全基因组调查和表达分析丁蛋白（NLP.)基因揭示了其在番茄对硝酸盐信号应答中的潜在作用

背景

番茄 （Solanum lycopersicum）是最重要的园艺作物之一，具有硝酸盐作为无机氮源的显着偏好。硝酸盐摄取和同化的分子机制在番茄中尚未理解。氮样蛋白（NLPS）是保守的，植物特异性转录因子，其在硝酸盐信号中起关键的作用。

结果

在这项研究中，全基因组分析确定了6个NLP.番茄基因组的成员。这些成员在系统发育树中聚集成三个曲囊。比较基因组分析表明SLNLP.基因表现出共线关系NLP.拟南芥，油菜，玉米和米饭，并扩大了SLNLP.家庭主要由番茄基因组中的节段性重复引发。组织特异性表达分析表明，一个密切的同源物之一AtNLP6/7，SLNLP3.在幼苗和开花阶段，在根中强烈表达，即SLNLP4.和SLNLP6.在茎和叶中表现出优先表达SLNLP6.在水果中以高水平表达。此外，番茄根中的硝酸盐吸收和表达模式SLNLP.在缺氮和硝酸盐补充条件下测定基因。四个SLNLPS.，SLNLP1.，SLNLP2.，SLNLP4.和SLNLP6.，在缺氮后上调。和SLNLP1.和SLNLP5通过硝酸盐迅速且时间诱导。

结论

这些结果提供了重要的见解，以了解潜在的多种功能SLNLPS.来调节硝酸盐的摄入

氮气（N）是植物的必需常规营养素，用作氨基酸，核苷酸，叶绿素，激素和辅酶的组分。植物的生长和发展取决于适当的氮气供应。农业领域的N的可用性显着影响作物产量[26.］．植物从土壤中吸收无机氮主要有两种形式，硝酸盐(NO_3.^-）和铵（nh₄⁺）.在温和的气候条件下，硝酸盐是旱地氮的主要来源[10.］．土壤中硝酸盐的浓度波动在10μm和100mm之间[7］．维持蓬勃的增长，高亲和力和低亲和力（K_米植物已经进化出能有效地从环境中吸收硝酸盐的转运系统。硝酸盐也是侧根发育、开花和其他营养物质协同吸收的重要信号分子[31.］．

在硝酸盐信号转导中，nin样蛋白(nlp)是必不可少的转录因子[20.］．据报道，营养 - 加利福尼亚州²⁺-NLP调节途径在硝酸盐信号中起着核心作用，并在植物中整合转录，运输，代谢和全身增长计划[4，23.，25.］．在拟南芥，硝酸盐转运蛋白1.1（NPF6.3 / NRT1.1）已鉴定为浆液膜的硝酸盐传感器[16.］．在存在硝酸盐中，依赖钙依赖性蛋白激酶10/30/32（CPK10 / 30/32）介相CA²⁺硝酸盐和磷酸化NLP6/7的信号，以确保它们在核中的位置，为主要硝酸盐反应基因的转录激活[23.］．

NIN蛋白最早在豆科植物中发现莲花japonicus.，对共生根瘤的形成起调节作用[29.］．NIN蛋白和nlp在其他非豆科植物中广泛存在拟南芥、大米、小麦和玉米，但在动物中没有[21.，27.，30.，33.］．NIN蛋白和NLPs都有一个RWP-RK结构域用于DNA结合;nlp携带一个额外的蛋白-蛋白相互作用PB1域[5］．nlp与其他转录因子如硝酸盐调控基因2 (NRG2)的相互作用[34.]，PCF（TCP）-Domain家族蛋白20（TCP20）[14.]和硝酸盐诱导garp型转录抑制因子1 (NIGT1) [24.的报道。除了硝酸盐信号，nlp在N饥饿反应中的额外功能[14.]、N与磷酸盐(P)相互作用[24.，硝酸盐促进种子萌发[35.]、依赖硝酸盐的结核共生[28.]和根冠细胞释放[19.已被澄清。

作为最重要的作物之一，番茄（Solanum lycopersicum)表现出对硝酸盐作为无机氮源的明显偏好[8］．

本研究对番茄进行了比较生物信息学分析NLP.基因。此外，根系对硝酸盐的吸收速率和表达SLNLP.通过检测缺氮和硝态氮补充条件下的基因，探讨其在根系硝酸盐吸收调控中的作用。

的识别NLP.基因在番茄

总共六NLP.基于保守的RWP-RK（HMM，PF02042）和PB1结构域（HMM，PF00564）的存在，从番茄基因组中鉴定基因。用于的命名法SLNLP.基因是基于它们在染色体上的分布1）.编码的氨基酸的数量SLNLP.基因范围从841 (SLNLP1.）至1611（SLNLP5）.相对分子量(Mw)介于93.30 kDa (SlNLP1)和180.95 kDa (SlNLP5)之间。所有SlNLP蛋白都有一个接近中性(5.30-7.35)的等电点，并且亲水性较低(GRAVY值为−0.524 ~−0.327)。所有6个SlNLPs的亚细胞定位都在细胞核/细胞质中。

保守的主题和系统发育分析SLNLP.蛋白质

根据之前的研究，拟南芥NLP蛋白被分为三个分支[30.］．为了分析番茄NLP蛋白的进化关系，我们将番茄NLP的氨基酸序列与其他4种植物的NLP进行了比较，构建了一个邻接系统发生树，其中包括2种双子叶植物(拟南芥和两种单子叶植物(水稻和玉米)(补充表1）.结果（图。1A)进化枝I包含17个NLP成员，包括AtNLP1/2/3/4/5和SlNLP1/2。进化枝II包含17个NLP成员，包括AtNLP6/7和SlNLP3/5。进化枝III包含31个NLP成员，包括AtNLP8/9和SlNLP4/6。双子叶和单子叶的成员均存在于各枝中，表明该基因的扩展NLP.基因家族出现在单子叶植物和双子叶植物分化之前。多序列比对(图。1B和C)揭示了所有的SlNLP蛋白具有相似的motif模式，包括保守的RWP-RK结构域和PB1结构域。有趣的是，SlNLP5蛋白似乎携带两个RWP-RK结构域和PB1结构域。

染色体分布及共线分析SLNLP.基因

六个SLNLP.基因在番茄基因组中分布不均匀。2）.SLNLP3.，SLNLP4.和SLNLP5在8号染色体上被鉴定。其他三个SLNLP.基因，SLNLP1.，SLNLP2.和SLNLP6.在染色体1,4和11上鉴定基因。中间瘤组合关系SLNLP.基因显示两对片段重复(SLNLP1.和SLNLP2.，SLNLP3.和SLNLP5），表明番茄NLP.基因主要通过基因重复在进化期间产生。

此外，还建立了番茄与拟南芥分别构建油菜、水稻和玉米，分析其系统发育机制SLNLPS.(无花果。3.）.番茄SLNLP.基因显示与油菜籽共10对，与油菜籽共8对拟南芥，5和玉米和3种米饭。大多数背景共线块与NLP.番茄与双子叶植物的基因对鉴定拟南芥/油菜含有比番茄和单子叶米饭/玉米（补充表2）.SLNLP1.，SLNLP2.和SLNLP5这些同源对可能在单子叶植物和双子叶植物进化分化之前就已经存在。此外，这三个基因可能在NLP.基因家族。同时计算非同义替换(Ka)与同义替换(Ks)的比值，表示作用于编码序列的选择类型(Supplementary Table)2）.两个SLNLP.基因对,SLNLP1.和SLNLP2.，以及SLNLP3.和SLNLP5，分别为ka / ks比率为1.01和1.46，表明在重复后发生的功能分歧过程中的阳性选择。大部分的直言不讳NLP.基因对的Ka/Ks比值小于1(范围为0.10 ~ 0.96)，表明在净化过程中存在选择性压力NLP.这些基因的基因家族演化与保守功能。三个直字基因对，SLNLP1.和AtNLP5，SLNLP2.和BnaNLP4-4，SLNLP1.和zmnlp1.，具有大于1的KA / KS比例，表明这些基因经过阳性选择压力，可能已经进化了新功能，以帮助植物应对他们的生活环境。

器官依赖表达SLNLPS.

为了获得生理功能的证据，组织特异性转录性六个SLNLP.通过qRT-PCR分析不同发育阶段的基因。4）.SLNLP1.根中表达量设为1，比较表达量SLNLPS.．在幼苗和开花阶段，SLNLP2.和SLNLP3.在根中优先表达(图。4A和B)。SLNLP2.和SLNLP3.苗期根系转录因子丰度最高(图2)。4一种）。开花时，SLNLP3.仍然在根中展示了最高的丰富，其次是SLNLP2.和SLNLP6.(无花果。4b）。在红色水果中，所有的成绩单都是丰富的SLNLP.基因水平相对较高。有趣的是，SLNLP6.开花后各组织转录产物积累均增加。特别是，明显更高SLNLP6.在果实中观察到表达（图。4b）。

的表达SLNLPS.对缺氮的反应

番茄根系对硝态氮的吸收受到2 d缺氮处理的影响^15.不_3.^-不同处理后的内流分析(图。5A).结果表明，缺氮处理提高了根系对硝酸盐的高亲和吸收能力，而抑制了根系对硝酸盐的低亲和吸收能力。为了解SlNLPs在缺氮时调控根系硝酸盐吸收的可能作用，研究了SlNLPs的转录丰度SLNLP.在饥饿处理后QRT-PCR检查根中的基因（图。6）.表达SLNLP1，SLNLP2，SLNLP4和SLNLP6.在氮饥饿后，分别上调6.2-，3.1-17-和1.5倍。

Nitrate-dependent表达SLNLPS.和氮代谢基因

当硝酸盐重新扫描到氮饥饿的幼苗时，增强了根高亲和力和低亲和力硝酸盐摄取率，如结果所示^15.不_3.^-涌入化验(无花果。5b）。表达水平SLNLPS.在硝酸盐诱导过程中，在0.5,1和2小时内检查根中的氮代谢基因。结果（图。7A)表明转录本丰度SLNLP1.和SLNLP5响应硝酸盐迅速且时间迅速增加。SLNLP1.和SLNLP5添加硝酸盐0.5 h后，表达量达到最大值(分别增加了4.1倍和2.8倍)。表达SLNLP2.和SLNLP4.在硝酸盐再补给1小时后显着压抑。相比之下，SLNLP3.和SLNLP6.在转录水平上没有显示对硝酸盐的任何反应。硝酸盐转运蛋白和硝酸盐同化基因的转录物丰度在图2中示出。7B.高亲和性硝酸盐转运体基因的表达SLNRT2.1.，SLNRT2.2.和SlNRT2.3，以及硝酸盐还原酶基因SLNR.亚硝酸盐还原酶基因SlNiR1和SlNiR2在暴露于硝酸盐的前30分钟内迅速而剧烈地增加，并保持在很高的水平。低亲和性硝酸盐转运体基因的表达水平SlNRT1.2在硝酸盐再补给后0.5 h增加了2倍，在1和2 h进一步增加超过4倍。SlNRT1.1硝酸盐再补给后1 h，其含量暂时增加了1.6倍。谷氨酰胺合成酶基因无mRNA表达变化SLG在2 h硝酸盐诱导期检测。预测了SlNLP蛋白的蛋白相互作用网络(补充图)1）.SlNLP3、SlNLP4、SlNLP5和SlNLP6与硝酸还原酶SlNR存在潜在的相互作用。SlNLP3和SlNLP5还与亚硝酸盐还原酶SlNiR1和SlNiR2有潜在的相互作用，这表明它们在硝酸盐反应中起核心作用。SlNLP1和SlNLP2与转录因子GRAS16表现出主要的相互作用，表明它们可能是与植物发育相关的调控因子。

在本研究中，全基因组分析揭示了6个番茄nlp（桌子1）.的NLP.家庭规模的Solanum lycopersicum类似于拟南芥蒂利亚纳（9），栽培稻(5)和玉米（9），小得多芸苔属植物显著(31)。系统发育分析表明，每一种NLP.家庭有属于三组的成员（图。1A).所有SlNLPs都具有保守的RWP-RK和PB1结构域。SlNLP5是RWP-RK和PB1双结构域的专用结构域。1答案:BNLP.基因家族主要受到基因组中的基因重复产生的（图。2）.与...相关的直言基因对SlNLP1, SlNLP2要么SLNLP5表明在双子叶植物和单子叶植物的祖传分歧之前存在（图。3.）.值得注意的是，两个拟合方程的Ka/Ks比值SLNLP.基因对（SLNLP1.和SLNLP2.，SLNLP3.和SLNLP5)和三种同源NLP.基因对（SLNLP1.和AtNLP5，SLNLP2.和BnaNLP4-4，SLNLP1.和zmnlp1.)均大于1(补充表2)，代表了这些SlNLPs在蛋白水平上的正向选择和快速进化速率。因此，这意味着nlp番茄可能已经进化出一些新的功能，以满足其生长发育的需要。

组织依赖性表达模式显示，6SLNLP.基因在包括根、茎、叶、花和果实在内的所有组织中都有表达。4），类似于nlp在拟南芥[5，玉米(Ge等)[13.]） 和芸苔属植物显著［5］．SLNLP3.的近亲之一AtNLP6/7(无花果。1A)，硝酸盐信号的关键成分[23.]的表达量在苗期和开花期均最高。除了SLNLP3.，SLNLP2.和SLNLP6.在不同发育阶段的根中也有高水平的表达，这表明它们在硝酸盐吸收调节方面具有不同的功能，而不是简单的功能冗余。两个SLNLPS.从进化枝三世,SLNLP4.和SLNLP6.开花时，它们的转录丰度显著上调，表明它们可能通过调节氮的转运和同化来支持花和果实的发育。相比SLNLP4.，SLNLP6.在根和地上组织中有较高的转录本丰度。此外,SLNLP6.表达出的表达水平高于其他五个SLNLPS.在水果中（图。4b）。有趣的是，SINLP6在共时态分析中也显示出其独特性NLP.基因(图。2）.亲密的同源物SLNLP6.是AtNLP8(无花果。1A). AtNLP8已被报道为硝酸盐促进种子萌发的主调控因子[35.，这可能为功能角色提供一些提示SLNLP6.在水果中．

nlp作为转录水平的基本调控元件之一，在硝酸盐吸收和同化调控中发挥重要作用[11.，15.］．在拟南芥，nlp7突变体显示出缺氮植物的特征[4),AtNLP7过度表达在氮气贫困和氮气条件下增加植物生物质（Yu等人．［36.]）。米饭的表达nlp（osnlp1.，osnlp4.和osnlp5.)是由缺氮和硝态氮供应促进的[18.］．过度的osnlp1.可以提高水稻氮利用效率[2］．对于番茄，硝酸盐是一种更有利的无机氮源形式。番茄根中的硝酸盐摄取是在精确的调节下，氮气之间的复杂相互作用和磷酸盐和/或钾可用性之间的相互作用[31.］．当环境氮源耗尽时，根系低亲和硝酸盐流入速率降低，而高亲和硝酸盐流入速率增加(图2)。5一种）。已经报道了类似的结果：在含有5mm硝酸盐的营养溶液中生长的西红柿中检测到较高的硝酸盐流入，而不是在含有0.1mM硝酸盐的营养溶液中生长的西红柿中的营养溶液[1］．向缺氮的番茄幼苗补充硝酸盐后，根系对硝酸盐的低亲和性和高亲和性吸收都增加了(图2)。5b）。问题是，一些SLNLPS是否在氮饥饿和/或硝酸盐诱导期间发挥氮吸收调节的重要作用。

要回答这个问题，需要大量的文字记录SLNLPS.在缺氮条件下，根系中有明显的差异(图。6）和硝酸盐再补给（图。7一种）。大多数SLNLPS.（SLNLP1，SLNLP2，SLNLP4和SLNLP6.)在缺氮2 d后表达上调。当补充硝酸盐时SLNLP2.和SLNLP4.是压抑的,但SLNLP1.仍然迅速上调。SLNLP3，在幼苗和开花阶段，在根中显示出最高表达水平（图。4)，与硝酸盐还原酶和亚硝酸盐还原酶有潜在的相互作用(补充图1）.这些结果暗示了SlNLP3在硝酸盐反应中的核心作用。然而,SLNLP3.在转录水平上对硝酸盐没有任何反应(图。7的另一个相似的同系物AtNLP6/7，SLNLP5，对氮饥饿表现出很少的转录反应，但被硝酸盐迅速和短暂地诱导。值得注意的是，AtNLP6/7不是在转录水平上响应硝酸盐信号[23.］．在番茄中也可能存在类似的情况。因此，需要检测SlNLPs的蛋白水平和蛋白修饰(包括磷酸化)。研究SlNLP3如何参与氮缺乏反应和/或硝酸盐信号通路是未来研究的热点。

总之，本研究提供了一个全基因组分析NLP.基因在番茄。NLP.番茄的基因高度保守，拟南芥，油菜，玉米和水稻。节段复制是主要的驱动因素SLNLP.基因进化。一些SLNLP.基因在进化期间经过阳性选择，可能导致基因家族的功能性分歧。表达模式SLNLP.基因在番茄生长发育中的不同生理作用提供了线索，特别是在硝酸盐吸收调节方面。进一步的功能分析SLNLP.,特别是SLNLP3.和SLNLP6.，有必要探索其监管职能。据信，对角色的全面了解SLNLP.在波动的营养条件下，朝向番茄中氮利用和促进氮气利用效率的分子机制的基本步骤。

数据库搜索NLP蛋白

从Pfam (http://pfam.xfam.org）[9]用于在番茄基因组（Solanum_lycopersicum.SL3.0）中搜索它们的直晶体，在植物血红素中的E值小于1E - 10（https://///phytozome-next.jgi.doe.gov/info/slycopersicum_itag2_4）.然后，通过基于智能确认结果（http://smart.embl.de/），NCBI保守域数据库（CDD）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)和植物转录因子数据库(TFDB) (http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）数据库。使用Expasy ProtParam预测了SLNLP蛋白的物理化学性质，包括肽长度（AA），分子量（MW），等级电点（肉汁）的宏观平均值（http://web.expasy.org/protparam/）[12.］．利用CropPAL2020预测SlNLP蛋白的亚细胞定位(https://www.crop-pal.org）[17.］．

多个序列对准和系统发育分析

采用Clustal W (version 2.1)进行蛋白的多序列比对和序列识别矩阵[22.］．然后，使用Genedoc软件手动调整RWP-RK和PB1结构域中的推导氨基酸序列。用Megax程序构建系统发育树（http://www.megasoftware.net/)，使用邻居连接方法。利用泊松校正距离估算进化距离，计算氨基酸差异的比例。两两删除选项被用来规避缺口和缺失的数据。使用MEME server v5.3.0 (http://meme-suite.org/tools/meme.）[3.］．搜索的参数如下:最大motif数目为5,min-max motif宽度为2-40。基于e值小于1e−15的低质量匹配图案被手动删除。的外显子-内含子结构SLNLP.基因结构显示服务器(gsd2.0，http://gsds.gao-lab.org/）.番茄的NLP蛋白序列（Solanum lycopersicum），拟南芥（拟南芥蒂利亚纳)、油菜(芸苔属植物显著)、水稻(栽培稻)及玉米(玉米）从植物精血中下载（https:////phytozome.jgi.doe.gov/）.

染色体分布与基因复制

利用多重共线性扫描工具MCScanX分析染色体分布和基因重复事件。同源同线分析图NLP.使用Dual system Plotter软件(https://github.com/CJ-Chen/TBtools）[6］．每个重复的非同义(Ka)和同义(Ks)替换NLP.使用KaKs_Calculator 2.0进行基因计算[32.］．

蛋白质 - 蛋白质相互作用网络分析

为了研究蛋白质相互作用网络，我们在Ensembl数据库SL3.0 (http://plants.ensembl.org/index.html)，然后使用STRING工具预测交互伙伴和网络(http://string-db.org/）.

植物材料及处理

本研究中使用了番茄生态型微米。在转移到水培之前，将种子萌发并在蛭石上生长7天。水耕的最小培养基包含2mm kH₂宝₄，2 mm mgso₄，25μmh_3.薄_3.，2μmznso₄， 2 μM MnCl₂，0.5μmcuso₄， 0.5 μM Na₂MoO₄， 20 μM Fe-EDTA。在培养基中添加1.3 mM Ca(NO_3.）₂， 1.5 mM KNO_3.， 0.14 mM KH₂宝₄和1 mm mgso₄在正常情况下。溶液的pH保持在5.8左右。营养液每周完全替换。植物生长在28/22°C，光/暗周期16/8 h。采用水培4周的植株进行氮饥饿处理和硝态氮诱导处理。对于缺氮处理(-N)，用1 mM CaCl水培最低培养基₂， 0.6 mM K₂所以₄， 0.25 mM KH₂宝₄和0.5 mm mgso₄用了2天。对于硝酸盐诱导处理，将N-饥饿的植物用5mM硝酸盐培养基重新拍摄（kno水培最小培养基_3.)以确定指定的时间。

RNA提取，cDNA合成，qRT-PCR

采用M5超纯总RNA提取试剂(美5生物技术有限公司)提取不同组织的总RNA。然后，将无dna RNA用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Cat。不。K1622热)。采用SYBR Green PCR Master Mix (Life Technologies)在7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems)中进行定量RT-PCR (qRT-PCR)。相对表达水平SLNLPS.分别在苗期、开花期和红果期进行测定。管家的番茄EF1基因（Solyc06g009970.3）被用作内部控制。用于QRT-PCR的引物序列列在补充表中3.．

^15.不_3.^-吸收试验

^15.不_3.^-根内流入的确定如前所述[37.］．番茄根用0.1 mM CaSO洗涤₄1分钟然后浸没在含有1mm或5 mm k的培养基中^15.不_3.(原子%^15.N: 99%)孵育5min，最后在0.1 mM CaSO4中孵育1min₄，并被冷冻在液氮中。粉碎后，将冻粉等量在80°C下干燥过夜。的^15.使用同位素比质谱仪（IRMS; DELTA测量N浓度^加XP)。的涌入^15.不_3.^-从中计算了^15.n含量的根（1 mg dw）。

统计分析

数据使用SPSS 21版本的统计程序进行处理。差异有统计学意义^15.采用学生t检验检测N内流和基因表达(*p< 0.05, * *p< 0.01)。

研究中使用的数据库包括Pfam (http://pfam.xfam.org), Phytozome (https:////phytozome.jgi.doe.gov/),智能(http://smart.embl.de/），NCBI保守域数据库（CDD）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd），植物转录因子数据库（TFDB）（http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/），Expasy ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/），croppal2020（https://www.crop-pal.org), MEGAX (http://www.megasoftware.net/)、MEME服务器v5.3.0 (http://meme-suite.org/tools/meme.)、双系统绘图仪软件(https://github.com/CJ-Chen/TBtools)、ensemble Database SL3.0 (http://plants.ensembl.org/index.html）， 细绳 （http://string-db.org/）.所有这些数据库的公众访问都是开放的。本研究中使用和/或分析的数据集可在合理要求下由通讯作者提供。

nlp:

丁蛋白

nrts：

硝酸盐转运蛋白

我们感谢金刚教授从中国农业大学捐赠番茄微米种子。

来自中国国家重点研究和发展方案的补助金（No.220yfa02902）和中国国家自然科学基金（No.32025004）的支持。该资助者提供了研究基金，在实验设计，数据分析，决定发布或准备稿件中没有作用。

隶属关系

1. 中国农业大学生物科学学院，植物生理生化国家重点实验室，北京100193

   刘梦媛，智晓娜，王毅，王洋

贡献

YW2和ML设计研究方案并分析数据，ML进行实验，XZ辅助番茄水培。手稿是YW2写的。YW1帮助修改手稿。作者阅读并批准了最终的手稿。

通讯作者

对应到阳王．

伦理批准和同意参与

本研究中植物的实验研究符合机构，国家和国际指南。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。

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