88.46％（表3.)．

为了更好地理解c .鉴定“华晋”和c .鉴定“Huashuo”就脂肪酸生物合成而言，将不同发育阶段的基因表达数据组合到网络中。在7月份“华金”的表达水平比“华润”更高于“华金”。随着果实所发育的，两种品种种子中，这些次数（Fabf-2，Fab2-1和Fatb除外）的表达水平逐渐接近相似的水平。大多数Degs（57.69％）在10月份最高级别表达。在addition, most DEGs (65.38%) in ‘Huajin’ were expressed at high levels in July (the average expression level was 100% higher than in ‘Huashuo’), whereas in ‘Huashuo’, the expression levels of the DEGs increased by 50% from July to August (Fig.7)．

种皮颜色的变化是油茶树果实发育的一个重要表型特征。种皮开始变黑，表明果实开始成熟，完全黑色的种皮表明果实已经完全成熟[20.］．此外，成熟前的果实的体积和重量表示生长状态，并且可以通过水果的横向和纵向直径来确定体积[40］．我们发现，毛色c .鉴定‘华金’种子的颜色总是比‘华金’种子的颜色深c .鉴定在每个给定的发展时期的'Huashuo'，“华金”水果的横向直径，纵向直径和重量明显高于7月“华摩”。相反，以前的研究表明，完全成熟的'华罗'果实的体积和重量远远超过了“华金”[14，15］．此外，“华金”的SWC始终低于“华朔”。霜降期间(每年10月23日至24日)“华朔”的SWC高达60.38%，高于以往研究的报道[20.］．种子的峰值干重是生理成熟的指标[18］．脱水阶段是当种子发生成饱和度时，并且水分含量降低伴随着干物质的积累，导致粒度粒子[41，42，43］．由此可见，‘华金’果实在一定的发育时期内更加成熟，‘华硕’果实在霜降期(每年10月23-24日)的表型特征与成熟油茶树果实的表型特征不一致。此外，果实重增长最快的时期是最高温度和光照持续时间最长的时期，表明较高的温度和较长的光照可能有利于油茶树果实的发育。主要原因是山茶花鉴定在膨胀阶段需要更多的营养物质和碳水化合物，并认为光合效率的提高山茶花鉴定在夏季，由于光照时间长，CO₂形成水果生长所需的碳水化合物同时，维持在30℃左右的温度对光合作用最有利。

以前的研究表明，种子早期发育阶段的其他植物的可溶性糖和淀粉含量较高，并随种子发育和油合成逐渐降解[24，25，44.］．本研究的结果与那些珍贵的发现一致。这可能是由于果实开发和石油合成消耗了大量的碳水化合物[20.］．就油茶树的经济价值而言，油是油茶树种子中最重要的营养成分[45.，46.，47.］．在细胞油体的面积具有正在种子中的油含量[相关28，29，30.］．我们无法探测到石油或油体c .鉴定'Huashuo'种子于7月，这类似于以前的研究[36］．这说明在7月前，花朔果实没有油体合成。结果表明，种子胚乳细胞中油分和油体的含量均高于胚乳细胞c .鉴定在特定的发展时期，“华金”总是比“华朔”更引人注目。此外，在霜降期间(每年10月23日至24日)，种子含油量已经与以前的研究报告相似[17］．然而，我们在7月份发现“华硕”种子含有5种脂肪酸。这表明，种子的含油量可能低于我们的检测方法的检测限度。种皮也可能含有微量的油[48.］．此外，AA的内容不能在7月或8月在'Huashuo'中衡量。以前的研究表明，通常可以在油茶树种子发展中阶段测量AA [20.，39，49.，50.］．这些结果与霜降期(每年10月23日至24日)“华金”果实比“华硕”果实成熟的观测结果一致。

油主要以三酰甘油的形式储存在油茶树种子中，三酰甘油由一分子甘油和三分子脂肪酸组成[23，51.］．宝等人。[52.表明脂肪酸含量限制了胚胎发育过程中脂肪的积累。因此，脂肪酸的生物合成是决定植物油含量的重要因素。前人研究表明，accA (acetyl-CoA carboxylase carboxylase subunit alpha)、accB (acetyl-CoA carboxylase biotin carboxylase carrier protein of acetyl-CoA carboxylase)和accC (biotin carboxylase)的表达增加可能会增加脂肪酸和油脂的合成[53.]，通过反义表达估计成熟油菜籽粒含油量显著低于野生型籽粒[54.］．此外，增加的FADD（长链酰基-COA合成酶）表达有利于种子中的脂肪酸合成和油含量增加[55.]和FADD的表达模式紧密相似地在显影种子中脂质积累曲线[56.］．此外，FabD(丙二酰辅酶a:FabH(酮酰基-ACP合酶III)， FabF(3-氧酰基-[酰基载体蛋白]合酶)，FabZ(3-羟基酰基-[酰基载体蛋白]脱水酶)，FabI(烯酰-[酰基载体蛋白]还原酶)，FAB2(硬脂酰-[酰基载体蛋白]9-去饱和酶)和FATA(油酰-酰基载体蛋白硫酯酶)在以前的研究中被证实催化脂肪酸生物合成[57.，58.，59.，60.，61.，62.］．本研究结果表明，大多数次数的表达水平（包括ACCA，ACCB-1，ACCB-2，ACC，FAN-1，Fabh-2，Fabd，Fabf-1，Fabf-3，Fabz，Fabi，Fab2-1，fab2-3，fab2-4，fab2-5和fadd-1）较高c .鉴定“华锦”比c .鉴定7月份“Huashuo”。8月在‘华朔’中表达量增加，10月在两个品种中均有高表达。这一结果与“华烁”籽粒7月份不产生脂质，原因是脂肪酸生物合成基因的低表达。因此，在特定的发展时期内，“华硕”的成熟度落后于“华金”。此外，Wu等人[39]发现FATB的下调表达和SAD上调表达均于种子中的油酸合成，这与我们的研究结果一致，是有益的。FATB的低表达和FAB2-1，FAB2-3和FAB2-5的较高表达（FAB2是充分表征的SAD [63.]）在油中的合成的早期阶段可能会导致更高的油酸在“华锦”的种子，这可能是“华锦”的早期发展的原因。

我们的结果清楚地表明了c .鉴定‘华硕’果实成熟较慢c .鉴定'华金'水果。“华金”的种子于7月进入石油综合期，而“华沙”则为八月这样做。此外，“华金”的水果可能已经被弗罗斯特的下降期（每年10月23日至24日）成熟，而“华润”水果又没有完全成熟。但是，考虑到气候条件对水果发展的影响不明朗，它尚不清楚'华金的成熟是先进还是延迟，因此可能需要进一步的研究。

植物材料

不同的发展时期的果实c .鉴定在中国湖南省长沙林业和科技大学的油茶树实验策划中收集了“华曲”和“华金”。实验情节是湖南省长沙市长城区东城镇（113°21'e，28°05'n）。在表S1中显示了气候条件（附加文件1）。六十棵树（每棵品种，10岁的每棵树）没有疾病和昆虫感染，患有痛苦，生长良好，并显示出类似的生长潜力。该研究于2019年7月至2019年10月进行了。7月20日，9月20日和10月24日（Frost的下降期）是从树木（高度是一致的）的四个方向（高度是一致的）中的样品。从每种品种的每个发育阶段收集六十水果。将种子立即从水果中取出（每种品种，随机选择的果实），并均匀混合并分成三个部分并用液氮冷冻。其他水果储存在冰箱中，以保持新鲜。返回实验室后，将液氮冷冻样品储存在-80℃，储存在冰箱中的样品储存在-4℃。

随机选择十五个新鲜水果以观察和测量形状指数。这些水果分为5组（每组三个水果，随机分配）测量果实发育表型特征。将十五个新鲜水果从剩余的水果中随机选择，将它们的种子置于烘箱中（在105℃下停用15分钟并在除去果皮后在70℃下烘烤72小时。使用小型研磨机来压碎干燥的种子，然后将其储存在凉爽的干燥处，用于背衬实验（营养含量和脂肪酸测量）。将剩余的新鲜水果储存在4°C的冰箱中，以进行背衬实验（油体观察）。

水果观察和形状指数

用相机(佳能，日本)拍摄新鲜水果，观察它们的形状和横截面以及种子。用游标卡尺测量鲜果的横向和纵向直径，计算果实形状指数:果实形状指数=横向直径/纵向直径。本工作中所有形状指标数据均以15个生物重复的平均值±标准误差(SE)表示。

果实发育表型性状

采用电子天平测量新鲜果实重(FW)、新鲜种子重(FSW)和新鲜籽粒重(FKW)。然后将果实各部分放入烤箱烘干(105℃失活15分钟，70℃烘烤72小时)，用电子天平测量干粒重(DSW)和干粒重(DKW)。种子含水率(SWC)和籽粒含水率(KWC)的计算公式为:SWC (%) = (FSW - DSW) / FSW × 100%， KWC (%) = (FKW - DKW) / FKW × 100%。本研究中所有果实发育表型性状的数据均以5个生物学重复的平均值±SE表示。

营养成分

使用蒽乙酸乙酯方法测定可溶性糖含量（SSC）和淀粉含量（SC）[64.，65.］．种子样品0.1 g，用80% (v / v)乙醇在80℃下提取30 min，然后在3500 r·min下离心⁻¹提取10 min，再用80%乙醇重复提取2次，然后将3种上清液混合，加入80%乙醇，总体积为25 mL，去除乙醇后与2 mL蒸馏水混合。100℃孵育15 min，淀粉分别加入9.2 mol·L水解⁻¹和4.6摩尔·L⁻¹样品中加入HClO4。提取液在4000 r·min离心⁻¹10分钟，洗涤沉淀物两次。将上清液合并以占50mL的总体积。通过在波长A630nm的波长下分光光度法测定SSC和SCs。总SSC（C_SSC)和SC (C_SC)，用葡萄糖绘制标准曲线。计算SSC和SC: SSC (%) = [C_SSC × extraction volume (mL) × dilution factor] / [sample weight (g) × sample volume drawn during measurement (mL) × 10⁶]×100％，sc（％）= [c_SC × extraction volume (mL) × dilution factor × 0.9] / [sample weight (g) × sample volume drawn during measurement (mL) × 10⁶)×100%。采用索氏提取法测定种子含油量(SOC)和籽粒含油量(KOC) [66.］．本研究中所有养分含量数据均以三个生物重复的平均值±SE表示。

脂肪酸

脂肪酸含量的测定是按照中国国家食品安全标准《食品中脂肪酸的测定》的指引进行的[67.］．将碾碎的种子样品(0.1 g)称重放入带塞子的试管中，加入1ml NaOH-CH_3.在样品中加入OH(5%)和1ml正庚烷。用塞子盖住试管，剧烈摇晃3分钟，50℃加热2分钟，使其澄清。然后加入10 μL乙酸，用力摇试管使氢氧化钠中和。最后用100 μl的上层溶液进行色谱分析。使用气相色谱法分析脂肪酸(Shimadzu GC-2014，岛津，京都，日本)。参数如下:FID检测器温度，220℃;色谱柱:30 m × 0.25 mm × 0.25 μm (Agilent DB-WAX, California, USA);载气、氮;分流比20:1;进样量，1 μL; heating process, 170 °C (5 min), and 220 °C (10 °C /min, stay for 10 min). Fatty acids relative content was then calculated as follows: fatty acids relative content (%) = (fatty acid methyl esters peak area × conversion coefficient of fatty acid methyl esters to fatty acids) / (sum of peak areas of all fatty acid methyl esters × conversion coefficient of fatty acid methyl esters to fatty acids). All fatty acid content data in this work are presented as the mean ± SE of three biological replicates.

油体观察

我们使用了两种不同的方法来种仁内观察油体。第一种方法是激光扫描共聚焦显微镜[68.，69.］．新鲜种子仁切成2毫米^3.切片，用冷冻切片机(德国徕卡)切片(15 μm)，用尼罗红染色5分钟，然后在激光扫描共聚焦显微镜(德国徕卡)下成像。第二种观察方法是透射电子显微镜[9，70］．新鲜种子仁切成1毫米^3.在4℃下为2.5％戊二醛溶液固定在2.5％戊二醛溶液中。洗涤三次后（每次15分钟），将组织在室温下以1％锇氧化锇固定5小时，并在梯度系列乙醇溶液中脱水（30％，50％，70％，80％，90％，90％，95％，100％，100％;每次1小时）。接下来，将样品浸泡在一系列丙酮溶液中（25％，50％，75％，100％，100％，无水乙醇构型;每次30分钟）。然后将种子核样品嵌入环氧树脂中，置于离子溅射涂布机中并镀金20分钟。半细长。使用超微摩尔（EM UC7，Leica）用金刚石刀切割（0.5μm），然后安装在铜网上并使用甲苯胺蓝色染色。使用透射电子显微镜（HT7700，日本HT7700，日本）进行成像。

RNA测序和RNA制备取样

油茶树果实在4个月内开发的开发，并选择了新鲜的种子用于分子测序分析。样品被命名为a1（c .鉴定'华金的种子于7月），B1（c .鉴定7月的“华硕”种子)，A2 (c .鉴定在八月“华锦”种子），B2（c .鉴定8月“华硕”种子)，A3 (c .鉴定9月‘华金’种子)、B3 (c .鉴定'Huashuo'种子在9月份），A4（c .鉴定'华金的种子于10月），和B4（c .鉴定10月份的“华沙”种子）。选择每个治疗的样品。将总24个样品在液氮中快速冷冻并储存在-80℃。使用琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 2500仪器（Thermo Fisher Scientific，USA）评估RNA样品的纯度，浓度和完整性，以确保它们适用于转录体测序[4，31］．

图书馆准备和RNA-seq的

RNA样品送至上海生物医学明治科技有限公司（上海，中国），那里的图书馆制作和测序。RNA-SEQ转录文库与来自Illumina公司使用1微克的总RNA的TruSeq™RNA样品制备试剂盒（USA）制备。不久，此后，mRNA的使用具有寡（dT）珠的多聚A选择方法分离，并用破碎缓冲分段。双链cDNA是使用的SuperScript双链cDNA合成试剂盒（Invitrogen，USA）用随机六聚体引物（Illumina公司）合成。然后将合成的cDNA根据Illumina的文库构建协议进行末端修复，磷酸化和“A”的碱加成。文库在2％低范围超琼脂糖，随后使用Phusion DNA聚合酶（NEB）15个PCR循环聚合酶链反应（PCR）扩增选择200-300个碱基对的cDNA靶片段大小。一个fter quantification by TBS380, paired-end RNA-seq libraries were sequenced with the Illumina HiSeq xten/NovaSeq 6000 Sequencer (2 × 150 bp read length).

差异表达分析和功能富集

为了鉴定样品间的差异表达基因(DEGs)，采用外显子千碱基/百万图reads (FPKM)法计算每个转录本的表达水平。RNA-Seq (RSEM) (http://deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/） [71.]用于定量基因转录物丰度。将R包轧边机（在R数字基因表达的实证研究（http://www.bioconductor.org/packages/2.12/bioc/html/edgeR.html） [72.]进行差异表达分析。通过功能富集分析，包括基因本体论(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)分析，确定哪些GO术语和代谢途径对bonferroni校正的deg显著富集P -与全转录组背景相比，值≤0.05。GO功能富集和KEGG通路分析使用Goatools (https://github.com/tanghaibao/Goatools）和KOBAS（http://kobas.cbi.pku.edu.cn/home.do.） [73.］．

统计分析

数据使用Microsoft Office Excel 2013进行处理。采用SPSS 19.0软件进行显著性差异检验。采用单因素方差分析和邓肯多范围检验比较治疗方法P -值≤0.05表示差异显著。转录组数据分析使用免费在线Majorbio云平台(www.majorbio.com)．

在当前研究期间生成和/或分析的序列数据集可在NCBI存储库中获得，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA693152．目前的研究过程中使用和/或分析的其他数据集可从上合理请求相应的作者。

弗兰克-威廉姆斯:

水果的重量

焊:

新鲜种子重量

DSW:下手

干种子重量

FKW:

鲜粒重

DKW:

干种子千粒重

SWC:

种子含水量

kwc：

籽粒含水量

SOC:

种子含油量

koc：

种子核油含量

SSC：

可溶性糖含量

SC：

淀粉含量

PA:

棕榈酸

山:

硬脂酸

办公自动化:

油酸

贷款:

亚油酸

洛杉矶：

亚麻酸

AA:

花生四烯酸

可见：

差异表达基因

走:

基因本体论

KEGG:

京都基因和基因组百科全书

我们感谢上海明治生物医药科技有限公司（上海，中国）因其在RNA-Seq的和转录组分析服务。我们感谢Textcheck（美国佛罗里达州）因其在语言帮助服务。我们感谢志明刘博士（东新墨西哥大学，美国）和曹和平博士（农业的美国能源部，美国），他们在修订稿援助。

这项工作得到了湖南省科技项目的主要项目（2018NK1030）。资助者在研究设计，数据收集和分析中没有作用，决定发布或准备稿件。

从属关系

1. 栽培重点实验室和保护非木材林产品的树木，教育部，林业科技中南大学，长沙，410004湖南，中国

   张帆航，李泽，周俊琴，顾益阳，谭晓峰

2. 梨工程技术研究，南京农业大学作物遗传学和种质增强国家重点实验室，南京，210095，中国江苏

   Fanhang张

3. 南方丘陵山区生态非木质林业湖南省林业科技中南大学产业，长沙，410004湖南，中国的工程技术研究中心

   李泽，周俊琴，顾益阳，谭晓峰

贡献

F.Z.，Z.L.和X.T.设计了整个实验。X.T.，F.Z.和Y.G.准备植物材料并收集样品。F.Z.和J.Z.分析了结果。F.Z. and Z.L. wrote the main manuscript text. All authors have read and approved the manuscript.

相应的作者

对应到泽李或现任谭．

伦理批准和同意参与

作者证实了对植物的实验研究，包括植物材料的收集，遵守机构，国家或国际指南。田间研究是根据当地立法进行的。作者遵守了“濒危野生动物群和植物群”贸易公约：https://www.cites.org/．

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

作者声明他们对这项工作没有利益冲突。

出版商的注意事项

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。

开放获取本文根据创意公约归因于4.0国际许可证，这允许在任何中或格式中使用，共享，适应，分发和复制，只要您向原始作者和来源提供适当的信贷，提供了一个链接到Creative Commons许可证，并指出是否进行了更改。除非信用额度另有说明，否则本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创造性公共许可证中，除非信用额度另有说明。如果物品不包含在物品的创造性的公共许可证中，法定规定不允许您的预期用途或超过允许使用，您需要直接从版权所有者获得许可。要查看本许可证的副本，请访问http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/．创作共用及公共领域专用豁免书(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/）适用于本文中提供的数据，除非另有用入数据的信用额度。

重印和权限