咖啡非小种特异性抗病1 (NDR1)同源蛋白的鉴定与特性研究

背景

叶锈病，是由真菌引起的Hemileia vastatrix(Pucciniales)，是一种影响咖啡植物的毁灭性疾病(Coffea阿拉比卡l .)。与目前发展的植物保护方法相关的缺点最近导致寻找替代策略。这些包括组成性地激活抗病信号通路的基因操作。然而，这些途径的分子作用者仍然未知c·阿拉比卡．在本研究中，我们对咖啡进行了分离和表征NDR1.的基因,拟南芥Ortholog是一种众所周知的超敏感响应的主调节器，其取决于卷绕式螺旋型R蛋白。

结果

两个高度同源的cDNA编码假定NDR1蛋白质进行鉴定，并从咖啡植物的叶子克隆。一个候选编码序列，然后在表达拟南芥敲除了空突变体NDR1-1.．面对一种特殊菌株的挑战假单胞菌含油（DC3000 ::AVRRPT2.)，宏观症状分析和在Planta.微生物生长显示咖啡cDNA能够恢复突变遗传背景中的抗性表型。因此，cDNA被称为CaNDR1a(站小粒咖啡非小种特异性抗病1a）.最后，获得了生物化学和显微镜数据，强烈建议了机械保护NDR1.驱动功能在咖啡和拟南芥植物。通过瞬态表达系统，确实证明了CaNDR1a蛋白像它的拟南芥对应的，定位于质膜，在那里它可能是通过GPI锚栓。

结论

我们的数据为鉴定新功能提供了分子和遗传证据NDR1.同族体在植物。作为启动超敏感信号通路的关键调节器，CaNDR1基因可能是操纵咖啡固有免疫系统和实现对病原体的广谱抗性的选择靶点。给定的潜在守恒NDR1.-依赖的防御机制之间拟南芥和咖啡厂，我们的工作也表明了孤立的新方法，以孤立的尚未认识到R- 负责抵抗力的基因h . vastatrix．

属咖啡包括约120种亚热带/热带多年生木本树木和灌木的（家庭茜草科），其中至少两个物种是全球农业经济利益。近75％的世界咖啡生产起源于Coffea阿拉比卡L.，大约20％来自c . canephoraPierre ex . Froehner =c·罗布斯塔）.橙咖啡叶锈病被认为是主要的瘟疫之一c·阿拉比卡［1］．对疾病负责的真菌，Hemileia vastatrixBerkeley & Broome，广泛分布在咖啡种植国，可导致严重的落叶，导致大量浆果减产[1，2］．此外，目前两种限制病原体感染的方法优势有限。首先，使用杀菌剂虽然具有成本效益，但并不总是能有效地控制疾病，而且，它对环境有负面影响。第二，即使一些品种的咖啡对h . vastatrix已用于基因渗入目的[3.，4，由于携带新的毒力基因的真菌各种族的快速联合进化，这种替代方法耗时且不能提供持久的抗性[5］．因此，需要额外的方法来控制叶锈病。

h . vastatrix是一种专性的生物营养寄生虫，属于担子菌纲，棒子目[6］．随着尿孢子在叶背面萌发，菌丝生长并通过气孔进入叶肉组织的细胞间隙，然后分化细胞内的营养结构或吸器。在敏感的咖啡植物中，成功的病原体可以在感染后的三周内完成其双核循环并达到最终阶段，其特征是形成孢子菌。在抗性植物中，菌丝入侵能在2-3天内迅速被察觉并被阻止[7，8］．基于定量和孟德尔遗传学研究[3.，4]，发生至少九种显性抗性(R）基因咖啡属，和类似的真菌致病基因数量，已经推断。因此普遍认为咖啡/锈相互作用的结果，所述植物抗蚀剂病原体攻击（不相容性）或发展疾病（兼容性）是否依赖于基因对基因模型[9]，最近已修订[10.］．一旦进入咖啡细胞，h . vastatrix效应蛋白，并且它们触发细胞内的扰动，都应该通过R-特异性蛋白被感知。识别步骤促进信令防御途径（S）及随后的电阻的启动。或者，强毒锈病被认为分泌效应所逃脱或甚至抵消主机监视系统，其允许咖啡细胞代谢和组织定殖[的劫持11.］．

在与生物营养病原体的不相容互作过程中，植物抗性表型的产生是由于一种复杂的多层防御反应的开始，即所谓的超敏反应(hypersensitive response, HR) [12.，13.］．尽管对控制抗性的分子机制仍然知之甚少h . vastatrix在美国，有几项研究进一步证实了咖啡植物中存在类似hr的现象。接种无毒真菌菌株的抗性品种表现出许多HR特征的形态。这些包括宿主细胞的快速死亡，它局限于感染部位，并与真菌菌丝塌陷有关[7，8]、吸器的胼胝质包覆及随后的细胞壁木质化[8，早期氧化爆裂[14.，15.]和激活典型的防御相关基因[16.- - - - - -18.］．

在之前的工作中，我们进行了抑制消减杂交为基础的筛选c·阿拉比卡这被挑战了h . vastatrix并确定在兼容或不相容的相互作用期间调节的一系列表达的序列标签（EST）[16.，19.］．其中一个EST与编码序列共享了重要的身份非种族特异性抗病性1（NDR1.基因。最初被隔绝拟南芥,NDR1编码小质膜驻留蛋白，不足之处，其中发现取消HR并且赋予易感性一些真菌和细菌病原体携带特定效应基因[20.- - - - - -22.］．值得注意的是，已经确定NDR1.驱动抗性依赖于r蛋白的一个特定子集(如RPM1、RPS2和RPS5)，其定义是在其n端存在一个线圈(CC)结构[23.］．从机械角度来看，说明NDR1功能的最佳特征示例是涉及菌株DC3000 ::的病理系统AVRRPT2.植物病原菌的假单胞菌含油PV。番茄（太平洋标准时间）.在该模型中，AtNDR1在静息条件下，通过与rpm1 - interaction protein 4 (RIN4)相互作用，间接保留质膜胞质侧的RPS2蛋白，从而阻止HR的激活[24.］．在感染太平洋标准时间，细菌蛋白酶AVRRPT2分泌到细胞质中，在那里它可以切割rin4，释放rps2并引发疾病阻力信号通路[25.］．

在这项研究中，我们克隆了两个c·阿拉比卡候选的互补NDR1.并分析了推导出的一级氨基酸序列。咖啡蛋白与AtNDR1之间的结构域保护和高度同源性使我们采取了遗传互补的方法。使用拟南芥ndr1-1无效突变体，我们获得了遗传和分子证据，至少有一个候选基因是功能性的NDR1.直接同源。激光共聚焦显微镜和生化分析进一步表明，该蛋白可能通过糖基磷脂酰肌醇锚附着在质膜上。基于这些数据，可以调用ndr1相关机制的可能性R到 - 基因介导的耐药h . vastatrix进行了探讨。本文还概述了这一结果在提高抗性方面可能产生的影响。

新型NDR1序列同源物的克隆与分析Coffea阿拉比卡

在以前的工作中[19.[我们使用了减肥杂交方法来鉴定涉及咖啡植物防御/抵抗的基因（c·阿拉比卡L。)到橙色锈菌h . vastatrix．在HR期间显著上调的9个ESTs中，有一个与canonical的同源性为43%NDR1.从编码序列A. Thaliana.．在这项研究中，我们着重研究了咖啡的候选NDR1.基因和通过嵌套RACE-PCR分离的两个不同的全长转录物。如在所描述的相应的cDNA克隆“方法' 部分 （CaNDR1a[Genbank：DQ335596]，CaNDR1b[Genbank：DQ335597]）。开放阅读框架仅彼此不同，只有3个单核苷酸位置，其中一个取代是非沉默（F69L）。预计两种序列是编码214个氨基酸长的蛋白质，其计算的分子量为23.8kDa和等电点为9.58。

寻找拟南芥我们通过BLAST P算法筛选了GenBank数据库[26.]并检索15个非冗余命中。正如预期的那样，最佳匹配似乎是NDR1，具有42/61％的身份/同源性。除了未知的序列之外，所有已识别的同源物之前已被描述为NDR1 / hin1样（NHL）蛋白质超家族的成员[27.］．性NHL占广阔类，它们的N-末端半部内，包含两个高度保守的肽图案（基序2和3）和一个较不保守的一个（基序1）植物防御相关蛋白〔28.］．将这些蛋白质与烟草的HIN1比对，揭示了这三个基序在序列中的位置(图)1；参见附加文件1用于全长序列比对)。仅使用图中所示的保守区域进行系统发育分析1结果表明，CaNDR1a/b、NDR1、NHL38和NHL16形成了一个不同于其他NHL的组(图)2 a, b）.这些数据表明NDR1, NHL38和NHL16最接近拟南芥Candr1a / b的亲属。

Candr1a的异位表达拟南芥ndr1-1 null突变体恢复特定的抵抗力假单胞菌含油PV.．番茄（DC3000 :: AVRRPT2）

从我们的在网上分析后，问题出现了，这两种鉴定出的咖啡基因是否具有功能同源AtNDR1或不同的NHL对应物的代码。为了回答这个问题，采取了一种遗传互补方法。鉴于两种预测的甘露糖1氨基酸序列之间的高度的身份，我们决定研究CANDR1A并在控制中表达相应的ORFCaMV35S启动子的拟南芥ndr1-1零变异。在选择性培养基上进行分离分析，可分离出单位点、纯合子插入系(见附加文件)2种族隔离的结果)。然后通过RT-qPCR筛选T3细胞系，以获得高稳态水平的转基因转录本，并从中筛选出3个细胞系进行进一步实验。的表达水平CaNDR1a标记为T3-1、T3-2和T3-3的品系，分别比内源高92倍、190倍和714倍AtNDR1基因，与WT相比Col-0工厂完全相同的条件下生长。

先前的研究表明NDR1-1.null突变体不能激活HR响应太平洋标准时间菌株DC3000 ::AVRRPT2.携带AVRRPT2.含盒的质粒[20.，21.］．相反，一个高的过度表达水平AtNDR1在里面Col-0发现遗传背景可增强DC3000菌株的抗病能力[22.］．因此，我们检测了我们的过表达品系对两种同基因菌株(DC3000::AVRRPT2.和DC3000)，通过记录宏观症状和以下在Planta.细菌生长在为期四天。虽然招商局等．［22.]已有报道未接种者出现hr样病变拟南芥转基因线overexpressingAtNDR1，在我们的非接种T3线中没有观察到这种病变。虽然三种基因型响应DC3000而发育了疾病症状（图3A），T3-2和T3-3线易感于NDR1-1.突变植物，如在4天所示由叶细菌内容接种后（DPI）（图3C）.DC3000的挑战:: AvrRpt2， WT植物表现出典型的超敏病变位于浸润区，而NDR1-1.突变体表现出以组织发黄为特征的疾病样症状，并传播到接种区以外(图)3A）.正如预期的那样，WT和NDR1-1.基因型与叶片细菌数量密切相关。例如，早在2 dpi时，突变体叶片的细菌浓度就已经比WT叶片增加了10倍(图3B.）.更重要的是，接种菌株DC3000时::AVRRPT2.,所有三个CaNDR1a-表达系表现出类似hr的表型(图3A）与与WT植物的细菌水平相关联（图3B.）.此外，咖啡转基因在拟南芥突变体对rps4协调的HR没有显著影响，而之前的研究表明，rps4协调的HR是独立的AtNDR1［23.]（附加文件3.）.总之，这些结果提供了遗传学证据CaNDR1a在功能上和具体的补充NDR1-1.突变体。

成熟的CaNDR1a蛋白在c端被加工

的拟南芥NDR1蛋白经过多种翻译后修饰，包括多种糖基化和c端加工。后一种裂解去除了蛋白质的一小部分，从而释放出一个氨基酸残基，称为ω位(图)4）提出通过与糖基磷脂酰硫醇（GPI）-Achantor的共价结合来修饰[22.］．按照ATNDR1在抗病信号中的同源作用[23.]，GPI锚定在真核细胞膜驻留蛋白，通常会遇到，并且允许细胞表面栓系现象[29.］．虽然目前还没有关于gpi -锚栓附着位点的共识序列，但在线上可以找到预测算法。使用Big-Pi植物预测器[30.，31.，我们在CaNDR1a的一级氨基酸序列中发现了两个可能重叠的剪切位点(图4，其中S189和G190残基是强ω位候选P-值为2.48 × 10^－62.76 × 10^－5分别)。此外，CaNDR1a及其拟南芥内质网(ER)膜中转氨酶复合物对GPI的附着具有共同的结构特征[31.］．在可能的ω-残基的直接下游是一个区域，预计包含一个短极性间隔体，随后是疏水尾部。一个不可剪切的信号肽(1-39)，包含一个潜在的跨膜结构域(16-32)，也被预测具有很高的发生概率(P= 0.867）使用SignalP-3.0软件[32.，33.］．如前所述[22.]，这个n端信号序列可能是蛋白质进入ER网络并通过分泌通路所必需的。

在此基础上在网上分析后，我们决定研究CaNDR1a的c端加工的可能性。为此，创建了一个双标记的CaNDR1a版本(HA-CaNDR1a-His)(图5A）在烟草叶中瞬时表达。我们推理的是，如果CANDR1A蛋白在烟草细胞中切割，则应通过没有他特定信号免疫引起的免疫引起的C-末端的丧失，而证明蛋白质被合成的证明将由存在HA特定信号。

两到三天后，用农杆菌属应变，这是专用于HA-CaNDR1a-His构建的表达，蛋白质提取物从新鲜组织通过SDS-PAGE得到解决制备和免疫印迹使用任一HA-或His特异性抗血清中所描述的“方法的部分。免疫印迹条件使用n端ha标记的CaNDR1a (HA-CaNDR1;数字5A)和c端his标记的Bax Inhibitor 1 (BI1-His)版本作为对照。6个独立实验包括独立实验农杆菌属进行渗透和蛋白提取。使用抗ha抗体，在装载NDR1样品的通道中只能检测到一个主要条带(图)5B.，车道3-6)，而加载负控制样本的车道没有显示具体信号(图3-6)5B.1、2和7)HA-CaNDR1a和HA-CaNDR1a，他预测分子量平均为25-26 kDa的蛋白质编码，检测到的蛋白质在变性条件下迁移到大约45 kDa。根据之前的研究，这种明显的差异并不令人惊讶。Coppinger和同事[22.实际上表明，SDS-PAGE解决的天然ATNDR1蛋白显示了约48kDa的质量，而不是预测的24.6kDa。这些作者进一步证明了蛋白质在翻译时恢复理论规模在体外不专用于糖基化的机械，这表明后者的翻译后修饰可以解释成熟蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶迁移移。一致地，CaNDR1a蛋白质，喜欢它的拟南芥在直方图中，显示了大量假定的糖基化位点(图4）.因此，我们可以假设我们的蛋白提取物（图5B.可能含有糖基化形式的CaNDR1a，其迁移行为在聚丙烯酰胺凝胶上发生改变。

最后，使用同一组样本和抗his抗体，我们无法检测到HA-NDR1-His蛋白(图)5B.而BI1-His蛋白(31 kDa)则被清晰地鉴定出来(图4-6)5B.，泳道7）。后一项数据表明CANDR1A在烟叶中被C末端加工，强烈表明通过添加GPI部分来修饰蛋白质。尽管如此，还需要进一步的实验来证实这种假设。

CaNDR1a定位于质膜

间接数据支持了CaNDR1a蛋白与膜的关联:(i)通过添加gpi锚定的潜在翻译后修饰;(ii)位于n端信号肽内的跨膜结构域(图)4)，以及(iii)从烟叶组织中提取瞬时表达的蛋白质时，需要洗涤剂(附加文件)4）.因此，使用ChloroP1.1和PSORTII软件预测CaNDR1a蛋白定位于质膜(PM) [34.，35.］．因此，为了评估其亚细胞定位，我们创建了GFP6翻译融合(图)6)转化为叶表皮烟草细胞根癌土壤杆菌作为载体，并通过共聚焦显微镜（如“中所述）成像方法' 部分）。根据我们的工作假设，独立实验表明了一致的荧光图案，划定了细胞轮廓（图6 b，小组i）。也观察到这种模式（图6 b，图ii)与与mCherry荧光团融合的PM-resident蛋白[36.］．此外，在进一步的实验中，这两种蛋白同时在同一细胞中表达，发现GFP6和mCherry信号在细胞表面有显著的重叠(图)6 b值得注意的是，一些表达gfp6 - candr1a的细胞不仅表现出细胞表面的标记，还表现出内部荧光，类似于er样网状结构，带有更亮的圆点，可以代表高尔基结构(图)6 b第三,面板)。

因为叶表皮烟草细胞具有中央大液泡是压在PM和细胞壁的细胞质车厢，很难缔结单靠我们的显微镜数据基于CaNDR1a的亚细胞定位。为了查明unambigously CaNDR1a的定位，N-末端HA标记CaNDR1a（图的版本5A)在烟叶中瞬时表达，用ha特异性抗血清免疫印迹法直接检测纯化的PM组分是否存在该蛋白。用Laemmli缓冲液直接煮沸农业浸润组织制备的粗提物(CE)的免疫印迹(Immunoblotting)显示HA-CaNDR1a蛋白在植物细胞中成功表达(图)7一个）.最重要的是，CaNDR1a的标记形式在PM馏分相比微粒的，如也用于内源性PM-驻留蛋白PMA2观察被显著富集（图7 b）.此外，当涂上5,10和15μg蛋白质（100.000×G上清液）的刺激时，没有检测到信号，并且随着所载的总蛋白质的量增加，较高的蛋白质（100.000×g上清液）的蛋白质，显然是随着总蛋白质的量增加可视化（图7 c）.综上所述，这些结果表明，成熟的CaNDR1a蛋白在烟草异体系统中靶向PM，进一步表明该蛋白在咖啡细胞中具有类似的亚细胞定位。

咖啡植物中潜在同源RIN4蛋白的鉴定

的拟南芥NDR1蛋白质已经与RIN4都在酵母异源系统证明物理相互作用和在Planta.［24.］．在收获中搜索RIN4序列同源物^©小粒数据库导致从识别候选重叠群Coffea canephora[基因库:DV705409.1]。推导出的蛋白序列与我们的查询序列AtRIN4具有很高的同源性(36/53%)。该区域在RIN4蛋白家族中也是高度保守的(图)8）.在细菌蛋白酶AvrRpt2进入后，允许RIN4水解的两个裂解位点之一拟南芥细胞(25.，37.，38.]也保存在咖啡蛋白中(图8）.与我们之前的数据(图表)一致5，6和7),这在网上分析指向NDR1功能的潜在机械保护拟南芥和咖啡植物。

的拟南芥NDR1.基因座在1990年代后期使用了基于对抵抗抵抗力的前瞻性遗传筛太平洋标准时间菌株DC3000 ::AVRRPT2.［20.，21.］．自那以后，NDR1.通过其他植物种类的序列比较已经发现了同源基因，例如芸苔栗鸟［39.),vitis Vinifera［40］．通过BERT P算法（数据未示出），也可以从GenBank数据库中检索许多序列同源物（11个植物物种内的19个非冗余次数）。但是，根据我们的知识，我们的数据构成了关于功能识别和表征的新报告NDR1.同源物，尽管含有普遍的候选人。

在这项研究中，一些证据确实证明的异位表达CaNDR1a编码序列能够挽救表型拟南芥ndr1-1零变异。DC3000感染后::AVRRPT2.研究发现，表达咖啡转基因的三个突变株出现了突变株所没有的超敏细胞死亡症状(图)3A）.这一宏观研究被两个独立的机构进一步证实在Planta.细菌生长测定，显示我们转基因系中的细菌病原体的叶片均低且与WT植物的叶片（图3B.）.此外，咖啡的高表达水平CaNDR1a基因的Col-0遗传背景也被发现赋予DC3000株增强抗病能力，如以前报道的AtNDR1基因过表达A. Thaliana.［22.］．

重要的是，NDR1驱动阻力A. Thaliana.并不局限于细菌病原体的攻击。两份报告表明NDR1.突变使植物易受卵菌的感染Hyaloperonospora Arabidopsidis.［20.]和真菌黄萎病longisporum［41.］．因此，鉴于（i）CaNDR1a是一个功能性同源物拟南芥NDR1.基因和（II）前者的转录物在咖啡叶中积聚，响应于真菌的人力资源h . vastatrix［16.，19.如果NDR1蛋白能够调控导致咖啡锈病抗性的防御信号通路，这也就不足为奇了。目前，我们实验室正在使用功能性方法对这一假设进行研究。最近，我们也证明了这一点答:芥Col-0植物对h . vastatrix．这种反应使得HR激发，因为它可以防止植物组织中的胰岛质形成和悬垂盐[42.］．这项工作提出了测试NDR1在响应咖啡叶锈病中的作用的可能性A. Thaliana.异源系统。

正如我们的生物信息学分析所预测的，通过共聚焦显微镜对gfp6标记的CaNDR1a蛋白成像，显示出与质膜定位一致的荧光模式(图)6 b,(我))。与PM荧光蛋白标记物共定位实验也支持这一观察(图)6 b(iv-vi))。此外，从烟叶中提取ha标记的CaNDR1a蛋白需要十二烷基硫酸钠等阴离子洗涤剂(附加文件)4）表明与膜结合。最后，我们的生化方法基于PM通过两相PEG /葡聚糖分区纯化（图7B，C）清楚地证明了烟草PM馏分中HA-CANDR1A蛋白的存在。因此，成熟的CANDR1A蛋白可能存在于咖啡细胞的血浆膜中。

在叶绿体中没有观察到与GFP6光谱相对应的细胞器的荧光标记，尽管此前曾报道过AtNDR1的标记版本[27.］．相反，内部网状标签请发加入ER网络（图6 b， (iii))在少数情况下观察到，可能与异位荧光蛋白超载的细胞相对应。这一观察结果与我们的结果一致，表明CaNDR1a蛋白可以通过在其c端添加GPI部分进行修饰(图)5B.）.人们已经很好地描述了通过GPI锚栓连接到细胞表面的蛋白质在被分类之前在ER中经历这种翻译后修饰通过分泌途径到达它们的最终目的地，也就是质膜。

通常，GPI锚定蛋白也被认为定位在质膜的骨质侧上[43.］．在A. Thaliana.，已经明确证实NDR1是通过c端GPI锚点附着在质膜上的[22.］．我们推测NDR1的n端部分位于细胞质内，因为它被发现与胞质蛋白RIN4相互作用在Planta.［24.］．由于AtNDR1的C端锚点能够抵抗磷脂酶C的切割，这些数据进一步导致了该蛋白具有跨膜结构域作为第二个锚点的假设。最近的一项建模研究证实了这一点［44.］事实上，咖啡中的蛋白质拟南芥相对，预计呈现单个跨膜域（图4），建议两个对应物的类似但非典型拓扑（图8 b）.

最近，Knepper揭示了新的NDR1的新作用模式等．［44.］．基于与哺乳动物整合素的结构同源性拟南芥晚期胚胎发生丰富蛋白14，已知参与非生物胁迫反应[45.]，上述作者探讨了AtNDR1通过pm -细胞壁粘连控制细胞完整性的可能性。NDR1除了在病原体攻击过程中作为关键信号成分的作用外，在介导主要细胞功能方面的数据强烈暗示了其更广泛的功能Arabidospsis通过维护PM-Cell壁连接[44.］．从这些意想不到的结果中，出现了一个问题，即CaNDR1a是否可以在c·阿拉比卡．

有趣的是，DC3000接种后::AVRRPT2.，成功激活HR需要NDR1-RIN4的物理作用。使用丙氨酸扫描突变策略进行的进一步研究表明，NDR1 n端有两个氨基酸残基是相互作用所必需的[24.］．尽管在CandR1a结束中明显缺乏保护这两个氨基酸的决定因素（图8 c)，我们的结果表明，咖啡基因能够恢复rps2介导的抗性NDR1-1.突变体倾向于证明在我们的转基因系中CaNDR1a确实与AtRIN4相互作用。因此，这提出了NDR1蛋白发挥其功能的机制可能是保守的拟南芥和咖啡植物。

与这个想法一致的是，在HarvEST中寻找RIN4序列同源物^©小粒数据库导致从识别候选重叠群Coffea canephora．推导的蛋白质在其N末端部分内显示出具有rin4家族的成员的高度保守区域，以及推定的规范AVRRPT2切割位点（图8）.尽管如此，还需要进一步的实验来回答这个问题，即CaNDR1a是否像它一样拟南芥可以作为PM锚点，间接招募r蛋白(s)通过它与类rin4中间体的相互作用(图8 b）[24.，46.］．裂解泛素和酵母双杂交系统结合双分子荧光互补(BiFC)将是解决这一问题的有效工具。与传统的遗传方法相比，这可能是一种更快、更方便的隔离方法R-具有抗性的基因h . vastatrix．迄今为止，没有咖啡R -尽管咖啡研究团体做出了努力，基因还是被分离出来了[3.，4］．影响二倍体咖啡物种与异聚倍数之间的遗传交换的生殖障碍c·阿拉比卡迄今为止，是否成功地隔离了对h . vastatrix透过以地图为基础的克隆策略[4］．

从直系NDR1蛋白质的功能和生化特性c·阿拉比卡我们的研究成果代表着在阐明抗咖啡锈病的分子机制方面迈出了关键的一步。它应该有助于识别咖啡行业的新玩家NDR1.- 在不久的将来依赖信号通路，因此可能对具有广泛频谱抗性的转基因咖啡厂的工程至关重要h . vastatrix比赛。改变和繁殖咖啡品种的有效技术的发展使这些生物技术方法可行的方法[47.，48.］．

植物及生长条件

烟草植物(烟草benthamiana)在温室中培养，浓度为150 μmol/m²/s光照强度，光照周期14/10 h，光照周期23/20°C，相对湿度60%。

野生型拟南芥生态型哥伦比亚(Col-0），NDR1-1.零突变体(20.和转基因系表达CaNDR1a在短日照条件下(光周期10 h, 100 μmol/m²/s光照流畅度)，白天/晚上22/20°C，相对湿度80%。以下将描述病原体的挑战条件。

CaNDR1a/b cDNA的分离与克隆

如前所述[19.]，5'结束CaNDR1被称为DSS12的cDNA已经测序(Genbank:CO773976)。采用3'-RACE PCR法测定全长cDNA的序列。总RNA (1 μg)c·阿拉比卡简历。caturra那些被挑战过的叶子h . vastatrix18小时首次使用Smart CDS引物和RT的Omniscript（QIAGEN，Courtaboeuf，法国）和SMART PCR cDNA合成试剂盒（Clontech公司，山景，CA，USA）的组合反转录。和5'PCR智能引物（;然后RACE测定法使用在5' 非编码区（3R- NDR1，5'- CTACTTTGTTCACTGGTAGTCCCTC-3 'N3R-NDR1，5'- CATAATACTTCACCGGAGAACCACC-3'），设计特异性寡核苷酸进行Clontech公司）。将所得的1-kb的PCR产物克隆到pGEM-Teasy载体（Promega，Charbonnieres的莱班，法国）和最后测序（基因组快速，格勒诺布尔，法国）。

构造

来评估拟南芥null突变体NDR1-1.［20.]， CaNDR1a的开放阅读框被克隆到双载体pCAMBIA 1305.1 (Cambia, Brisbane, Australia)，位于花菜花叶病毒的强组成的35S启动子下游。为了这个目的iud用酶切法将基因从载体中分离BGLII.和BstEII酶。的编码序列CaNDR1a以相应的pGEM-T克隆(GenBank:DQ335596)为模板，用PCR (DAP Goldstar DNA聚合酶，Eurogentec, Seraing, Belgium)扩增，引物如下BglII 5'-TCAGATCTTATGGACAAAGGATGGGC-3'和CANDR1-BSTE.二5“-TAGGTCACCAAATTAATTCCCAGGAAA-3”。将酶切的PCR产物连接到二元载体上，得到最终的构建物。

为了验证CaNDR1a的c端部分从成熟蛋白中移除的假设，我们创建了单标签和双标签结构(图)5）.CaNDR1a根据生产商的说明书，使用高保真度DNA聚合酶进行PCR扩增(pfuturbo.， Stratagene, La Jolla, CA, USA)。下面的引物对分别在PCR产物的5'-和3'-端直接添加血凝素(HA)和多组氨酸(His)序列:CaNDR1-Forward 4,5 '-中国商用飞机有限责任公司ATG TAT CCC TAC GAC GTA CCA GAT TAT ATG TC AGA CCC CAG CAG CAG TGC-3'和CaNDR1-Reverse 3,5 '-CTA ATG GTG ATG GTG ATG GTG CAA CAG CAG AAC CAA GAA A-3'。获得单ha标记版本的引物为CaNDR1-Forward 4和CaNDR1-Reverse 2 (5'-CTA CAA CAG CAG AAC CAA GA-3')。PCR片段亚克隆到pENTR-D/TOPO载体(Invitrogen公司，Cergy Pontoise，法国)并进行测序。为了获得定向克隆，将划线的核苷酸序列添加到正向引物中。选择的克隆经消化MLU.-I与二元载体PMDC32过夜重组前的-I限制酶（R0198L，NEB，Ozyme，Saint Quentin Yvelines，法国）[49.使用LR克隆酶II试剂盒(Invitrogen公司)。

产生n末期GFP6标记版本以检查CANDR1A的亚细胞定位。PCR产物扩增，亚克隆，测序，并与二元载体pMDC43 [重组49.]，如上所述。PCR起始步骤使用的引物如下:CaNDR1-Forward 1,5 '-中国商用飞机有限责任公司ATG TCA GAC CCC AGC AGC AGT-3'和CandR1-Reverse 2.用于在Planta.质膜荧光标记(mCherry-tagged protein)的表达购自俄亥俄州立大学拟南芥生物资源中心(ABRC) (Stock # CD3-1008) [36.］．

最终的二进制结构全部测序（基因组快递）前转变成根癌土壤杆菌通过热休克或电穿孔的方法。用菌株GV3101进行转化拟南芥通过根据浸花植物[50.］．菌株LBA1119用于在烟草植物中瞬时表达实验。

病原菌攻毒和生长曲线测定

的假单胞菌含油PV。番茄（太平洋标准时间） 拉紧DC3000表达细菌效应蛋白AvrRpt2或AvrRps4的同基因菌株由Jane Glazebrook博士(明尼苏达大学)提供[51.］．用于病原体的挑战，细菌过夜，在28℃下轻度振摇在液体特大乙培养基中生长。PST DC3000细菌与利福平（50微克mL的选择^－1）;DC3000::AVRRPT2.和太平洋标准时间DC3000::AVRRPS4.利福平和四环素(10 μg mL^－1）.离心收集细菌，2 × 10重悬⁵CFU毫升^－1在生理水(9 g NaCl/L)中接种。

后代的拟南芥ndr1-1T0植物(ndr1-1: CaNDR1a)，在30 μg mL的半强度Murashige和Skoog培养基上筛选^－1潮霉素。以基因组DNA为模板，通过PCR验证了抗性个体的转化candr1a-特定的引物（Candr1-BglII和CANDR1-BSTE.II）。然后通过在T2 / T3代的旋转霉素抗性植物的偏析下分离纯合单轨迹插入线（附加文件2）.评估NDR1-1.互补，三条独立的T3线条显示不同的表达水平CaNDR1a(指定T3-1, T3-2和T3-3)太平洋标准时间和在Planta.细菌生长，随后在4天的时间内（0，2和4 DPI）。野生型 （哥伦比亚，Col-0） 和NDR1-1.为了比较，还接种了植物。阴性对照用生理水渗透。半叶(6 - 7周龄植物)用1ml无针注射器手浸。他们进行了两个独立的实验，得出了相似的结果。每个实验包括四个重复，每个重复由不同的个体执行。在一个重复中，每个植株基因型(5株/基因型)被水或悬浮液浸渍太平洋标准时间DC3000，太平洋标准时间DC3000::AVRRPT2.或太平洋标准时间DC3000::AVRRPS4.．在渗透后，植物立即被放置在一个覆盖着塑料圆顶的托盘中，在接种24小时后将其移除。细菌的生长情况如下。在每个时间点，收割两片叶子(每株)，用研钵和杵磨碎。将得到的混合物在无菌生理水中连续稀释，并在添加适当抗生素的King B固体培养基上进行电镀。在培养皿上记录两天的细菌数量。接种数据在方差分析前进行平方根变换，然后进行Student-Newman-Keuls多重比较检验。当变换不满足正态性和同方差的假设时，采用非参数Kruskal-Wallis检验。

在使用更高浓度的细菌悬液(2 × 10)的独立实验中，也对超敏反应和疾病症状进行了视觉评估⁷CFU毫升^－1浸润性)。同时收集本实验样本进行RT-qPCR分析。

RNA提取、逆转录和实时定量聚合酶链反应

表达式AtNDR1和CaNDR1a测量方法如前所述[15.]有特定的引物（附加文件5)。[42.］．每个测定以一式两份进行，并包含阴性对照而没有模板。选择强度和组成的肌动蛋白基因（AT3G18780）作为归一化的内部对照。通过分析熔化温度曲线估计扩增的特异性。使用比较循环阈值法进行基因表达量化的计算，如前所述[16.］．

根癌土壤杆菌介导的瞬时表达

10毫升农杆菌属在含有25μgmL的常规Luria-Bertani培养基中，在30℃下在温和摇动下生长过夜。^－1利福平，50 μg mL^－1卡那霉素在必要的时候。次日离心收集细菌。微丸重悬于诱导缓冲液(20 mM MES pH5.5, 10 mM MgSO4, 200 μM acettosyringone)中，使OD值达到最佳_{600 nm.}的浓度达到0.5-0.6。室温孵育3小时后，将菌悬液浸润于腋部烟草benthamiana叶子(4 - 6周的植物)使用无针注射器。收集2-3 dpi的样品用于western blot分析和显微镜观察。每个实验包括一个转化对照，通过渗透一个含a35 s:: uidA内含子构造(52.］．组织化学β-葡糖醛酸酶（GUS）染色根据[53.以x -葡聚糖(5-溴-4-氯-3-吲哚基- d -葡萄糖醛酸)为底物。

通过共聚焦显微镜蛋白质分致化

如在上面部分中描述CaNDR1a的亚细胞定位是通过一个瞬时表达系统来评价。生长过夜的细菌悬浮液（GFP6稠合CaNDR1a和的mCherry融合标记）分别诱导，然后在1混合：渗入烟草叶之前1倍的比例。诱导缓冲液和个人细菌悬浮液也渗入作为对照。两到三天后浸润，叶盘（1.2厘米直径的）从渗透区冲压并直接与LSM观察510元蔡司直立激光扫描共聚焦显微镜（目标C复消色差透镜40X / 1,2-水，488nm的激光和505-530带通滤波器到GFP，543 nm激光和585-615的带通滤波器来的mCherry）。用488nm的激光的元检测器上获得光谱成像。后LAMBDA堆叠500和640纳米，GFP和mCherry的在细胞中的荧光之间共焦显微镜鉴别的，从来自GFP或mCherry的植物（从蔡司发射指纹图谱的方法）叶中获得这些分子的参考光谱的线性分解功能之间采集。通过650纳米的长通滤波器中检测到叶绿素的自发荧光。这些照片被编码为绿色（GFP）或红色（mCherry的）。实验重复5次（每次重复包括每株至少两个渗入的叶和三个独立的工厂）。

质膜净化

为了毫垂纤维地确定CandR1a蛋白的亚细胞定位，HA标记的CANDR1A版本被异常表达N. Benthamiana.叶子在上述条件下。质膜以2 dpi从渗透叶片中制备，并通过PEG/葡聚糖两相分割纯化，如前所述[54.］．通过评估内源性PM驻留蛋白PMA2的富集程度来检测PM组分的纯度。下一节将介绍PMA2的Western blotting条件。

蛋白提取，SDS-PAGE和免疫印迹

通过两步萃取方案分离蛋白质样品。简而言之，在冰冷缓冲液100mm，pH 8.0，TRIS缓冲液（50mL）中磨削冷冻叶组织（1g鲜重），含有1mM乙二胺四乙酸，1mM二硫醇和蛋白酶抑制剂鸡尾酒（1片100ml缓冲液，完整的mini，roche诊断，梅兰，法国）。将混合物以12,000×g在4℃下以12,000×g离心40分钟。根据[蛋白质的上清液浓度55.以BSA为标准。过夜的丙酮沉淀是为了浓缩样品。通过western blot分析，这些包含主要可溶性蛋白的粗提物似乎不包含两个ha标记的CaNDR1版本。然后，在2% (w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)存在的情况下，将微球重悬在400 μL的提取缓冲液中提取单和多异位膜蛋白(附加文件)4）.混合物在70°C水浴中加热15分钟，室温18000 × g离心25分钟。球被丢弃。根据制造商的说明，使用双茚二酮酸测定法(B-9643/C-2284, Sigma-Aldrich, Saint-Quentin-Fallavier，法国)测定上清蛋白的浓度。蛋白样品载于12.5%聚丙烯酰胺凝胶上，用SDS-PAGE进行分离。使用X Cell II™印迹模块(Invitrogen公司)将蛋白通过电印迹转移到硝化纤维素膜(0.45 μm, Hybond, GE Healthcare, Saclay，法国)上进行免疫印迹分析。用庞索S溶液染色，检查蛋白转移是否成功。然后在含有4% (w/v)干牛奶的tris缓冲盐水溶液中(Cat。# 170-6404, Bio-Rad, Marnes-la-Coquette，法国)和0.2% (v/v) Tween 20。用抗ha - hrp (Cat。# A00169, GenScript Corporation, Paris, France) or anti-(His)₅合(猫。# 34460, Qiagen)抗体检测表位标记蛋白。两种抗体均稀释为1:2000。

用作其印迹的蛋白质样品是由污点的阳性对照拟南芥转基因株系组成性过表达c末端his标记的AtBI1 [56.］．种子由美国罗格斯大学农业与环境生物技术中心Eric Lam博士好心提供。按照作者的描述提取蛋白质[56.］．新鲜收获的树叶直接在Laemmli缓冲区研磨[57.， 95°C加热5分钟，离心。得到的上清液用SDS-PAGE分离，并像其他蛋白样品一样印迹。表位标记的AtBI1的预期大小约为31 kDa。

通过SDS-PAGE分解微粒体和血浆膜样品并转移到PVDF膜上，以在与其他蛋白质样品的完全相同的条件下免疫印迹。如上所述进行HA-CANDR1A检测。当用针对PMA2升高的抗体（1：16.000稀释）探测膜[58.[耦合到HRP（猫。＃656120，Invitrogen）的山羊抗兔抗体用作1：2000稀释的二级抗体。为了试验HA-CANDR1A的存在，然后在50℃下在β-巯基乙醇（28mM终浓度）存在下，在电泳SDS-PAGE迁移缓冲液中剥离用PMA2特异性抗血清探测的膜。30分钟．然后用抗HA-HRP抗体阻断膜并再生。

生物信息学分析

在GenBank数据库CaNDR1序列同源物的搜索是由基本的局部比对搜索工具，或BLAST的方式执行的处理27.，可在国家生物技术信息中心(http://ncbi.nlm.nih.gov/）.使用ClustalX算法对序列进行对齐(版本2.0.10)[59.]并在BoxShade服务器上进行在线处理（http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html）.系统发育树使用Phylowin免费软件，使用邻居连接方法[60.］．使用Big-Pi植物预测器(http://mendel.imp.univie.ac.at/sat/gpi/plant_server.html）[30.，31.］．使用SignalP-3.0评估原发性氨基酸序列内的信号肽和跨膜结构域的发生（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）[32.，33.];使用NetNGlyc 1.0预测糖基化位点(http://www.cbs.dtu.dk/services/netnglyc/）.采用免费软件Mwcalc计算蛋白质的理论分子量和等电点(http://sourceforge.net/search/?q=mwcalc.）.利用PSORTII程序预测蛋白质的亚细胞定位[34.］．ChloroP1.1 [35.[还用于检查我们感兴趣的蛋白质中是否存在推定的叶绿体靶向序列。收成^©用于识别咖啡类rin4蛋白的软件可以在网上找到http://harvest.ucr.edu/．

BiFC:

双分子荧光互补

ER：

内质网

美东时间：

表达序列标签

GPI：

糖基 - 磷脂酰肌醇

HIN1:

Harpin诱导的基因1

人力资源:

过敏反应

NDR1:

非小种特异性抗病性1

(美国)全国曲棍球联合会:

NDR1 / HIN1样

PCR：

聚合酶链反应

太平洋标准时间：

假单胞菌含油PV。番茄

R-基因电阻：

-基因

种族：

cDNA末端的快速扩增

RIN4:

RPM1-interacting蛋白质4。

的拟南芥null突变体NDR1-1.是Brian J. Staskawicz博士(加州大学伯克利分校，加州，美国)慷慨的礼物。拟南芥他标记的BAX抑制剂1系是由Eric Lam博士（农业生物技术中心，Rutgers University，New Brunswick，NJ，USA）提供的。构建CD3-1008（MCHerry血浆膜标记）购自拟南芥生物资源中心（俄亥俄州州立大学，俄亥俄州俄亥俄州俄亥俄州）。我们要感谢Jane Glazebrot博士（明尼苏达大学，圣保罗，MN，USA），提供毒性和无毒的菌株假单胞菌含油PV。番茄用于本研究(DC3000，DC3000 :: AvrRpt2和DC3000 :: avrrps4.）.我们感谢博士。Patrick Moreau和Su Melser对显微镜研究的贡献。我们也感谢波尔多成像中心(BIC, Université Bordeaux 2, UMS 3420 CNRS-US4 INSERM, Bordeaux, France)。我们也希望热情感谢Drs马克钻石,和让-吕克·Montillet批判性阅读手稿,以及Drs。Alison D Munson, Mark Diamond和William FJ Parsons担任英文编辑。这项工作得到了法国和巴西之间的双边合作协议(cape - cofecub n°Sv 555/07)的部分支持。我们声明与本研究中引用的任何工作没有利益冲突。

从属关系

1. UMR 186 - IRD / Cirad / UM2RésistanceDesPlantes奥克斯生物农业奥斯·富国（Instutut）倾倒乐··雷托（IRD），64501，Montpellier，Cedex 5,34394，法国

   Jean-Luc Cacas, Anne-Sophie Petitot, Joan Estevan和Diana Fernandez

2. Centre d'Étude de la Forêt, Université Laval, Québec (QC)， G1V 0A6，加拿大

   伯尼尔路易

3. 板式D'histocytologie et d'imageriecellulairevégétale，Biochimie et PhysiologieMoléculairedsplinges-développementet anveloppement etAméliorationdes植物，inra-cnrs-cirad，Ta96 / 02 Avenue Agropolis，蒙彼利埃，34398，法国34398

   GenevièveConejero.

4. Laboratoire de Biogenèse膜aire (LBM)， UMR 5200, CNRS-Université Victor Ségalen，波尔多2号，案例92,146 Rue Léo Saignat，波尔多，Cedex, 33076，法国

   Jean-Luc Cacas & Sébastien Mongrand

相应的作者

对应于戴安娜费尔南德斯．

作者的贡献

JLC＆ASP进行的生物信息学分析;JLC，ASP＆JE进行克隆实验;JLC，SM和GC进行了显微学研究;JLC纯化质膜并进行了蛋白质印迹的方法;JLC，JE，LB＆DF进行病原体接种和在Planta.生长测定;ASP进行了RT-QPCR实验;LB进行了统计分析。JLC，LB＆DF设计/解释了实验。JLC＆DF写了稿件。所有作者阅读并认可的终稿。

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