CYP79D酶有助于茉莉酸诱导的醛肟和其他含氮挥发物的形成GydF4y2Ba红木GydF4y2Ba物种GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

氨基酸衍生的醛肟和腈在植物防御重要的作用。他们是众所周知的，作为构成防御化合物，如氰苷和硫代葡萄糖苷的前体，但也释放昆虫取食后挥发。细胞色素P450单加氧酶（CYP）的CYP79家族催化的醛肟的从相应的氨基酸的形成。然而，大多数CYP79s的特点到目前为止参与氰苷或芥子油苷的生物合成，只有少数已报告负责含氮挥发性生产。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

在这项研究中，我们分析和比较的两个茉莉酸诱导挥发性混合物GydF4y2Ba红木GydF4y2Ba品种，栽培南美作物品种GydF4y2Ba大肠可口GydF4y2Ba和非洲野生物种GydF4y2BaE.鲵GydF4y2Ba．这两个物种都能产生不同的含氮化合物，包括脂肪族醛肟和芳香腈。四个独立GydF4y2BaCYP79GydF4y2Ba基因(两个来自每个物种)在酵母中异质表达和生物化学特征。CYP79D62从GydF4y2Ba大肠可口GydF4y2Ba和CYP79D61和CYP79D60从GydF4y2BaE.鲵GydF4y2Ba显示出广泛的底物特异性GydF4y2Ba体外GydF4y2Ba并将l -苯丙氨酸、l -异亮氨酸、l -亮氨酸、l -色氨酸和l -酪氨酸转化为各自的醛肟。相比之下，来自GydF4y2Ba大肠可口GydF4y2Ba完全接受l -色氨酸为底物。实时荧光定量PCR显示GydF4y2BaCYP79D60GydF4y2Ba,GydF4y2BaCYP79D61GydF4y2Ba,GydF4y2BaCYP79D62GydF4y2Ba在茉莉酸处理GydF4y2Ba红木GydF4y2Ba树叶。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

酶的动力学参数表示GydF4y2Ba体外GydF4y2Ba结合相应基因的表达模式和(GydF4y2BaE / ZGydF4y2Ba)-苯乙醛肟(GydF4y2BaE / ZGydF4y2Ba） - 吲哚-3-乙醛，（GydF4y2BaE / ZGydF4y2Ba）-3- methylbutyraldoxime，和（GydF4y2BaEGydF4y2Ba/GydF4y2BaZGydF4y2Ba）-2- methylbutyraldoxime在茉莉酸处理过的叶子表明CYP79D60，CYP79D61和CYP79D62接受L-苯丙氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸，和L-色氨酸作为底物GydF4y2Ba体内GydF4y2Ba并有助于生产挥发性和半挥发性含氮化合物GydF4y2Ba大肠可口GydF4y2Ba和GydF4y2BaE.鲵GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

植物挥发物在植物与环境的相互作用中起着不同的作用。例如，花朵挥发物可以吸引传粉者，而植物挥发物则参与植物防御，可以直接击退攻击者，也可以间接吸引食草性天敌[GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba–GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba］．植物性挥发物的形成和排放通常是由咀嚼或吮吸食草动物引起的，所产生的挥发物混合物通常含有几十种来自不同类别的天然化合物的物质[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba–GydF4y2Ba9GydF4y2Ba］．虫害诱导挥发共混物一般由萜类和绿叶挥发物（GLVS，C为主GydF4y2Ba_6.GydF4y2Ba醛类，醇类和酯类从脂肪酸裂解得到的），而且还包括芳族化合物，醇，和含氮的氨基酸衍生物[GydF4y2Ba10GydF4y2Ba］．虽然萜烯和glv的形成和生物学作用在过去已经得到了广泛的研究，但我们对食草动物诱导的挥发性混合物的其他成分的了解仍然有限。GydF4y2Ba

营养挥发物如醛肟，腈和硝基化合物含氮被子植物中广泛分布的和从例如已经报道了杨柳科，豆科，茄科，葫芦科，芸香科，蔷薇科，禾本科和[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba］．杨树（杨柳科），例如，释放响应于取食由舞毒蛾脂族醛肟，脂族和芳族腈和芳族硝基化合物的复杂混合物（GydF4y2Ba舞毒蛾GydF4y2Ba)幼虫GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba11GydF4y2Ba,GydF4y2Ba12GydF4y2Ba］．虽然这些含氮挥发物是总混合物的次要成分，但它们可能在杨树的间接和直接防御中发挥重要作用。电生理记录和嗅觉生物分析显示，挥发性醛肟对舞毒蛾的寄生性更有吸引力，而主要萜烯和GLVs [GydF4y2Ba12GydF4y2Ba］．此外，杨树腈被证明对舞毒蛾幼虫有驱避作用，而挥发性和半挥发性醛肟对这些幼虫有毒性作用[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba,GydF4y2Ba13GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

通过CYP79和CYP71 / 736系列的细胞色素P450单氧基酶（CYP）的氨基酸由氨基酸产生氨基酸（最近在[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba]）。CYP79酶接受氨基酸作为底物，并通过两个连续的催化醛肟的形成GydF4y2BaNGydF4y2Ba-hydroxylations，脱水和脱羧反应[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba,GydF4y2Ba16GydF4y2Ba］．形成的醛肟可作为CYP71酶的底物，将其转化为相应的腈[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba］．首先表征的CYP79酶，来自CYP79A1GydF4y2Ba高粱双色GydF4y2Ba，于1995年被Sibbesen和他的同事发现并描述[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba］．它催化从L-酪氨酸的反应GydF4y2BaPGydF4y2Ba-羟基苯乙醛肟，在高粱中进一步转化为氰基葡萄糖苷dhurrin [GydF4y2Ba16GydF4y2Ba］．迄今为止，大多数CYP79酶的特征是产生醛糖醇作为氰苷、硫代葡萄糖苷和其他非挥发性含氮防御化合物的前体，来自两种不同杨树的CYP79酶(CYP79D6v3和CYP79D7v2)GydF4y2Ba杨树trichocarpaGydF4y2Ba从CYP79D6v4GydF4y2BaP. nigra.GydF4y2Ba)据报道是由食草动物诱导的挥发性物质产生的[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba,GydF4y2Ba12GydF4y2Ba,GydF4y2Ba17GydF4y2Ba］．参与生成氰苷和硫代葡萄糖苷的CYP79s通常具有较高的底物特异性，从而决定了整个途径的特异性[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba–GydF4y2Ba21GydF4y2Ba］．相比之下，杨树CYP79D6和CYP79D7具有更广泛的底物特异性，产生挥发性和半挥发性醛肟的复杂混合物[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba,GydF4y2Ba12GydF4y2Ba,GydF4y2Ba17GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

为了扩大我们关于挥发性醛肟和腈的形成的知识，我们现在已经开始调查和比较它们在属中的生物合成GydF4y2BaErythroxylum。GydF4y2Ba两种不同的地理起源和栽培历史，被选为该分析GydF4y2Ba．古柯GydF4y2Ba是一个经济上和药理学重要的作物，因为8000多年栽培的安第斯山脉东部斜坡。GydF4y2BaE. fischeriiGydF4y2Ba与此相反，是原产于非洲的热带雨林野生物种。这两个物种是古柯科的成员，属于像杨树，在不同的顺序金虎尾目。由于已经表明，挥发物的形成可以通过与植物激素茉莉酸（JA）人工处理来诱导（例如，[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba,GydF4y2Ba22GydF4y2Ba]），我们测量并且响应于JA治疗相比挥发性散发物GydF4y2Ba大肠可口GydF4y2Ba和GydF4y2BaE.鲵GydF4y2Ba和检测到的大量的含氮化合物。候选人GydF4y2BaCYP79GydF4y2Ba来自两个物种的分离基因异源然后在酵母中表达和酶鉴定和基因表达分析表明，单独的一个潜在的功能GydF4y2Ba红木GydF4y2Ba挥发性醛肟形成中的CYP79蛋白。GydF4y2Ba

茉莉酸诱导植物体内含氮挥发物的释放GydF4y2Ba古柯GydF4y2Ba和GydF4y2BaE.鲵GydF4y2Ba

许多植物物种对草食的反应是增加JA积累，从而诱导多种植物防御化合物的生物合成，包括含氮挥发物[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba］．因此，研究含氮挥发物的形成GydF4y2Ba红木GydF4y2Ba物种，我们收集和比较的未处理的和JA-处理树枝的挥发性掺合物GydF4y2Ba大肠可口GydF4y2Ba和GydF4y2BaE.鲵GydF4y2Ba．虽然这两种植物都从未处理的枝条释放挥发物，但ja处理显著增加了挥发物的排放(表GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba)．从控制和JA-处理树枝共混物GydF4y2Ba大肠可口GydF4y2Ba和GydF4y2BaE.鲵GydF4y2Ba以单萜为主(例如GydF4y2BaEGydF4y2Ba)、倍半萜(如β-榄香烯和GydF4y2BaE、 EGydF4y2Ba）-α-法呢烯）和homoterpenes（3GydF4y2BaEGydF4y2Ba)-4,8-二甲基壬-1,3,7-三烯（DMNT）和（3GydF4y2BaEGydF4y2Ba，7GydF4y2BaEGydF4y2Ba)-4,8,12-三甲基十三碳-1,3,7,11-四烯（TMTT）。此外，这两种植物都产生大量的含氮挥发物，例如(GydF4y2BaE / ZGydF4y2Ba）-2- methylbutyraldoxime，（GydF4y2BaE / ZGydF4y2Ba)-3-甲基丁基拉尔多肟、苄基氰化物、苯硝基乙烷、一种身份不明的硝基化合物和吲哚对JA治疗的反应（表1）GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba)．作为典型的虫害诱导营养挥发物，绿叶挥发物也存在于JA-诱导GydF4y2Ba大肠可口GydF4y2Ba和GydF4y2BaE.鲵GydF4y2Ba共混物。值得注意的是，这两个物种的JA诱导的挥发性共混物的组合物的定性几乎相同和总释放的挥发物是在相同范围内。然而，有在单间挥发物排放量的主要差异GydF4y2Ba大肠可口GydF4y2Ba和GydF4y2BaE.鲵GydF4y2Ba(表GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba)．而GydF4y2Ba大肠可口GydF4y2Ba，以β-榄香烯为主要倍半萜，并产生少量的GydF4y2BaE、 EGydF4y2Ba) -α金合欢烯,GydF4y2BaE. fischeriiGydF4y2Ba释放大量(GydF4y2BaE、 EGydF4y2Ba)-α-法尼烯，只产生少量β-榄香烯。另一个显著的差异是吲哚，它是一种主要的含氮挥发物GydF4y2Ba大肠可口GydF4y2Ba而是一个小化合物GydF4y2BaE.鲵GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

从CYP79酶识别GydF4y2Ba大肠可口GydF4y2Ba和GydF4y2BaE.鲵GydF4y2Ba

来确定的GydF4y2Ba古柯属CYP79GydF4y2Ba基因，反对的内部454的cDNA序列数据库中搜索TBLASTNGydF4y2Ba大肠可口GydF4y2Ba幼叶组织[GydF4y2Ba24GydF4y2Ba,GydF4y2Ba25GydF4y2Ba的CYP79D6v3的氨基酸序列GydF4y2Ba杨树trichocarpaGydF4y2Ba[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba]作为输入序列。其中一个序列代表CYP79家族推定的P450酶。该基因的扩增产生了两个高度同源的序列，命名为GydF4y2BaCYP79D62GydF4y2Ba和GydF4y2BaCYP79D63GydF4y2Ba根据P450通用命名法(D.R. Nelson, P450命名委员会)。用ja处理后的cDNA进行PCRGydF4y2BaE.鲵GydF4y2Ba使用设计用于放大的底漆对叶子GydF4y2Ba大肠可口GydF4y2Ba序列显示一个附加基因（GydF4y2BaCYP79D60GydF4y2Ba)．为了进一步找出潜在GydF4y2BaCYP79DGydF4y2Ba候选，特定的引物所得到的基因中保守区设计和PCR用的cDNA进行从JA处理制成GydF4y2Ba红木GydF4y2Ba树叶。而大多数得到的扩增产物与GydF4y2BaCYP79D62 CYP79D63,GydF4y2Ba和GydF4y2BaCYP79D60GydF4y2Ba，一个片段从放大GydF4y2BaE.鲵GydF4y2Ba的cDNA表明序列差异和分离全长克隆被指定为GydF4y2BaCYP79D61GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

基序报道在几乎所有的P450酶，例如在N-末端的ProProxxPro基序是保守的，血红素结合位点ProPheGlyxGlyArgArgxCysxGly和ProGluArgPhe基序，可以在所获得的被识别GydF4y2Ba红木GydF4y2BaCYP79序列(图。GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba)．相较于一般P450共有序列[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba]，GydF4y2Ba红木GydF4y2BaCYP79基序表现出CYP79家族的代谢性特征。此外，cyp79特异的AsnPro motif位于拟结合底物的一个位点[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba也发现了GydF4y2Ba红木GydF4y2Ba序列（图GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba)．树图分析表明，GydF4y2Ba红木GydF4y2BaCYP79酶与来自杨树的CYP79D6v3、CYP79D7v2和CYP79D6v4以及来自其他植物的CYP79D酶聚在一起(图2)。GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

测定鉴定物的酶活性GydF4y2Ba红木GydF4y2BaCYP79s基因在GydF4y2Ba酿酒酵母GydF4y2Ba(窟GydF4y2Ba_11GydF4y2Ba）和携带重组蛋白质微粒与氨基酸底物L-苯丙氨酸，L-酪氨酸，L-色氨酸，L-亮氨酸，并且在NADPH存在下作为共底物L-异亮氨酸的电位进行温育。CYP79D63显示窄的底物特异性并且是仅能够接受色氨酸作为底物，将其转化成（GydF4y2BaE / ZGydF4y2Ba） - 吲哚-3-乙醛肟（图GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba)．而CYP79D62、CYP79D60和CYP79D61则接受了所有被测氨基酸，并产生(GydF4y2BaE / ZGydF4y2Ba)-苯乙醛肟(GydF4y2BaE / ZGydF4y2Ba）-GydF4y2BaPGydF4y2Ba-hydroxyphenylacetaldoxime，（GydF4y2BaE / ZGydF4y2Ba） - 吲哚-3-乙醛，（GydF4y2BaE / ZGydF4y2Ba）-3- methylbutyraldoxime，和（GydF4y2BaEGydF4y2Ba/GydF4y2BaZGydF4y2Ba)-2-甲基丁醛肟，分别来自上述氨基酸(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba)．使用来自表达空载体的酵母细胞的微粒体测定法，无NADPH，并用煮沸蛋白测定法测定法显示无活性（数据未示出）。GydF4y2Ba

KGydF4y2Ba_MGydF4y2BaCYP79D60、CYP79D62、CYP79D63不同底物的值如表所示GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba．由于一氧化碳差谱测量失败，我们无法确定微粒体中的蛋白质浓度，从而计算不同底物的周转数。相反，测量了各氨基酸底物1 mM时的相对产物形成(见表)GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba)．对于CYP79D60和CYP79D62，联合用药相对较低GydF4y2BaKGydF4y2Ba_MGydF4y2Bal -苯丙氨酸和l -亮氨酸的含量高，且产物形成率高，表明这些氨基酸是植物的首选底物。而CYP79D63只接受L-Trp作为底物，其酶活性较低GydF4y2BaKGydF4y2Ba_MGydF4y2Ba与CYP79D60和CYP79D61相比(分别为0.48±0.05 mM和2.74±0.11 mM和1.09±0.04 mM)，表明该酶的转化率较低。GydF4y2Ba

基因表达分析GydF4y2Ba古柯属CYP79GydF4y2Ba基因GydF4y2Ba

采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)方法比较两组的转录本积累情况GydF4y2BaCYP79GydF4y2Ba在未处理和ja处理的嫩枝之间的基因GydF4y2Ba大肠可口GydF4y2Ba和GydF4y2BaE.鲵GydF4y2Ba．为了鉴定在我们的实验条件下稳定表达的内参基因，我们分析了一组9个潜在的转录本积累GydF4y2Ba大肠可口GydF4y2BaqRT-PCR内参基因[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba]在未处理和ja处理的叶片中GydF4y2Ba大肠可口GydF4y2Ba和GydF4y2BaE.鲵GydF4y2Ba（附加文件GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba：表S1和S2）。表达的蛋白质Ec6409和网格蛋白衔接复合体亚基Ec11142被选为参考基因的qRT-PCR分析GydF4y2BaCYP79GydF4y2Ba基因GydF4y2Ba大肠可口GydF4y2Ba和GydF4y2BaE.鲵GydF4y2Ba分别基于不同处理之间它们的低Ct值可变性（附加文件GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba：表S1和S2）。在GydF4y2Ba大肠可口GydF4y2Ba,GydF4y2BaCYP79D62GydF4y2Ba与未处理对照相比，经ja处理的枝条中基因表达显著上调(图2)。GydF4y2Ba5AGydF4y2Ba)．相反，转录本的积累GydF4y2BaCYP79D63GydF4y2Ba不受处理的影响(图。GydF4y2Ba5AGydF4y2Ba)．在GydF4y2BaE.鲵GydF4y2Ba,GydF4y2BaCYP79D60GydF4y2Ba和GydF4y2BaCYP79D61GydF4y2Ba被JA治疗（图后两者显著上调。GydF4y2Ba5B.GydF4y2Ba的平均Cq值GydF4y2BaCYP79D61GydF4y2Ba比为平均CQ值高GydF4y2BaCYP79D60GydF4y2Ba在JA处理的叶子（27.4与20.5）中，表明更高的基因表达GydF4y2BaCYP79D60GydF4y2Ba相比GydF4y2BaCYP79D61GydF4y2Ba是治疗后。GydF4y2Ba

醇醛肟、吲哚-3-乙酸和氨基酸在ja处理中的积累GydF4y2Ba红木GydF4y2Ba植物GydF4y2Ba

测试CYP79产物是否在JA处理和未处理的叶片中积累GydF4y2Ba大肠可口GydF4y2Ba和GydF4y2BaE.鲵，GydF4y2Ba我们用液相色谱-串联质谱法分析了叶甲醇提取物。(GydF4y2BaE / ZGydF4y2Ba) -Phenylacetaldoxime, (GydF4y2BaE / ZGydF4y2Ba） - 吲哚-3-乙醛，（GydF4y2BaE / ZGydF4y2Ba）-2- methylbutyraldoxime，和（GydF4y2BaE / ZGydF4y2Ba）-3- methylbutyraldoxime表明相比于未处理的对照显著增加在JA-处理后两个种类的积累（图GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba)．这些醛肟只有微量的可能未经处理的叶片进行检测。值得注意的是，诱导积累（GydF4y2BaE / ZGydF4y2Ba) 2-methylbutyraldoxime和(GydF4y2BaE / ZGydF4y2Ba)-3-甲基丁醛肟与ja处理后的叶片中这些化合物的释放量很好地吻合GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba)．芳香醛肟的缺失(GydF4y2BaE / ZGydF4y2Ba）-phenylacetaldoxime和（GydF4y2BaE / ZGydF4y2Ba)-吲哚-3-乙醛肟的挥发性共混物(表GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba)最可能是由于它们的低挥发性，相比于脂肪族醛肟。与醛肟相比，吲哚-3-乙酸(IAA)是GydF4y2BaE / ZGydF4y2Ba)-吲哚-3-乙醛肟在未经处理和茉莉酸处理的两种植物叶片中组成性产生GydF4y2Ba大肠可口GydF4y2Ba和GydF4y2BaE.鲵GydF4y2Ba（无花果。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

氨基酸如JA-处理过的叶子相对于未处理对照叶潜在CYP79底物的分析表明对L-丙氨酸，L-缬氨酸，L-苏氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸，一个显著感应左旋组氨酸，L-苯丙氨酸，L-色氨酸和L-酪氨酸的GydF4y2Ba大肠可口GydF4y2Ba和对L-丙氨酸，L-Asp和L-谷氨酰胺在GydF4y2BaE.鲵GydF4y2Ba（附加文件GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba:表S3)。GydF4y2Ba

对昆虫食草性的反应产生挥发物似乎是植物防御的一个广泛的部分。食草动物诱导的挥发物可以影响食草动物的摄食或产卵行为，并被描述为吸引食草动物的敌人，如寄生蜂、掠食性节肢动物和食虫鸟类[GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba］．茉莉酸是一种已知参与多种生理过程的植物激素，在触发不同的植物防御反应中起着重要的作用，包括挥发性的形成[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba,GydF4y2Ba28GydF4y2Ba,GydF4y2Ba29GydF4y2Ba]. 因此，纯JA或其衍生物和模拟物通常被用作诱导植物挥发性排放的人工诱导剂[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba,GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba31GydF4y2Ba］．在这项研究中，我们发现，JA也引起复杂的挥发性混合物的在发射GydF4y2Ba大肠可口GydF4y2Ba和GydF4y2BaE.鲵GydF4y2Ba．共混物以萜烯和glv为主，但也含有含氮化合物，如腈苄氰化物、苯基硝基乙烷和一些脂肪族醛醇肟(表1)GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba)．在直接和间接植物防御虫害诱导挥发物含氮的角色最近一直在研究杨树。嗅觉计实验表明，苄基氰化物等两种挥发性腈具有针对舞毒蛾毛虫很强的驱除剂活性，食草动物已知饲料杨树[通才GydF4y2Ba13GydF4y2Ba］．挥发性脂族醛肟被发现是对舞毒蛾幼虫在实验室一个寄生以及田间试验[吸引力GydF4y2Ba12GydF4y2Ba]，以及半挥发性(GydF4y2BaE、 ZGydF4y2Ba)-苯乙醛肟在杨树叶片中植食后积累，降低舞毒蛾幼虫的存活率和增重[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba］．由于在本研究中挥发性脂肪族和芳香醛肟，腈和硝基化合物和半挥发性(GydF4y2BaE、 ZGydF4y2Ba)-苯乙醛肟被发现从两种被调查的物质中释放或累积GydF4y2Ba红木GydF4y2Ba与JA治疗相同的数量订单后的物种如先前报道的草食动物损坏的杨树叶[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba–GydF4y2Ba13GydF4y2Ba，这些化合物可能在植物抵御自然灾害中发挥类似的作用GydF4y2Ba红木GydF4y2Ba食草动物，如GydF4y2BaEloria食GydF4y2Ba和GydF4y2BaEucleodora cocaeGydF4y2Ba或者是切叶蚁GydF4y2BaAcromyrmex sppGydF4y2Ba．[GydF4y2Ba32GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

使用基于同源性的搜索，四个基因具有相似性GydF4y2BaCYP79GydF4y2Ba从其他植物小号可以在识别GydF4y2Ba大肠可口GydF4y2Ba和GydF4y2BaE.Fischeri。CYP79D60GydF4y2Ba和GydF4y2BaCYP79D61GydF4y2Ba从GydF4y2BaE.鲵GydF4y2Ba和GydF4y2BaCYP79D62GydF4y2Ba从GydF4y2Ba大肠可口GydF4y2Ba在JA处理后显著上调(图GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba)，编码的酶具有广泛的底物特异性(图。GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba)．CYP79D60和CYP79D62的动力学参数是在报道的那些先前表征杨树CYP79酶的范围[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba］．虽然GydF4y2BaKGydF4y2Ba_MGydF4y2Ba这些值相对较高，这表明CYP79酶的低底物亲和力已进化为避免植物中游离氨基酸库的可能消耗[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba]. 考虑到GydF4y2BaKGydF4y2Ba_MGydF4y2Ba对于不同底物的转化率和最大速度值（表GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba)， CYP79D60和CYP79D62可能接受l -苯丙氨酸、l -亮氨酸、l -异亮氨酸和l -色氨酸为底物GydF4y2Ba在足底GydF4y2Ba．此外，JA处理后其醛肟产物的积累和排放(见表1)GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba;无花果。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）与（图他们的基因的JA诱导的表达。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba)提示CYP79D62和CYP79D60参与草食动物诱导的醛肟形成GydF4y2Ba大肠可口GydF4y2Ba和GydF4y2BaE.鲵GydF4y2Ba， 分别。醛肟的JA诱导生产可以通过在JA-处理的叶子的相应氨基酸底物的增加的积累（附加文件可以进一步促进GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba：表S1）。由于CYP79D60和CYP79D61高度彼此类似（93％的氨基酸同一性的图。GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba)，差异无显著性GydF4y2Ba体外GydF4y2Ba测定（图GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba），CYP79D61的动力学参数在此研究中没有确定。虽然这可能是CYP79D61具有类似的动力学常数CYP79D60，低表达水平GydF4y2BaCYP79D61GydF4y2Ba相比于JA处理叶子GydF4y2BaCYP79D60GydF4y2Ba表明该酶在醛烯肟的产生中只起次要作用GydF4y2BaE.鲵GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

CYP79D60、CYP79D61、CYP79D62可能参与植物防御，但CYP79D63的生物学功能尚不清楚。与其他三种酶相比，CYP79D63只接受l -色氨酸作为底物(图。GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba). 与CYP79D60、CYP79D61和CYP79D62相比，CYP79D63对L-色氨酸的亲和力更高（表1）GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba); 然而，较低的相对产物形成表明这种酶的周转率较低。由于基因表达不受JA处理的影响，CYP79D63不太可能有助于草食动物诱导的基因积累(GydF4y2BaE、 ZGydF4y2Ba） - 吲哚-3-乙醛。在许多工厂，转换（GydF4y2BaE、 ZGydF4y2Ba)-吲哚-3-乙醛肟转化为相应的酸被认为是形成生长素的另一种途径[GydF4y2Ba33GydF4y2Ba–GydF4y2Ba36GydF4y2Ba]，因此可以想象CYP79D63可能产生(GydF4y2BaE、 ZGydF4y2Ba） - 吲哚-3-乙醛作为前体在叶子或其它生长的植物部分组成生长素形成GydF4y2Ba大肠可口GydF4y2Ba．之间的全面关系GydF4y2BaCYP79D63GydF4y2BaCYP79D63基因在植物不同器官和不同发育阶段的表达和生长素的积累可能有助于阐明其在生长素形成中的潜在作用。GydF4y2Ba

作为驯化的结果，许多农作物与野生植物相比，次生化合物的含量发生了变化[GydF4y2Ba37GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba大肠可口GydF4y2Ba，例如，已被栽培了数千年，并被选择用于高水平生产药理活性莨菪碱可卡因[GydF4y2Ba38GydF4y2Ba］．这种栽培品种的叶子中含有的可卡因比近亲野生品种多20-100倍[GydF4y2Ba39GydF4y2Ba］．虽然育种家控制着对高水平生产有用化合物或低水平生产不需要化合物的选择，但驯化也可能产生未被识别和不需要的副作用。非活性等位基因的积累(GydF4y2BaEGydF4y2Ba)-β-石竹烯合成酶在北美玉米育种过程中导致(GydF4y2BaEGydF4y2Ba）-β-石竹烯生产在大多数这些线中的[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba］．(GydF4y2BaEGydF4y2Baβ-石竹烯通常以挥发性的形式从被食草动物破坏的玉米叶片和根系中释放出来，并已被证明参与了地上和地下不同的间接防御反应[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba–GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba］．在这项研究中我们证明了这一点GydF4y2Ba大肠可口GydF4y2Ba和GydF4y2BaE.鲵GydF4y2BaJA处理后，积累和释放相同数量的醛肟、腈和硝基化合物，表明驯化并没有改变栽培植物的这些防御反应GydF4y2Ba大肠可口GydF4y2Ba. JA中其他单一化合物之间的数量差异是否会导致GydF4y2Ba大肠可口GydF4y2Ba和GydF4y2BaE.鲵GydF4y2Ba物种是特定的还是繁殖的结果GydF4y2Ba大肠可口GydF4y2Ba，目前还不清楚。GydF4y2Ba

食草动物诱导的挥发性混合物通常非常复杂，含有几十种物质。然而，这种复杂性背后的酶机制往往是惊人的简单，只包括少数具有广泛底物和/或产品特异性的酶。例如，萜烯合成酶是萜烯生物合成的关键酶，可以从一个底物中产生多达50种化合物的混合物[GydF4y2Ba44.GydF4y2Ba]. 此外，据报道，参与挥发性酯形成的甲基转移酶和酰基转移酶可接受多种底物[GydF4y2Ba31GydF4y2Ba,GydF4y2Ba45.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba46.GydF4y2Ba]. 挥发性产生酶在底物和/或产物特异性方面的这种混乱似乎是一种普遍现象，它使植物能够仅用有限数量的酶有效地产生大量不同挥发性物质的混合物。混合物在植物防御方面可能具有特殊优势[GydF4y2Ba47.GydF4y2Ba］．最近，我们发现与挥发性醛烯肟形成相关的两种杨树CYP79s与之前描述的所有其他CYP79s相比也表现出广泛的底物特异性[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba］．的GydF4y2Ba红木GydF4y2Ba酶，其特征在于在该研究代表了具有广泛的底物特异性CYP79s第二示例并且因此是诱人的推测，这样的乱可能是用于形成虫害诱导挥发CYP79s的一般特征。然而，仍然需要对来自不同植物科挥发性醛肟产生CYP79酶进一步的研究来证实这种判断和理解广泛的底物特异性的进化和结构上的原因这种酶类。GydF4y2Ba

植物材料和植物处理GydF4y2Ba

种子GydF4y2Ba古柯GydF4y2Bavar.GydF4y2Ba可口GydF4y2Ba从德国波恩植物园获得，并在无菌盆栽土壤中发芽。活的植物GydF4y2BaE.鲵GydF4y2Ba在肯尼亚收集，然后运到MPICE。植株在22℃、光照/黑暗12 h、湿度分别为65%和70%的生长室中生长，每周施肥一次Ferty 3(15-10-15)和Wuxal Top N (Planta Düngemittel, Regenstauf, Germany)。的培养GydF4y2Ba大肠可口GydF4y2Ba获得了Bundesinstitut für Arzneimittel and Medizinprodukte (BfArM)的授权(许可号:BtM 4515971)。GydF4y2Ba

对于茉莉酸（JA）处理，JA（100毫克/毫升乙醇）在自来水中稀释至200μM的终浓度。乙醇稀释在自来水中以同样的方式和作为对照。从每个GydF4y2Ba大肠可口GydF4y2Ba工厂(GydF4y2BaNGydF4y2Ba = 4） ，切下四根约15–20 cm长的细枝，并立即放入含有JA（两根细枝）或对照溶液（其他两根细枝）的玻璃烧杯中。对于GydF4y2BaE.鲵GydF4y2Ba，从每株植物上剪下两条约20厘米长的小枝(GydF4y2BaNGydF4y2Ba = 3) and only one twig was used per treatment. Twigs were left in JA or control solution overnight for 18 h before the volatile collection.

挥发性物质的收集和分析GydF4y2Ba

挥发性收集是在上述条件下的生长室中进行的。玻璃烧杯盛有GydF4y2Ba红木GydF4y2Ba树枝分别放到3个玻璃干燥器，其被紧紧地关闭。净化的空气泵入干燥器以0.5升min的速率GydF4y2Ba^{－1GydF4y2Ba}(ARS, Inc.， Gainesville, FL, USA)通过装有30毫克Super-Q的过滤器与植物接触并离开容器。收集挥发物5 h(上午9时至下午2时)。采集后，立即将植物材料冷冻在液氮中，以便进一步分析。以含乙酸壬酯的100 μl二氯甲烷(10 ng μl)作为内标洗脱2次，去除挥发性化合物GydF4y2Ba^{－1GydF4y2Ba})．GydF4y2Ba

使用Agilent 6890系列气相色谱仪(Agilent Technologies GmbH, Waldbronn, Germany)与Agilent 5973四极质量选择检测器(界面温度，270°C;四极温度，150°C;源温度230°C;电子能，70 eV)或火焰离子化检测器(FID)工作在300°C。采用ZB-WAX色谱柱(Phenomenex, Aschaffenburg, Germany, 60 m × 0.25 mm × 0.15 μm)和He (MS)或H (H)对挥发物进行了分离GydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba（FID）作为载气。将样品（1μL）中的溶液在40℃的初始温度，而不分割喷射。将温度保持2分钟，然后以5℃每分钟的梯度增加至225℃GydF4y2Ba^{－1GydF4y2Ba}，保持2分钟，然后进一步提高到250°C, 100°C minGydF4y2Ba^{－1GydF4y2Ba}保持1分钟。GydF4y2Ba

化合物通过的保留时间比较和质谱的那些购自Fluka（德国Seelze），罗斯（卡尔斯鲁厄，德国），西格玛（圣路易斯，MO，USA）获得的真实标准标识，并且Bedoukian（丹伯里，CT，USA），或在标准和技术库的威利和国家研究所参考光谱。基于相对于内标物的面积其FID峰面积测定的所有化合物的绝对量。GydF4y2Ba

植物组织取样，RNA提取和逆转录GydF4y2Ba

红木GydF4y2Ba在挥发收集后立即收获叶片，用液氮闪蒸，并在-80℃下储存直至进一步加工。在将液氮中的冷冻叶片研磨到细粉中，根据制造商的说明，使用Invitap Spin植物RNA套件（Stratec，Berlin，Germany）分离出总RNA。使用分光光度计（Nanodrop 2000c，Thermo Sciencific，Wilmington，De，USA）和Agilent 2100生物分析仪评估RNA浓度，纯度和质量。RNA用涡轮连接（Thermofisher Scientific）进行处理，GydF4y2Bahttps://www.thermofisher.comGydF4y2Ba)先于cDNA合成。用SuperScript从1 μg经dnase处理的RNA中制备单链cDNAGydF4y2Ba^TMGydF4y2BaIII逆转录酶和寡核苷酸(dTGydF4y2Ba_{12-18GydF4y2Ba})引物(Invitrogen公司，美国加州卡尔斯巴德)。GydF4y2Ba

鉴定及异种表达GydF4y2BaCYP79GydF4y2Ba基因GydF4y2Ba

TBLASTN搜索的内部454 cDNA测序数据库GydF4y2Ba大肠可口GydF4y2Ba带有CYP79D6v3的嫩叶组织GydF4y2Ba杨树trichocarpaGydF4y2Ba（GenBank登录AHF20912.1）作为输入序列揭示了与相似植物CYP79s一个序列。全长基因被命名为GydF4y2BaCYP79D62GydF4y2Ba根据通用P450命名法（D.R.Nelson，P450命名委员会），并可从JA处理的叶片获得的cDNA中扩增GydF4y2BaE古柯。GydF4y2BaPCR产物克隆到测序载体PCR中GydF4y2Ba^®-GydF4y2Ba钝II-TOPOGydF4y2Ba^®GydF4y2Ba（Invitrogen）和两条链采用Sanger方法完全测序。几个克隆的测序揭示第二GydF4y2BaCYP79GydF4y2Ba被命名为GydF4y2BaCYP79D63GydF4y2Ba．利用设计的引物扩增GydF4y2Ba大肠可口CYP79GydF4y2Ba基因，一个GydF4y2BaCYP79GydF4y2Ba序列可从cDNA中扩增从JA处理制成GydF4y2BaE.鲵GydF4y2Ba树叶 （GydF4y2BaCYP79D60GydF4y2Ba)．为了进一步找出潜在GydF4y2BaCYP79DGydF4y2Ba候选，特定的引物所得到的基因中保守区设计和PCR用的cDNA进行从JA处理制成GydF4y2Ba红木GydF4y2Ba树叶。而大多数得到的扩增产物与GydF4y2BaCYP79D62 CYP79D63,GydF4y2Ba和GydF4y2BaCYP79D60GydF4y2Ba，一个片段从放大GydF4y2BaE.鲵GydF4y2BacDNA序列出现差异。通过RacePCR获得全长克隆，编号为GydF4y2BaCYP79D61GydF4y2Ba．引物序列信息在附加文件中给出GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba：表S4。GydF4y2Ba

对于异源表达GydF4y2Ba酿酒酵母GydF4y2Ba，完全开放阅读框GydF4y2BaCYP79D62GydF4y2Ba,GydF4y2BaCYP79D63GydF4y2Ba,GydF4y2BaCYP79D61GydF4y2Ba,GydF4y2BaCYP79D60GydF4y2Ba克隆到pESC-Leu2d载体[GydF4y2Ba48.GydF4y2Ba] 作为GydF4y2Ba没有GydF4y2BatI /GydF4y2Ba囊GydF4y2Ba我碎片。将所得构建体转移到GydF4y2Ba酿酒酵母GydF4y2Ba应变WAT11 [GydF4y2Ba49.GydF4y2Ba]，取单个酵母菌落接种含30 mL无亮氨酸SC最低培养基(6.7 g L .GydF4y2Ba^{－1GydF4y2Ba}酵母氮基（不含氨基酸，但含硫酸铵）。其他成分：100毫克升GydF4y2Ba^{－1GydF4y2Ba}l -腺嘌呤、l -精氨酸、l -半胱氨酸、l -赖氨酸、l -苏氨酸、l -色氨酸和尿嘧啶;50毫克LGydF4y2Ba^{－1GydF4y2Ba}l -天冬氨酸、l -组氨酸、l -异亮氨酸、l -蛋氨酸、l -苯丙氨酸、l -脯氨酸、l -丝氨酸、l -酪氨酸、l -缬氨酸;20 g LGydF4y2Ba^{－1GydF4y2Ba}d葡萄糖。将培养物在28℃和180rpm下生长过夜。起始培养物（约之一OD 2×10GydF4y2Ba^7.GydF4y2Ba细胞毫升GydF4y2Ba^{－1GydF4y2Ba})接种100 mL YPGA全培养基(10 g L .GydF4y2Ba^{－1GydF4y2Ba}酵母提取物，20 g LGydF4y2Ba^{－1GydF4y2Ba}细菌用蛋白胨，74毫克的LGydF4y2Ba^{－1GydF4y2Ba}腺嘌呤半硫酸酯，20 g LGydF4y2Ba^{－1GydF4y2Ba}d-葡萄糖，其中生长32-35小时（直到OD约5）），通过加入半乳糖诱导和另一个15-18ħ培养。离心培养物（7500GydF4y2BaGGydF4y2Ba， 10分钟，4℃)，倒出上清，细胞颗粒重悬于30 mL TEK缓冲液(50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, 100 mM KCl)，再次离心。然后，将微丸重悬于2 mL TES缓冲液(50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, 600 mM山梨糖醇，10 g L)中GydF4y2Ba^{－1GydF4y2Ba}牛血清V蛋白和1.5 mM β-巯基乙醇)，转移到50 mL锥形管中。加入玻璃珠(直径0.45-0.50 mm, Sigma-Aldrich Chemicals, Steinheim, Germany)，使它们充满了细胞悬浮液的全部体积。用手摇1分钟，然后用冰冷却1分钟，循环5次，破坏酵母细胞壁。用5 mL TES洗涤玻璃珠4次，回收粗提物。将混合洗涤馏分(7500GydF4y2BaGGydF4y2Ba，10分钟，4℃），并将上清液转移至另一管中并再次离心（100000GydF4y2BaGGydF4y2Ba， 60分钟，4°C)。使用玻璃均质器(Potter-Elvehjem, Fisher Scientific, Schwerte, Germany)在2ml TEG缓冲液(50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 30% w/v甘油)中均质所得微粒体蛋白组分。等价物储存在-20°C。GydF4y2Ba

重组CYP79的分析GydF4y2Ba

要确定的底物特异性GydF4y2Ba红木GydF4y2BaCYP79酶、酵母重组蛋白质微粒体窝藏孵化了30分钟25°C和300 rpm分别与潜在的基质L-Phe, L-Val, L-Leu, L-Ile L-Tyr, L-Trp玻璃小瓶包含300μL反应混合物(75毫米钠磷酸盐缓冲剂(pH值7.0),1毫米衬底(浓度变量KGydF4y2Ba_MGydF4y2Ba测定)、1 mM NADPH和10 μL制备的微粒体)。反应产物用LC-MS/MS分析如下。GydF4y2Ba

对K的测定GydF4y2Ba_MGydF4y2Ba加300 μL甲醇后，置于冰上停止测定。选择酶浓度和培养时间，使反应速度在培养时间内呈线性。GydF4y2Ba

QRT-PCR分析GydF4y2Ba

如上所述和1:10稀释用水制备的cDNA。为了放大GydF4y2BaCYP79DGydF4y2Ba引物Tm≥60°C, GC含量在40 - 55%之间，引物长度在20 - 25nt之间(见附加文件)GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba:表S4为初级信息)。通过琼脂糖凝胶电泳、熔融曲线分析、标准曲线分析和克隆PCR扩增物序列验证，确定引物特异性。引物对效率的测定采用标准曲线法，cDNA序列稀释5倍，引物对效率在97 ~ 104%之间。使用Brilliant对样本进行了三次重复运行GydF4y2Ba^®GydF4y2Ba三世SYBRGydF4y2Ba^®GydF4y2BaGreen QPCR Master Mix (Stratagene, Carlsbad, CA, USA)。所有反应均采用以下PCR条件:95℃初始孵育3 min，扩增40个循环(95℃5 s, 60℃10 s)。在每个循环的退火和延伸步骤中取板reads。融化曲线的数据记录在60°C至95°C的循环结束时。GydF4y2Ba

所有样品均在光96孔板同一PCR机器上运行（Bio-Rad公司CFX管理器3.1，Bio-Rad公司实验室，赫拉克勒斯，CA，USA）。三 （GydF4y2BaE.鲵GydF4y2Ba）或四个（GydF4y2Ba大肠可口GydF4y2Ba)在qRT PCR中，对三种处理中的每种处理的生物重复进行三次分析。GydF4y2Ba

醇醛肟、氨基酸和生长素的LC-MS/MS分析GydF4y2Ba

为了确定氨基酸和醛肟浓度，100毫克的植物粉末与1毫升甲醇萃取。对于氨基酸的测定中，将甲醇萃取液以1:10稀释用水，并用掺入GydF4y2Ba^13GydF4y2BaCGydF4y2Ba^15GydF4y2BaN标记氨基酸(藻类氨基酸)GydF4y2Ba^13GydF4y2BaCGydF4y2Ba^15GydF4y2BaN，ISOTEC，Miamisburg的，OH，USA）以10微克每毫升的混合物的浓度。在MeOH中稀释提取物氨基酸通过LC-MS / MS直接分析作为最近描述[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

使用Agilent 1200高效液相色谱系统与API 5000串联质谱仪(Applied Biosystems, Darmstadt, Germany)从甲醇提取物中测定醛肟。采用Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱(50 × 4.6 mm, 1.8 μm, Agilent Technologies)，以甲酸(0.2%)水溶液和乙腈为流动相;洗脱图谱为:0-4 min, 10 - 70% B;4-4.1 min, 70 - 100% B;4.1-5 min 100% B和5.1-7 min 10% B，流速1.1 mL minGydF4y2Ba^1GydF4y2Ba．API 5000串联质谱计工作在正电离模式下(离子喷雾电压，5500 eV;涡轮气体温度，700°C;雾化气体，60 psi;帘气，30 psi;加热气体，50 psi;碰撞气体，6psi)。MRM用于监测每种分析物的前体离子→产物离子反应如下:GydF4y2Bam / z.GydF4y2Ba136。0 → 119.0 (collision energy (CE), 17 V; declustering potential (DP), 56 V) for phenylacetaldoxime;m / z.GydF4y2Ba102.0 → 69.0 (CE, 13 V; DP, 31 V) for 2-methylbutyraldoxime;m / z.GydF4y2Ba102 → 46.0（CE，15伏；3-甲基丁基氧肟的DP，31 V）；GydF4y2Bam / z.GydF4y2Ba175。0 → 158.0 (CE, 17 V; DP, 56 V) for indole-3-acetaldoxime andm / z.GydF4y2Ba152.0→107.0 (ce, 27 v;DP, 100v)GydF4y2BaPGydF4y2Ba-hydroxyphenylacetaldoxime。醛醇肟的浓度由文献中合成的真实标准品制成的外标准曲线测定[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

吲哚-3-乙酸（IAA）分析如下：将100mg植物粉末与300μL的MeOH提取，提取液的200μL稀释1:10用含有0.1％甲酸的水并装载到平衡Chromabond®HR-X聚丙烯柱（45微米，马歇雷纳格尔，Düren的，德国）。该柱用酸化水。含有植物生长素的级分用1级毫升乙腈中，然后在氮气流中干燥洗脱。将样品在30微升的MeOH再溶解并随后通过相同的LC-MS / MS系统进行分析，如上所述。分离是在Agilent XDB-C18柱（50毫米×4.6，1.8微米）进行。洗脱剂A和B是含有水0.05％甲酸和乙腈，分别。洗脱模式是：0-0.5分钟，在有5％B;0.5-4.0分钟，5-50％B;4.1-4.5分钟100％B和4.6-7分钟5％B.流速设定为1.1毫升分钟GydF4y2Ba^{－1GydF4y2Ba}．API 5000串联质谱仪的工作模式为正电离模式(离子喷雾电压，5500 eV;涡轮气体温度，700°C;雾化气体，60 psi;帘气，30 psi;加热气体，50 psi;碰撞气体，6psi)。IAA的MRM转换和参数设置如下:GydF4y2Bam / z.GydF4y2Ba(ce, 19 v;通过添加已知量的植物提取物测定IAA浓度GydF4y2Ba^2.GydF4y2BaHGydF4y2Ba_5.GydF4y2Ba-IAA（OlChemIm有限公司，奥洛穆茨，捷克共和国）。GydF4y2Ba

序列分析和系统发育树构建GydF4y2Ba

的对齐GydF4y2Ba古柯属CYP79GydF4y2Ba基因和特征GydF4y2BaCYP79GydF4y2Ba来自其他植物的基因是使用肌肉（密码子）算法（gap open，-2.9；差距扩大，0；疏水倍增器，1.5；聚类方法（upgmb）在MEGA6中实现[GydF4y2Ba50.GydF4y2Ba］．基于翻译后的MUSCLE密码子比对，采用相邻连接算法(model/method, JTT模型;取代型，氨基酸;站点之间的比率，统一的比率;空白/缺失数据处理，部分删除;场地覆盖率截止，80%)。采用1000个重复的自举重采样分析来评估树形拓扑结构。GydF4y2Ba

统计分析GydF4y2Ba

在基因表达，挥发性散发物，和醛肟，生长素的累积差异，和茉莉酸诱导的和未处理的对照植物之间氨基酸与秩和检验秩和检验用于分析GydF4y2Ba大肠可口GydF4y2Ba和GydF4y2BaE.鲵GydF4y2Ba分别作为R版本3.1.1 [GydF4y2Ba51.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

加入数据GydF4y2Ba

本文中基因的序列数据在GenBank中可以找到:CYP79D60 (KX344462)、CYP79D61 (KX344460)、CYP79D62 (KX344463)、CYP79D63 (KX344461)。GydF4y2Ba

CYP:GydF4y2Ba

细胞色素P450单加氧酶GydF4y2Ba

杰:GydF4y2Ba

绿叶不稳定GydF4y2Ba

是:GydF4y2Ba

茉莉酸GydF4y2Ba

存在:GydF4y2Ba

定量实时PCRGydF4y2Ba

DMNT:GydF4y2Ba

（3GydF4y2BaEGydF4y2Ba）-4,8-​​ dimethylnona -1,3,7-三烯GydF4y2Ba

TMTT：GydF4y2Ba

（3GydF4y2BaEGydF4y2Ba，7GydF4y2BaEGydF4y2Ba) 4 8 12-trimethyltrideca-1 3 7 11-tetraeneGydF4y2Ba

我们感谢Tamara Krügel和所有MPI-CE园丁的帮助GydF4y2Ba红木GydF4y2Ba植物。此外，我们感谢来自肯尼亚内罗毕大学帕特里克Chalo Mutiso收集和运输GydF4y2Ba古柯属鲵GydF4y2Ba植物。GydF4y2Ba

资金GydF4y2Ba

这项研究由马克斯·普朗克学会资助。GydF4y2Ba

数据和材料的可用性GydF4y2Ba

所有支持数据都包含在附加文件中。本研究中描述的结构和当前研究中分析的数据集可根据要求从通信作者处获得。序列保存在GenBank中GydF4y2Ba方法GydF4y2Ba部分）。GydF4y2Ba

作者的贡献GydF4y2Ba

JJ，SI，JG和TGK设计的研究。KL，JJ，SI和TGK开展了试点工作。MH和TGK分析数据。TGK写的稿子。所有作者阅读并认可的终稿。GydF4y2Ba

相互竞争的利益GydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。GydF4y2Ba

同意出版GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

1. 马普学会化学生态学，汉斯·诺尔 - 大街8，d-07745，德国耶拿GydF4y2Ba

   Katrin Luck, Jan Jirschitzka, Sandra Irmisch, Meret Huber, Jonathan Gershenzon & Tobias G. KöllnerGydF4y2Ba

2. 目前地址:德国亚琛Forckenbeckstrasse 6, D-52074 Fraunhofer分子生物学与应用生态研究所IMEGydF4y2Ba

   Jan JirschitzkaGydF4y2Ba

3. 现在住址：迈克尔史密斯实验室，温哥华不列颠哥伦比亚大学，加拿大GydF4y2Ba

   桑德拉IrmischGydF4y2Ba

相应的作者GydF4y2Ba

对应于GydF4y2Ba托比亚斯G.KöllnerGydF4y2Ba．GydF4y2Ba

开放获取GydF4y2Ba本文根据知识共享署名4.0国际许可的条款分发(GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba）如果您向原始作者和源给出适当的信用，则允许在任何介质中进行不受限制的使用，分发和再现，提供指向Creative Commons许可证的链接，并指示是否进行了更改。Creative Commons公共领域奉献豁免（GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba)适用于本条提供的数据，除非另有说明。GydF4y2Ba

重印和权限GydF4y2Ba