桑树抗性和敏感反应的转录组分析有enterolobii感染

背景

桑(森菊属L.）是一种重要的养蚕作物;然而，根结线虫感染严重限制了其生产。了解桑树和线虫之间的相互作用机制对于控制感染是重要的。

结果

利用测序和转录组组装技术，从桑树抗虫品种和感虫品种侵染后不同时期的根样品中鉴定了55,894个ungenes有enterolobii;其中33,987人在NR，瑞士 - Prot，Kegg和Kog数据库中注释。差异表达基因（DEGS）的基因本体和途径浓缩分析揭示了参与激素代谢过程的关键基因，植物激素信号转导，黄酮类生物合成，苯丙醇丙烷生物合成和过氧甲基丙酮和光合途径。共表达网络的关键趋势分析表明，未成语0,015,083,0,073,272,0,004,006和0,000,628的表达与耐抗力呈正相关M. Enterolobii.．Unigene 0015083编码tabersonine 16- o -甲基转移酶(16OMT)，参与生物碱生物合成。Unigene 0073272编码一个转录因子，有助于植物免疫应答过程中一氧化氮的积累。Unigenes 0,004,006和0,000,628分别编码参与植物激素信号转导的ERF和MYB转录因子。我们通过21个DEGs的RT-qPCR验证了转录组测序结果的准确性。

结论

本研究结果增加了我们对桑树抗性机制和候选基因的认识M. Enterolobii.互动。因此，我们的数据将有助于对该病原体的有效控制措施的发展。

桑(森菊属L.）是一种经济上重要的养育作物，不仅用于养育和丝绸编织，还用于医疗保健品，药物，食用菌培养以及其他高附加值的领域[1］．随着蚕桑产业的发展，多种病虫害迅速相继发生，其中包括我国桑林常见的一种重要病害——根结线虫病[2］．使用形态学和分子鉴定方法，张等人。[3.]鉴定出广东省引起桑树根结线虫病的病原为有enterolobii．这种根结线虫对经济作物和粮食作物造成严重损害[4]，并已成为世界热带和亚热带地区最具威胁性的致病线虫之一，估计潜在减产20% [5］．M. Enterolobii.最初发现了Euterolobium interortisiLimum.中国海南漳州[6］．它可以促使各种经济上重要的作物和热带水果迅速再现。此外，M. Enterolobii.能克服抗性线虫基因介导的抗性反应，导致抗性产量损失65%以上Solanum Tuberosum.，辣椒（辣椒酱SPP。）和其他蔬菜[5］．M. Enterolobii.也已在非洲，美国和欧洲发现[7]，欧洲和地中海植物保护组织（EPPO）在2010年的EPPO A2列表中包括此类物种[8］．到目前为止，M. Enterolobii.在海南，广东，福建，湖南和云南等地区检测到中国其他地区[9，10，11，12，13]，逐渐向北传播说明[14］．

在他们长时间的演变过程中，植物已经形成了反对入侵根结线路的防御系统。通过识别对应于各种病原体的病原体相关分子模式（PAMP）的细胞外免疫受体来建立第一防御线[15］．PAMP监测引起的免疫反应称为PAMP触发免疫(PTI)。触发PTI反应的分子，如Flg22，诱导PTI反应相关基因的表达，从而导致活性氧簇爆发、气孔关闭和胼胝质积累[16］．尽管如此，病原体具有克服这一碱性植物免疫防御的一系列的机制，可以通过分泌效应抑制植物免疫力，这可以直接抑制植物免疫相关蛋白或改变其活跃状态[15］．因此，各种植物调控因子在一个高度受控的调控网络中相互协同工作[17］．

了解线虫如何与桑树交互是控制感染的关键。转录组测序技术可以帮助揭示植物（抗性/易感）和线虫之间的串扰和集成途径[17］．使用RNA-SEQ的比较转录组分析提供了一种实惠且高分辨率的方法，用于鉴定鉴定差异表达以响应不同的生物应力的基因，并且已在许多模型和非模型物种中使用[17］．Haegeman等人。[18)测序Meloidogyne Graminicola.在Illumina 454测序平台上，使用从头测序方法。此外，Santini等人[19]研究了亲和相互作用过程中的宿主转录谱phoudolusulus vulgaris.和Meloidogyne incognita.，识别差异表达的797个宿主基因。与此同时，Shukla等人。[20.]研究了易感和抗性番茄的相互作用（Solanum lycopersicum）品种m .隐姓埋名的女人使用转录组分析。

虽然RNA-seq已经成功地用于识别线虫-宿主在几种不同宿主中的相互作用[18]但还没有进行研究以了解桑树植物中的线虫宿主相互作用。Paestakahashi等。[21.)是第一个报道由M. Enterolobii.在巴西的桑树上随后由Zhang等人进行的形态学和分子分析[3.]确定M. Enterolobii.作为广东省桑树感染的病原体。邵等人。[22.]审查了广东省19桑树品种的抵抗力，展示了桑椹C44是抵抗力的M. Enterolobii.而283 ×反⁻¹⁰是一种易感品种。因此，存在重要的需求，分析抗性和易感造型品种之间的相互作用和M enterolobii使用RNA-SEQ。

在本研究中，我们分析了桑树根结线虫病的抗病和感病品种的转录组数据，以确定基因和途径，可能用于开发有效的防治措施。

转录组测序

采集抗性品种粤桑C44不同时间点的根系样品，编号为:接种前为KB0d;接种后8d (dpi)、KBjz8d和KBck8d;17 dpi时，KBjz17d和KBck17d;在23 dpi时，KBjz23d和KBck23d;标记为“jz”的样品用线虫接种，标记为“ck”的样品用水接种。同样，敏感品种283 ×抗的样品⁻¹⁰编号为GB0d、GBjz8d、GBck8d、GBjz17d、GBck17d、GBjz23d、GBck23d。对技术重复(同一实验组同时采集样本)进行编号①，②，和③，总共给出42个样本。来自抗性和易感品种的根样本的转录组测序[22.[感染了M. Enterolobii.在Illumina平台上进行（表1)．全部reads过滤后高质量序列的比例为> 99%，Q20(%)为> 98%，Q30(%)为> 94%，说明转录组数据质量良好，测序结果高度可靠(表)1)．

de novo集会的结果

我们用Trinity软件组装了干净的读数。组装后得到55,894个unigenes，长度范围201 ~ 22,885 bp，平均为1,202 bp;N50, 1964 bp)，平均GC含量为41.09%。组装后的转录本长度分布如图所示。1．

Unigene函数注释

我们使用BLAST X将组装的unigenes与Nr、SWISS-PROT、KEGG、KOG数据库中的蛋白序列进行比较(E值< 0.00001)，进行蛋白功能注释。共注释了33,987条ungenes，其中Nr数据库中注释了33,921条，占所有注释基因的99.8%;在SWISS-PROT数据库中注释了20750个基因，占所有注释基因的61.1%;KEGG数据库中注释基因13,165个，占所有注释基因的38.7%;在KOG数据库中注释了17,462个基因，占所有注释基因的51.4%。

筛选差异表达基因（DEGS）

利用阈值p < 0.01和倍数变化(FC)≥2对不同时间点的抗病品种和感病品种的DEGs进行鉴定。2一个)。将接种根部的DEGS与未处理（对照）根部的VENN图分别在8,17和23dPI的易感品种中显示出接种的根部（对照）根部，其中在8,17和23dPi中分别在易感品种中，其中1,969,1,657和1,375°每个时间点都是独特的（图。2b).抗性品种在8 dpi、17 dpi和23 dpi处分别鉴定出2,324、4,820和3,584个DEGs，其中每个时间点分别鉴定出1,612、3,621和2,450个DEGs。2c)。

我们在接种前，使用GB0D-VS-GBJZ17D和KB0D-VS-KBJZ17D和KB0D-VS-KBJZ17D（相对于GBJZ17D和KBJZ17D中的参数分别在接种之前，在接种之前，在接种之前，在17dpi中对基因表达进行比较在17dpi中的抗性和易感品种。GB0D和KB0D的表达水平）。数字2d结果表明，17 dpi时，抗病品种所特有的deg为8,678个，感病品种所特有的deg为2,340个，两个品种共有的deg为2,330个。

基因本体学（GO）富集分析DEGS

17 dpi的易感桑树含量的富集分析

将2,267次与Nematode接种相关的2,267次与Go Databate的17 dpi（GBJZ17D）接种相关联的2,267°（图。3.a)表明这些基因在1129个GO条目中富集。在生物过程本体、分子功能本体和细胞组分本体中分别有747个、280个和102个GO条目。与各项目相关的下调基因数量高于上调基因数量，差异有统计学意义。在生物过程本体论中，分类中基因所占比例最大的是代谢过程、细胞过程和单生物过程。在分子功能本体论中，大多数基因属于催化活性和蛋白质结合分类。在细胞成分本体中，大量的基因与细胞、细胞部分、膜、细胞器和膜部分分类相关(图)。3.一个)。

在23 dpi抗性桑树的富集分析

比较23 dpi (KBjz23d)抗性桑树品种中与线虫接种相关的3,584 DEGs与GO数据库(图。3.b)表明这些基因在生物过程、分子功能和细胞组成三大本体中分别富集了1309个GO条目，其中898个、292个和119个GO条目。与每个入口相关的上调基因数量显著高于下调基因数量。在三种本体中，KBjz23d富集deg的GO分类与GBjz17d相同;但富集的氧化石墨烯组分与GBjz17d不同;在生物学过程本体论中，KBjz23d基因在与大分子代谢调控相关的条目中显著富集，而GBjz17d基因在与植物细胞壁代谢相关的条目中显著富集。

氧化石墨烯在抗病品种和感病品种间的富集分析

比较在接种前的17dPI的抗性和易感品种中鉴定的耐敏感和易感品种的℃，我们将2,340°（称为KBVSGB-GBJZ17D Degs鉴定为易感品种（图。2d).氧化石墨烯数据库显示，这些DEGs主要富集在1,146个氧化石墨烯项目上(图1)。4在本体论中，生物过程、分子功能和细胞组成分别为776、258和112。感病品种中下调基因数量显著高于上调基因数量。在生物过程本体论中，分类代谢过程、细胞过程和单个组织过程中基因所占比例最高，而在分子功能本体论中，与分类的催化活性和蛋白质结合相关的基因所占比例最高;在细胞成分本体中，分类细胞和细胞部分包含的基因百分比最大(图。4一个)。

接下来，在接种之前，在接种之前，在接种前分析了17 dpi的8,678次，其表达（Kbvsgb-kbjz17d egs;图。2d). GO数据库建议(图。4b）Kbvsgb-kbjz17d富集的富集为1,764个进入，其中分别有1,179,422和163种，分别在三个主要的本体生物过程，分子功能和细胞组合物中进入。与每个条目相关的下调基因的数量显着高于上调基因的数量。在三个本体中，富集KBVSGB-KBJZ17D DEG的GO分类与富集KBVSGB-GBJZ17D中富集的GO分类相同（图。4)，而富集的氧化石墨烯入口与KBvsGB-GBjz17d不同。在细胞成分本体中，KBvsGB-KBjz17d DEGs在核糖体和细胞基质等项目中显著富集(图2)。4c)，而KBvsGB-GBjz17d在类囊体膜等与光合作用相关的项目上显著富集(图2)。4d）。

二氢酶的途径富集分析

途径分析有助于理解基因的生物学功能，并鉴定DEGS在关键信号转导和生化代谢途径中的参与。

17dpi时感病桑树中DEGs的富集途径分析

使用KEGG数据库的17dPI（GBJZ17D）在17dPI（GBJZ17D）中的接种根部的途径对易感桑树（GBJZ17D）的途径注释显示，这些可富集在113条途径中，具有五种显着富集的途径（Q≤0.05）（图。5a），如下：二次代谢物生物合成;泛醌和其他三萜醌生物合成;黄酮类生物合成;苯丙烷化生物合成;和代谢途径。其中，代谢途径具有最多的富集基因，145℃。黄酮类生物合成途径的富集因子（富因子）值最高，表明该途径是最富含的。

23 dpi抗性桑树抗植物的途径浓缩分析

在23 dpi (KBjz23d)位点上，抗性桑树接种根与未接种(对照)根的差异基因被注释到109条通路上。其中6条通路显著富集(Q≤0.05)。5b）：二次代谢物的生物合成;葡萄糖苷生物合成;cutin，suberine和蜡生物合成;α-亚麻酸代谢;苯丙烷化生物合成;和黄酮类生物合成。仲成代谢物生物合成途径富含最多基因（107℃）。葡萄糖苷生物合成和Cutin，Suberine和蜡生物合成途径显示出最高的富集。

抗性易受易感品种的途径富集分析

在抗病和感病桑树品种中鉴定的DEGs相对于接种前的表达量为17 dpi，利用KEGG数据库注释以进行途径富集。敏感品种(KBvsGB-GBjz17d)特有的差异基因在111个途径中富集，其中2个途径显著富集(Q≤0.05)(图2)。5C):泛素等萜类醌类生物合成和角质、亚麻氨酸、蜡类生物合成。角质、亚毛碱和蜡的生物合成最为丰富。抗桑树特有基因(KBvsGB-KBjz17d)在126条途径中富集，其中7条途径显著富集(Q≤0.05)(图2)。5d），如下：淀粉和蔗糖新陈代谢;pentose和葡萄糖酸酯转化互联;ABC运输车;苯丙烷化生物合成;植物 - 病原体相互作用;精氨酸和脯氨酸代谢;和青色氨基酸代谢。在这些途径中，ABC转运蛋白是最丰富的。

DEG表达趋势

分析了感病桑树中17 dpi相对于接种前的表达趋势(GBjz17d)、抗病桑树中23 dpi相对于接种前的表达趋势(KBjz23d)、感病桑树特有的17 dpi相对于接种前的表达趋势(KBvsGB-GBjz17d)、与接种前表达量相关的17 dpi的DEGs (KBvsGB-KBjz17d)是抗桑树特有的。我们的分析结果确定了20个趋势(附加文件1：图S1）。

GBjz17d DEG表达趋势

GBJZ17D DEGS识别的概况2，简档1，概况18，概况16，简档17和Profile3（附加文件1：图S1A）分别具有显着富集的趋势，分别表示452,312,210,219,196和169个基因。

KBJZ23D DEG表达趋势

KBJZ23D DEGS识别的概况分析概念图17，Profile2，简档19，Profile0，Profile12和简档15（附加文件1：图S1b）分别为显着富集的趋势，分别表示627,260,349,333,260和342个基因。

deg在抗病品种和感病品种间的表达趋势

KBVSGB-GBJZ17D DEGS趋势分析（附加文件1图S1c)显示profile2、profile17、profile1、profile16、profile18、profile7和profile0显著富集，分别代表461,347、244、307、227、136和106个基因。

KBvsGB-KBjz17d DEGs的趋势分析(附加文件1图S1d)显示，profile2、profile1、profile17、profile18、profile12、profile3、profile7和profile0基因富集，分别代表2003、953、1373、492、346、423、294和306个基因。

关键趋势的共表达网络分析

GBjz17d profile1中连通性最高的核心基因为unigene 0015188;该基因的共表达网络图见附加文件1:图S2a。Unigene 0015188编码β-半乳糖苷酶，该酶参与植物初级细胞壁中果胶的降解。GBjz17d profe3中连通性最高的核心基因为unigene 0022838，相关共表达网络见附加文件1：图S2B。UNIGENE 0022838编码蛋白质1C1的CASP，其与植物应激性有关。GBJZ17D型材16中具有高连接性的核基因是未成熟的0.022,247和0.010,321;相关的Co-表达式网络如其他文件所示1：图S2C。UNIGENE 0022247编码3-羟基-3-甲基戊齐律辅酶酶的还原酶，其是抗毒素和类固醇基合成的关键酶。UNIGENE 0010321可以编码富氨氨酸富重复受体蛋白激酶（LRR-RLK），其参与植物和病原体之间的植物激素信号转导，识别和透射。GBJZ17D谱18中具有高连接性的核心基因是UNIGENE 0021656，相关的CO表达网络在附加文件中详述1：图S2D。Unigene0021656编码钙调蛋白依赖性蛋白激酶I型，并且Kegg注释显示该基因是植物 - 病原体相互作用途径的一部分。

KBJZ23D轮廓0中具有最高连接性的核心基因是UNIGENE 0014848;相关的Co表达式网络图如附加文件所示1：图S2E。Unigene 0014848编码泛素羧基末端水解酶12，一种效应蛋白，可抑制植物抗根结线虫的抗性，促进线虫饲料的形成。在KBJZ23D谱12中，具有最高连接性的核心基因是Unigene 0015083;相关的Co-表达式网络如其他文件所示1:图S2f。Unigene 0015083编码一个参与植物生物碱生物合成的16-o-甲基转移酶ROMT蛋白。KBjz23d profe15中连通性最高的核心基因为unigenes 0,073,558和0,073,272，相关共表达网络见supplementary File1：图S2G。UNIGENE 0073558编码泛素羧基末端水解酶13，而UNIGENE 0073272编码SRG1蛋白，属于锌指转录因子家族。表达SRG1.与植物免疫应答过程中一氧化氮的积累有关。进一步，GO生物过程注释显示该基因与类黄酮生物合成有关。KBjz23d profe19中具有高连通性的核心基因为unigenes 0,002,889和0,068,389，相关共表达网络图见Additional File: Figure S2h。Unigene 0002889编码调控ABA信号转导的蛋白磷酸酶2C, Unigene 00683889编码参与胁迫反应的蛋白激酶Cipk14;GO生物学注释表明该基因与细胞过程调控有关。

具有最高连接在KBVSGB-KBJZ17D Profift3中的核心基因是Unigene 0004006，并且相关的Co表达网络被示出在附加文件中1：图S2i。UNIGENE 0004006使用水杨酸（SA），乙烯，茉莉酸等因素编码信号传输中涉及的ERF转录因子，其在植物应激反应中起重要作用。在KBVSGB-KBJZ17D型材12中，具有高连接性的核心基因是未成熟的0,000,628和0,015,083;相关的Co表达式网络图在附加文件中呈现1:图S2j。Unigene 0000628编码MYB转录因子家族蛋白AIM1，该蛋白在ABA信号传递过程中参与胁迫相关基因的表达，并正调控植物对病原体的防御反应。Unigene 0015083编码一个与植物生物碱合成相关的甘草酸-16- o -甲基转移酶基因。KBvsGB-GBjz17d profe16中连通性最高的核心基因为unigenes 0,052,595和0,004,809，相关共表达网络见附加文件1：图S2K。UNIGENE 0052595编码了与自噬相关的因子ATG8。UNIGENE 0004809编码细胞壁相关的受体激酶22，其属于植物防御的RLK受体激酶系列。

逆转录定量PCR（RT-QPCR）验证次数

为了验证转录组测序结果的准确性，我们以测序用RNA的反转录获得的cDNA为模板，采用RT-qPCR分析了21个DEGs。用2^-ΔΔct方法，GraphPad Prism 8.0可视化结果(图。6)．虽然RT-qPCR检测到的DEG表达差异大小与转录组测序检测到的DEG表达差异大小不相同，但两种方法检测到的DEG表达变化方向是一致的，说明转录组测序结果是高度可靠的。

M. Enterolobii.是桑树根结病理原[23.］．该物种表现出强大的毒力和快速繁殖;因此，它对桑树生产的影响很高。造成母莓品种的培养M. Enterolobii.是最有效的控制方法之一[22.];然而，桑树抗性的机制是M. Enterolobii.还不清楚。在本研究中，我们首次利用转录组测序技术对我们的知识进行研究M. Enterolobii.研究桑树抗、感病品种间的相互作用M. enterolobii。

我们选择了21只与感染有关M. Enterolobii.用于RT-QPCR验证。我们的结果表明，通过转录组测序结果建立的DEG表达的趋势相同，表明转录组测序的高可靠性导致反映了感染的桑树根系中基因的真实表达水平M. Enterolobii.．转录组测序表明，激素代谢过程、植物激素信号转导、类黄酮生物合成、苯丙素生物合成以及运输相关基因可能参与了它们之间的相互作用M. Enterolobii.和桑树。对互动的潜在机制研究将提供进一步的新见解。

与未接种的对照相比，在接种根结线虫后的每个时间点，感病品种中表达量下调的基因数均大于表达量上调的基因数，其中deg的表达量在8 dpi时最高。这些结果表明，植物的初级防御反应在侵染中后期逐渐稳定(17和23 dpi)，导致DEGs的数量减少(图2)。3.)．在8,17和23dpi的抗性变化中鉴定的耐抗性的次数与未诱导的对照中的表达相比，首先增加，然后略微下降，上调基因的数量高于下调的数量 -受调节基因。这些结果表明，在根结线虫感染的早期阶段（8 dpi）的早期触发了抗病常态的初级防御反应，而该植物在长时间期间产生了更先进的防御系统涉及诱导无数与无国防相关基因的防御系统感染，这可能解释中期和晚期感染期间的次数（17和23 dpi）的大幅增加。感染抗性和易感造物品种的抗体M. Enterolobii.与西瓜抗病、感病材料感染m .隐姓埋名的女人，据赵所述[24.］．这些DEG的生物信息学分析表明，它们与参与线虫抗性的过程有关，包括活性含氧，纤维素，木质素，糖尿病合成和ABA信号传导。在这些过程中，许多关键基因的表达与耐受性正相关m .隐姓埋名的女人．

我们分别对17 dpi和23 dpi进行了Degs的GO和途径富集分析，分别用于易感和抗性桑椹品种。为同样的GO分类富集了四种不同的基因集，富集的途径包括与植物疾病抗性相关的次级代谢物生物合成途径，例如苯基丙烷生物合成，黄酮类生物合成和醌生物合成。这些数据表明，耐药和易感造物均在感染后部署类似的防御过程。GO enrichment analysis indicated more down-regulated genes than up-regulated genes associated with this GO classification in the susceptible variety, while the opposite was the case (i.e., more up-regulated genes than down-regulated genes) in the disease-resistant variety. Further, the number of DEGs annotated in the GO database was much higher in the resistant variety than that in the susceptible variety. This is consistent with results reported by Xing [25.研究表明，抗病品种在感染后可以启动大量防御相关基因的表达，从而提高抗病能力。

苯丙烷是一种低分子量的抗生素，驱虫剂或信号分子，通过参与植物防御反应而参与植物和微生物之间的相互作用[26.］．苯基丙烷的生物合成与抗病次级生物质的产生有关，包括植物保护因子，木质素和酚类化合物，并提供改善对线虫植物抗性的潜在方法[27.］．Wuyts等人[28.[在抗性和易感的根中研究了木质素和苯基丙烷含量穆萨娜娜被感染了radopholus similis.结果表明，抗病品种维管束中木质素和阿瓦酸(苯基丙烷)含量高于感病品种;所有维管束均表现为木质素化。Xu等[29.]显示，感染后m .隐姓埋名的女人，苯丙烷含量和相关酶活性在抗性茄子品种的根部大于易感品种中的根。在本研究中，与易感桑树中的苯丙烷生物合成相关的基因在17dpi与线虫中开始调节，而抗性多样性显示出上调的表达。这可能是抗性和易感品种之间抵抗差异的原因之一。

醌和类黄酮是酚类化合物，作为次生代谢产物[30.］．酚类化合物是植物与病原菌相互作用的重要物质。Dama (31.[测量了从植物中提取的三种类型醌的活性meloidogyne javanica．三种物质均具有不同程度的杀线虫活性，其中白桦丹醌的杀线虫率达100%。Hutangura等人[32.据报道，巨细胞的形成Trifolium Repens.与生长素累积有关，黄酮类化合物作用为植物素输送调节剂，可能控制养蛋白积累。此外，黄酮类化合物可以抑制m .隐姓埋名的女人活动[33.]，类黄酮的产生是植物对线虫感染的防御反应[34.］．Wasson等人[35.[表明，黄酮类化合物可以影响根结的尺寸和细胞分裂，而它们不参与根结形成或兆细胞形成，并且不太可能由根结介导的养蛋白运输和积累。在这项研究中，我们发现与酚类化合物生物合成相关的基因在感染后的后期易感桑椹植物中受到下调，而它们在抗性品种中被上调。

根结线虫侵染会影响植物的光合作用，而光合作用是植物产生有机质和储存能量所必需的一项基本生理活动。爱与鸟[36.]观察到，在侵染初期，光合速率显著下降m是与对照相比。此外，Ye等人。[37.]研究了线虫感染对抗性和易感温室生长黄瓜叶片光合作用的影响，显示出感染后抗性和易感材料的叶绿素含量和净光合速​​率降低;然而，这些降低在抗性材料中显着较小，而不是易感材料。赵[24.]也发现光合作用、叶绿素结合、光合系统等过程相关基因的表达在早期受到抑制m .隐姓埋名的女人用转录组测序技术感染抗性和易感西瓜品种。在本研究中，与抗性，光合作用和囊体相关的基因在线虫感染的早期阶段抑制了与之前的发现一致。

我们发现在易感造型中检测到与Zeepin生物合成和过氧化物酶相关的基因的富集。扎丁是一种细胞蛋白[38.，当植物受到胁迫时，细胞分裂素水平会发生改变[39.］．Lohar等人[40[植物根部在植物根中发育，细胞素氧化酶的过度表达时，细胞蛋白响应调节基因的表达降低Lotus对虾减少线虫感染的根结的数量。在这项研究中，抑制在感染易感桑树品种中的扎丁蛋白生物合成可能与巨细胞的产生有关。过氧化物酶是一种重要的植物保护酶，与应力阻力有关[41.］．Xu等[42.]，认为抗根结线虫侵染茄子过氧化物酶活性低，有利于活性氧的积累，促进植物根的过敏性坏死。Jin等人[43.]观察到过氧化物酶活性倾向于首次增加，然后在早期（0-25天）期间减少m .隐姓埋名的女人黑籽南瓜侵染。在本研究中，桑树染病后，过氧化物酶相关基因的表达先上调后下调。线虫侵染早期对敏感品种根细胞膜的损伤可能加速酶促反应，导致相关基因表达上调;在感染后期，根细胞的变化趋于相对缓慢，相关基因开始下调。

在耐药的桑椹多样性中，在Nematode感染后，也富集了与Sa代谢和萜烯生物合成相关的基因并显示出上调的表达。SA是一种简单的酚类化合物，涉及信号转导，可以诱导致病性相关蛋白质和植物系统获得性的表达[44.］．此外，它是引起植物对根结线虫过敏反应的重要信号分子[45.］．萜类化合物是植物重要的次生代谢产物，调控植物生长发育，帮助抵抗光氧化胁迫，直接或间接参与植物防御[46.］．Echeverrigaray等[47.]研究了22种单萜化合物对线虫的活性，结果表明，其中20种单萜化合物能显著降低线虫卵的孵化率，11种单萜化合物能降低根结线虫的流动性。在本研究中，与SA代谢和萜类途径相关的DEGs只在抗病桑树品种中富集，说明感病桑树品种与抗病桑树品种侵染根结线虫后的防御机制不同。

在抗性桑树品种共表达网络中，除了在DEGs中富集SA代谢和萜类生物合成相关基因外，一些具有高连通性的核心基因为zinc-finger、MYB和ERF转录因子。转录因子可以通过调节植物对生物和非生物因子攻击的免疫应答信号的转导来提高植物的抗性。在本研究中，我们发现参与植物激素信号转导的ERF (unigene 0004006)和MYB (unigene 0000628)转录因子编码基因的表达与线虫侵染呈正相关。大量的植物转录因子研究表明，MYB和ERF转录因子家族成员可以直接或间接参与植物的防御反应。这些转录因子的保守功能域与调控基因启动子区域的顺式元件特异性相互作用，使其参与植物抗病相关基因表达的调控网络[48.，49.］．这些转录因子可以直接调节植物靶基因的转录并与其他蛋白质相互作用。参与信号转导途径需要激活的形式。我们将UNIGENE 0073272鉴定为对根结线路的核心基因。Unigene 0073272对应于锌指转录因子SRG1.，其表达通过植物中的一氧化氮积极调节，可以激活植物防御响应[50.］．在病原体触发的硝基类爆发后诱导锌指转录因子SRG1的积累。随后，该转录因子与靶基因中的Actn6ACT或ActNaCT序列结合，其可能包括免疫功能的负调节剂。SRG1似乎充当转录压缩机，利用其推定的ERF相关的两亲性镇压（耳）域名招募裸照，促进植物防御反应的接合和豁免的建立[50.］．

通过关键趋势的共表达网络分析，我们鉴定了与抗性正相关的基因M. Enterolobii.．Unigene 0015083编码tabersonine 16- o -甲基转移酶ROMT基因，参与生物碱生物合成。张(49.发现C4甲基甾醇氧化酶(Mgr005)和甾醇c -甲基转移酶ROMT (Mgr009)参与了与致病性相关的膜蛋白的生物合成稻瘟病菌;它们也可能与a相关联稻瘟病菌感染过程中与信号转导相关的质膜钠反应蛋白。目前对桑树抗病相关基因的转录因子研究较少，对这些基因的分析将有助于桑树抗线虫育种。通过在桑树侵染过程中筛选DEGs，确定桑树抗根结线虫病的分子机制，为培育抗病桑树品种提供理论依据。此外，本研究产生的详细的转录组数据可能有助于识别基因，以提高桑树的抗性M. Enterolobii.．

利用转录组测序和重新组装技术，构建了桑树抗病和感病品种的参考转录本M. Enterolobii.．通过对DEGs的筛选和富集分析、趋势分析和共表达网络分析，揭示了桑树根结线虫侵染后抗病和感病基因的表达模式。我们的研究结果揭示了抗性差异的几个原因M. Enterolobii.在抗性和易感造型的桑椹．在感染后抗抗性品种的次级代谢产物的生物合成仍在上调，在感染后抗抗性品种。抑制易感品种。转录因子相关基因在抗性品种中高度连接和上调。同时，易感品种显示与相关的信号的识别和传输M. Enterolobii.感染与植物防御相关基因表达下调。

线虫文化

M. Enterolobii.从华南农业大学(广州)养蚕教学基地桑树植物的根中分离出桑卵，用于接种，如下图所示。

植物生长条件

yuesang C44是抵抗力的M. Enterolobii.，而283×抗⁻¹⁰是敏感的22.］．发芽和移植采用Wu所描述的方法[51.］．

收集和接种线虫

根据Li等人的方法采集线虫[52.］．在温室条件下长长的60天桑树幼苗进行接种。首先去除植物根上方的土壤以暴露根系。接下来，使用移液管将2ml蛋悬浮液加入到根部附近的土壤中。接种后，用土壤覆盖根。使用2ml水接种对照组的植物。每次治疗接种十五壶。将桑树幼苗置于温室中并定期浇水。

采集桑树幼苗根样

初步试验表明，感病品种在接种500个线虫卵后17天开始产生根结，而抗性品种在23天开始产生根结。因此，在接种第0天，8、17和23 dpi四个时间点采集样品。在每个时间点，每个实验组(包括对照组)对两个品种各取10个样品。将样本分成3个或4个组，每个接种组或对照组在每个时间点生成3个样本。根结样本按照Li[描述的方法采集53.］．

转录组测序和数据分析

样本送往广州吉迪奥生物科技有限公司，在Illumina Hiseq 4000平台上进行RNA提取和转录组测序，采用PE150双端测序方法。由于在NCBI GenBank中没有完整的桑树基因组参考信息，因此使用Trinity软件进行全新基因组组装。根据测序结果获得桑树参考转录本和非参考基因组。对得到的序列进行Unigene功能注释和差异表达分析，然后进行GO功能富集、通路功能富集，并对所选DEGs进行趋势分析。

Since the susceptible variety began to develop root knots at 17 dpi and the resistant variety started to form root knots at 23 dpi, data analysis focused primarily on these two time points (i.e., 17 and 23 dpi) and on DEGs from infected mulberries of the susceptible variety at 17 dpi (GBjz17d) and the resistant variety at 23 dpi (KBjz23d). When comparing differences between resistant and susceptible varieties after infection, GBjz17d and KBjz17d groups were compared, and the DEGs identified were analyzed.

基因的定量分析和筛选筛选

每千票读数每百万读取方法[54.]用于测定unigenes的表达。使用DESeq2筛选DEGs，以p < 0.01, FC≥2为显著差异表达阈值。试验包括一个抗性品种和一个敏感品种，在四个时间点采集样本。由于M. Enterolobii.在桑树生长过程中表现出表达变化的DEGs被排除在外。

GO术语和Kegg Pathway分析

使用Go和Kegg [55.[David中的途径浓缩方法[56.，使用参数p < 0.05，基因数≥2，错误发现率< 0.01。

聚类分析的系列检验

采用EdgR软件筛选DEGs，阈值大于表达差异2倍，假发现率< 0.05。采用STEM软件和log2标准化对数据进行预处理，进行系列聚类分析检验。默认生成最具代表性的20个模块，p < 0.05视为显著富集趋势。对每个趋势中鉴定的基因进行氧化石墨烯和途径富集分析，获得显著富集的氧化石墨烯条件和代谢途径。

基因共表达网络分析

对富集趋势中包含的DEGs进行共表达网络分析。采用Pearson相关系数评估各时间点样本趋势中所有基因的相关性，并根据与Spearman相关系数> 0.9的关系绘制网络图[24.］．利用软阈值计算基因连通性，根据连通性水平对基因进行排列，识别共表达网络中的核心基因(枢纽基因，代表连通性最高的基因)。

逆转录定量PCR（RT-QPCR）验证DEGS

21种与感染相关的degM. Enterolobii.进行RT-qPCR验证。

引物设计

RT-qPCR引物采用NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)．底漆（17-25核苷酸; GC含量，45％-55％）被设计成产生80-150bp的PCR产物，确保每对引物之间的类似熔化温度，并避免GC或在3'末端富集。当β-肌动蛋白基因（GenBank登录号DQ785808），其在桑椹稳定地表达，用作参考[57.］．底漆序列是在表中提供的2．底漆综合由天翼汇源公司（中国广州）进行。

RNA样本的逆转录

EVO M-MLV RT用于QPCR（AG11706）的QPCR（AG11706）来自Aikerui生物工程有限公司（湖南，中国）用于通过逆转录（RT）来合成来自所有RNA样品的cDNA。

荧光定量聚合酶链反应

实验在LightCycler®480 (Roche)荧光定量PCR仪上进行，使用的SYBR®Green Pro Taq HS qPCR试剂盒来自Ecory生物工程有限公司(中国湖南)。qPCR反应液体系如表S所示1．除cDNA模板外的所有试剂均加入1.5 mL离心管中，混合后加入8管专用条带进行荧光定量。然后将相应的cDNA添加到八管条带中。实验重复3次，每对引物3个阴性对照(不含cDNA模板)。表的年代2显示荧光定量反应条件。

组装的基因序列M. Enterolobii.可从NCBI获得。的RNA-Seq数据M. Enterolobii.可从NCBI SRA数据库获取。数据库链接:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/biosample.，生物样品ID: SAMN18837484 - SAMN18837525。

作者肯定确认确认文章结论所需的所有数据都存在于物品，数字和表格中。

阿坝:

脱盐酸

度:

差异表达基因

DPI：

接种后几天

EPPO：

欧洲和地中海植物保护组织

PAMP时:

病原体相关的分子模式

PTI:

PAMP触发的免疫力

RT：

反转录

SA：

水杨酸

作者愿承认中凯农业学院农业学院实验室的所有教师和学生的帮助。我们感谢Charlesworth Author Services（https://www.cwauthors.com/）在准备这份手稿期间的语言援助。

广东现代农业技术系统创新队项目（2016LM1134）提供了对该项目的支持。资金机构没有参与数据的设计，收集，分析或对数据的解释，或写作稿件。

作者笔记

1. Hudie Shao和Fu Yu是第一件作者。

隶属关系

1. 长江大学农业学院，荆州，434025，湖北，中国

   邵蝶，张攀，李传仁

2. 广州市中凯农业大学植物健康创新研究所，广东广州510225

   余富和春平你

3. 中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室，北京100193

   欢彭

贡献

H.S.完成了所有的实验，并且是撰写手稿的主要贡献者。Y.F.分析数据。P.Z.收集样本。C.Y.指导实验的操作。C.L.协助写作。手稿内容由惠普进行了修改，所有作者都阅读并通过了最终的手稿。

通讯作者

对应到春节你．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版物

不适用。

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意

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