拟南芥和角藻核仁中pilio rna结合蛋白结构和功能的异同轮藻最纯粹

背景

Pumilio RNA结合蛋白在整个真核生物中进化保守，并参与细胞质中的RNA衰变、运输和翻译抑制。虽然大多数Pumilio蛋白在细胞质中起作用，但已有报道称两种核仁形式在拟南芥的rRNA加工中起作用。属的种轮藻被认为与陆生植物关系最密切，因为它们与现代胚胎植物有几个共同特征。

结果

在本研究中，我们鉴定了两个推定的核仁Pumilio蛋白基因，即，ChPUM2和ChPUM3的转录组轮藻最纯粹．ChPUM2与拟南芥APUM23的氨基酸序列最相似(同源性为27%，同源性为45%)，预测的蛋白质结构与拟南芥APUM23最相似;ChPUM3与APUM24相似(同源性为35%，同源性为54%)。的瞬态表达式35 s: ChPUM2-RFP和35 s: ChPUM3-RFP在烟草叶片细胞中显示融合蛋白的核仁定位，表达类似于35 s: APUM23-GFP和35S：APUM24-GFP．而且，35 s: ChPUM2补充了形态上的缺陷apum23表现型，但不是apum24,而35 s: ChPUM3不能补充apum23和apum24突变体。同样，35 s: ChPUM2 / apum23植物救出了前rRNA加工缺陷apum23,但35 s: ChPUM3 / apum24^+/-植物也没能挽救生命apum24．与这些互补结果一致的是，APUM23的18S rRNA (5 ' -GGAAUUGACGG)末端有一个已知的靶rna结合序列在拟南芥中被保守c .最纯粹而APUM24的ITS2 pre-rRNA靶区长156 ntc .最纯粹而不是答:芥．此外，预测CHPUM2和APUM23具有几乎相同的结构，但CHPUM3和APUM24在第5个C末端PUF RNA结合结构域中具有不同的结构，其在CHPUM3中具有比APUM3更长的随机线圈。

结论

ChPUM2的c .最纯粹在拟南芥中具有类似APUM23的功能，但ChPUM3在拟南芥中不能替代APUM24。蛋白同源性建模显示APUM23和ChPUM2的覆盖度较高，但APUM24和ChPUM3的结构存在差异。拟南芥中一个短ITS2的pre-rRNA可能与ChPUM3本身的蛋白质结构一起，阻断ChPUM3与3 ' -extended 5.8S pre-rRNA的结合。

Pumilio蛋白是一类rna结合蛋白，在真核生物中进化保守[1］．典型的Pumilio蛋白有8个Puf结构域串联重复，识别8个RNA碱基，每个Puf结构域包含35-39个氨基酸，形成3个α-螺旋结构[2，3.］．这些蛋白质的RNA识别的基础是新月形结构[4，5］．在新月形结构的凹面上保守的芳族和碱性氨基酸与RNA相互作用，而凸侧的氨基酸与伴侣蛋白相互作用。虽然Pumilio蛋白质具有多种生物作用，但它们的主要分子函数是mRNA衰减和定位，平移抑制[6，7， rRNA处理[8］．大多数Pumilio蛋白质在细胞质中局部化，并且参与mRNA的后术语调节。然而，这些蛋白质的小子集局部化在核仁中并参与RRNA加工。例如，酵母的核仁NOP9 [9]和锥虫的TbPUF7 [8通过适当的预抗RRNA加工参与18S rRNA生物合成和核糖体成熟。在植物中，两种核碱蛋白质涉及rRNA加工[10，11，12，13，14，15]，包括Arabidopsis Apum23，酵母NOP9的同源物，APUM24，人PUF-A和酵母PUF6的同源物。APUM23不仅需要正常生长图案，例如叶片开发和器官极性[10，16]但也参与了ABA信令[17］．APUM24对于植物开发至关重要，因为其纯合突变体显示胚胎杀伤性[15］．APUM24参与5.8S和25S rnas的成熟，APUM23参与18S和5.8S rnas的加工。

Pre-rRNA是一种长单链RNA，由核仁中的rDNA重复序列转录而成。该转录本随后通过核糖核酸内溶解活性裂解为3种成熟的rrna (5.8S、18S和25S) [18，19］．在rRNA处理期间产生的错误加工RRNA副产物在5'-to-3'和3'-to-5'的外核酸核酸活性降解。这两个预rRNA加工活动需要额外的辅助蛋白，例如RNA外出组分，Pumilio蛋白和许多RNA结合蛋白。据报道，拟南芥和水稻显示出类似的预rRNA加工途径，可能是由于ITS1中A2和A3的endocleavage位点周围的类似侧翼序列20.，提示RNA结合特异性对切割位点的选择至关重要。最近，APUM23被发现在18S rRNA的1141-1151位结合11 nt [12] AND和APUM24与包含5.8s和ITS2区域的RRNA段相互作用[15］．因此，APUM23和APUM24可能在拟南芥18S和5.8S rnas成熟过程中靶RNA序列的募集和相互作用蛋白中发挥了关键作用。

大约4.5亿年前，陆地植物从淡水中生活在淡水中，适应陆地环境[21，22，23，24］．轮藻门与有生命的陆地植物有许多相同的分子和生理特征，而这些特征在绿藻门中是找不到的[25，26］．轮藻在质体上与陆生植物具有高度的序列相似性ATPB.和:，线粒体NAD5.，核编码的小亚基rRNA基因[27］．

在本研究中，我们发现所有的绿色植物(Viridiplantae)都有两个假定的核仁Pumilio蛋白与拟南芥同源APUM23和APUM24。与此相一致的是，两个核仁的Pumilio基因，ChPUM2和ChPUM3，在轮藻最纯粹通过转录组分析。我们推测，这些基因编码的两个Pumilio蛋白可能在进化和功能上是保守的，因为它们的拟南芥同源物在蛋白质合成所需的rrna前处理中发挥了关键作用。瞬时表达的ChPUM2-RFP和ChPUM3-RFP定位于核仁尼古利亚娜·宾夕法尼亚州叶细胞，表明CHPUM2和CHPUM3的核仁功能。这apum23突变改变了与35 s: ChPUM2将其缺陷的rRNA加工和形态表型恢复到正常水平。然而，rRNA的加工缺陷和胚胎的致死率apum24突变体没有被解救35 s: ChPUM3或ChPUM2．与互补的失败相一致apum24和35 s: ChPUM3，APUM24在C-Terminus的不同域结构来自CHPUM3。此外，Arabidopsis前RRNA的靶标占Arabidopsis的靶标是156ntc .最纯粹并且可能不足以使CHPUM3的结合。

核核苷酸蛋白的系统发育

Pumilio蛋白质在真核生物中普遍存在，尽管不同的数字[1，5］．在整个基因组序列可获得的生物体中，高等植物具有比光合单细胞生物和非孕妇的蛋白质蛋白数量较多;例如，发现25种蛋白质拟南芥, 20栽培稻, 14Physcomitrella patens.，5 in.Chlamydomonas Reinhardtii., 11秀丽隐杆线虫7在酿酒酵母，人类2例[10］．基于相似性搜索，使用拟南芥核仁Pumilio蛋白(APUM23和APUM24)作为查询，核仁定位信号(NoLS)的存在作为要求[28]，其基因组已测序的绿色植物(Phytozome v12.1;https://phytozome.jgi.doe.gov）显示有两个推定的核仁蛋白蛋白。使用PACBIO ISO-SEQ分析，我们还确定了两种推定的核仁蛋白质，其中四种核苷酸中的四种蛋白质最纯粹。与我们的转录组分析一致，预先预测了四种Pumilio蛋白质轮藻基因组数据，包括2个核仁型[26］．与拟南芥APUMs相比，由25个Pumilio蛋白组成的ChPUM2和ChPUM3分别与APUM23和APUM24具有较高的同源性，而ChPUM1和ChPUM4属于其他不同的支系(附加文件)1:图S1)。

为了深入了解推定核仁蛋白质蛋白的进化关系，我们构建了一种系统发育树，其具有14种绿色植物的同源蛋白质，其中5种含有NOL（S）[28] （图。1a和b).本研究分析的所有绿色植物都有两个蛋白，属于APUM23和APUM24分支。的ChPUM2c .最纯粹而ChPUM3属于APUM24分支。利用ChPUM2和ChPUM3进行系统发育分析表明c .最纯粹与本研究研究的其他绿藻相比，更接近陆生植物，表明核仁Pumilio蛋白的进化与之前确定的系统发育定位一致[21，22，23，24，25］．

然后，我们使用SMART web程序(http://smart.embl-heidelberg.de.) [30.］．APUM23和APUM24分别有6个和5个Puf域，ChPUM2和ChPUM3分别有1个和5个Puf域。因为每个Puf结构域都能识别单个RNA碱基[3.[该观察结果提出了CHPUM2可以具有来自APUM23的不同RNA结合性的可能性，并且CHPUM3可以结合类似的，如果不是相同的RNA基序作为APUM24（图。1c)。

ChPUM2和ChPUM3的结构

Pumilio蛋白的经典结构分析显示C末端区域中的8个PUF结构域的串联重复[31，32］．然而，最近对人PUF-A和酵母PUF6的分析鉴定了11个PUF结构域，其中包括3个额外的域中的额外域，参与预阵挛加工的蛋白质[14］．以前对APUM23执行的类似的分析显示了10个PUF域而不是六个先前已知的域[10，12］．与APUM23和ChPUM2之间的系统发育关系一致(图。1a和附加文件1:图S1)， ChPUM2还包含10个Puf域，其分布与APUM23相同(图S1)。2a和附加文件2:图S2a)。CHPUM2的每个结构域显示平均26％的同一性和41％的APUM23的域。值得注意的是，在每个PUF结构域的第二α-Helix的第1，第2和第5个残基中发现了高度的同源性（图2中的红色盒子。2a和附加文件2:图S2a)。这三个残基在RNA碱基识别中起着关键作用[14］．

使用同样的方法，ChPUM3具有11个Puf结构域(N-R1到N-R3和C-R1到C-R8)。2b和附加文件2:图S2b)，在人类Puf-A和APUM24中报道[14］．APUM24与ChPUM3的3个n端Puf结构域的氨基酸同源性平均为47%，同源性为67%;8个c端结构域的同源性平均为39%，同源性为55%。在11个Puf结构域中，有两个结构域(C-R5和C-R7)的同一性低于其他结构域(图2)。2b）。

比较Puf结构域之间的氨基酸序列，ChPUM2和ChPUM3可能分别是拟南芥APUM23和APUM24的功能同源物(图2)。2A和b)，这与系统发育分析的观察结果一致。但是，由于ChPUM2和APUM23不同于ChPUM3和APUM24，在经典结构域分析中(图2)含有不同数量的Puf结构域。1c)，它们可能结合不同的RNA底物。因此，为了确定核仁ChPUM和APUM蛋白之间的结构关系，我们使用SWISS-MODEL web服务器(https://swissmodel.expasy.org/) [33］．先前的高分辨率结构研究证明APUM23的C形结构在R3结构域的第2和第3α-Helix之间具有长链，该α-螺旋参与RNA碱基的识别[12］．同源造型在三维结构中揭示了CHPUM2和APUM23参考蛋白之间的高相似性，以及类似于APUM23的C形结构（图。3.一种）。与APUM23相比，CHPUM2在R3结构域中具有长随机线圈（图1的底板中的红色彩色线。3），但它在该域中保持不间断的第2和第3α - 螺旋结构，类似于APUM23。因此，共有氨基酸序列和同源性建模的分析表明CHPUM2可以识别类似的，如果不是相同的RNA碱基。

与ChPUM2和APUM23的c型结构相比，ChPUM3和APUM24的结构预测为l型，类似于人类Puf-A参考蛋白[14](图)。3.b). ChPUM3和APUM24在结构上最显著的差异是在C-R5、N-R2和N-R3结构域。ChPUM3在C-R5结构域的随机线圈比APUM24长(图)。2b和图中的虚线圈。3.b).此外，ChPUM3在N-R2和N-R3结构域中含有带负电荷(E210)和不带电荷(Q249)的氨基酸(图2)。2b)，而不是已知参与RNA结合并在APUM24和人类Puf-A参考位点发现的基本氨基酸[14］．因此，考虑到C-R5的链长和2N末端PUF结构域中的缺乏碱性氨基酸，CHPUM3似乎具有来自APUM24的不同RNA结合特异性。

ChPUM2和ChPUM3的亚细胞定位

接下来，我们检测了ChPUM2-RFP和ChPUM3-RFP的亚细胞定位。此前，已知APUM23和APUM24的GFP融合优先定位于拟南芥根和烟草叶细胞的核仁[10，15］．我们进行了农杆菌介导的共渗n benthamiana叶细胞使用35 s: APUM23-GFP和35 s: ChPUM2-RFP和35S：APUM24-GFP和35 s: ChPUM3-RFP．在核仁中发现所有GFP和RFP标记的Pumilio蛋白质，并且在核桃中弱检测（图。4)．分致化结果表明CHPUM2和CHPUM3可以在rRNA识别和处理中发挥类似的作用，以及APUM23和APUM24。

ChPUM2救了apum23突变表型,但ChPUM3没有救援apum24

为了评估ChPUM2和ChPUM3是否参与类似APUM23和APUM24的核仁功能，对纯合子进行了互补分析apum23(无花果。5)和杂合的apum24(无花果。6)突变体通过改变35 s: ChPUM2和35 s: ChPUM3构造．虽然这一点apum23-2突变体表现出延迟萌发表型(图。5A和B），短根（图1中的底板）。5b），短花序茎（图1中的上板。5c），浅绿色叶子（图1中的底板。5c)和链霉素耐药性(图。5d),35 s: ChPUM2 / apum23-2^−−/植物表现出正常表型（图。5模拟)。值得注意的是，回收的链霉素易感性35 s: ChPUM2 / apum23-2^−−/植物表明辅助植物的正常核糖体功能（图。5d).与35 s: ChPUM2 / apum23-2^−−/植物,35 s: ChPUM3 / apum23-2^−−/植物保持了apum23-2突变表型(无花果。5模拟)。日志含义恢复文件失败apum23-2表型35 s: ChPUM3排除了CHPUM3和APUM23是直向性蛋白质的可能性。

除了恢复形态表型外，35 s: ChPUM2/apum23-2^−−/挽救了观察到的缺陷apum23-2^−−/突变体累积聚（a）的致氢〜18s-ITS1和5.8S-ITS2预rRNA（图。5e).采用定量逆转录酶- pcr (qRT-PCR)和三种引物组合检测poly (A) pre- rrna。在apum23-2^−−/突变体的qRT-PCR产物(5’ets - 18s、18S-ITS1和5.8S-ITS2)均有积累，但在突变体中，qRT-PCR产物的积累量明显增加35 s: ChPUM2/apum23-2^−−/与那些相比，植物，18秒-TIS1和5.8S-ITS2预雷纳斯的植物量大大减少了apum23-2^−−/，poly(A) 5.8S-ITS2的量略有下降。相比35 s: ChPUM2/apum23-2^−−/，35 s: ChPUM3/apum23-2^−−/显示了几乎相同的聚（a）预rRNAapum23-2^−−/突变体（图。5e，右侧面板）。QRT-PCR结果表明CHPUM2参与了类似的预rRNA处理途径作为APUM23，尽管在去除5.8S前RRNA副产物中没有完全起作用。

与恢复相反apum23由ChPUM2转基因，呢apum24表型没有恢复ChPUM2或ChPUM3转基因产品。纯合子的apum24^−−/突变体是致命的[13，15，34),杂合的APUM24-1^+/-突变体用于互补分析。这35 s: ChPUM3 / apum24-1^+/-植物以类似的速率设定正常和异常的种子apum24^+/-突变体（图。6A-C和表格1），显示30.7和33.2％的异常种子35 s: ChPUM3 / apum24-1^+/-和APUM24-1^+/-植物,分别。正如预期,35 s: ChPUM2 / apum24-1^+/-植物产生的异常种子(32.5%)与35 s: ChPUM3 / apum24-1^+/-植物。与这种结果一致的形态表型，35 s: ChPUM2/APUM24-1^+/-和35 s: ChPUM3/APUM24-1^+/-植物累计聚（a） - itailed 18s-ITS1和5.8S-ITS2预rRNA类似于APUM24-1^+/-植物（图。6d)，表明ChPUM3不是拟南芥APUM24的功能同源物。

ChPUM2恢复了对盐和葡萄糖过敏的表型apum23,但ChPUM3没有恢复apum23和apum24表型

apum23和apum24显示核糖体生物发生相关基因表达水平的变化，进而导致对高浓度盐的过敏反应apum23［17和葡萄糖在一个弱apum24突变体(13］．因此我们研究了ChPUM2和ChPUM3可以恢复改变的生理表型apum23^−−/和apum24^+/-．这35 s: ChPUM2 / apum23-2^−−/幼苗表现出与野生型COL-0幼苗相似的抗抗抗性和200mM葡萄糖，而35 s: ChPUM3 / apum23 -2^−−/幼苗对NaCl和葡萄糖的敏感性与甘薯相似apum23-2^−−/幼苗（图1中的左图）。7然而,a)。35 s: ChPUM2 / apum24-1^+/-和35 s: ChPUM3 / apum24-1^+/-未能恢复盐敏感性APUM24-1^+/-（图1中的右图。7意外)。,35 s: ChPUM2或35 s: ChPUM3是在APUM24-1^+/-，他们的转基因幼苗表现出与野生型和APUM24-1^+/-幼苗（图1中的右图）。7a).先前有报道说APUM24通过外源供应葡萄糖，野生型植物中基因表达大大增加[13，15］．我们的数据显示APUM24COL-0（PB2GW7）控制中的转录物，APUM24-1^+/-，35 s: ChPUM2 / apum24-1^+/-,35 s: ChPUM3 / apum24-1^+/-在200mm葡萄糖的存在下(图。7b）。正常生长APUM24-1^+/-提示杂合子表达APUM24对葡萄糖诱导的表型来说可能足够了。类似于APUM24-1^+/-,APUM24-1^+/-植物转化与35 s: ChPUM2或35 s: ChPUM3在葡萄糖处理下生长正常，可能是由于杂合子的表达APUM24．此外，在200 mM葡萄糖处理下，所有植株未加工的5.8S rrna数量与Col-0 (pB2GW7)对照相似(图2)。7c)，未加工的5.8S rrna含量是Col-0 (pB2GW7)对照的5.08 ~ 6.26倍(图2)。6d）。该结果表明葡萄糖补充杂合apum24^+/-增加了杂合的水平APUM24直到纯合子APUM24等级。因此，观察到的正常表型和5.8s预rRNA处理35 s: ChPUM2 / apum24-1^+/-和35 s: ChPUM3 / apum24-1^+/-外源葡萄糖导致拟南芥APUM24水平升高。

基于我们的转录组数据、公共数据库和以前的结果[10，15，35]，我们发现本研究中检测的绿色植物有两个核仁Pumilio蛋白。蛋白质系统发育表现出与多细胞植物的核亮菌蛋白的更密切关系c .最纯粹比单细胞绿藻(绿藻门)多。这一结果与之前的报告一致，表明该属轮藻与土地植物更密切相关，而不是其他绿色植物[27］．虽然某些推定的核仁Pumilio蛋白不具有核仁功能的可能性尚未排除，但陆生植物似乎已经进化出两种用于去除异常pre- rrna的Pumilio蛋白。

我们证明了ChPUM2在拟南芥细胞中是APUM23的功能同源体，从缺陷的pre-rRNA处理和形态的恢复中可以明显看出apum23在35 s: ChPUM2 / apum23植物。已知拟南芥核仁蛋白蛋白在识别前RRNA上的靶序列和募集催化蛋白质如外放车酶[10，12，13，15］．预rRNA的比较鉴定APUM23的靶序列（5'-GGAAUUGACGG-3'）[12的18S rRNAc .最纯粹在职位1148-1158(附加文件6：图S6）。因此，CHPUM2可能会绑定到该序列中c .最纯粹．ChPUM2和APUM23的一级结构支持了这一假设，除了第四个结构域外，ChPUM2和APUM23的Puf结构域在ChPUM2和APUM23之间高度保守(图4)。2a).因此，Puf结构域的共同靶点rRNA序列和相似的氨基酸组成可能使其恢复apum23表型，包括形态和rRNA处理缺陷，以正常35 s: ChPUM2 / apum23．在apum23使用互补分析35 s: ChPUM2，聚（a） - 累积的5.8s预rrnas累积apum23突变体未被完全去除(图。5e).这似乎可能是由于ChPUM2与其他未知蛋白的弱相互作用，这些蛋白属于5.8S rRNA加工所需的内在APUM23伴侣。事实上，ChPUM2的预测结构比APUM23具有更多的展开链(图2)。3.a)，可能干扰ChPUM2与其他蛋白质组分的相互作用。为了验证这种可能性在足底在CPUM2中，有必要对与CPUM2相互作用的元件进行识别和比较c .最纯粹和Apum23在拟南芥中。

虽然ChPUM3在结构上与APUM24相似(图。3.b），CHPUM3在拟南芥中没有功能替换APUM24。我们假设该结果是由于CHPUM3和APUM24之间的细结构差异。典型的Pumilio蛋白与Puf结构域的第二α-螺旋结合到特异性RNA碱基，但APUM24及其同源物不能通过该α-Helix结构域的特异性RNA碱进行结合[14，15］．ChPUM3不补充apum24突变体可能是由于（1）C-R5结构域中的非常长的随机线圈，（2）两个n末端结构域中的带负电和不带电的氨基酸，和（3）序列c .最纯粹．首先，C-R5域的C-R5结构域的非常长的随机链将中断其他C末端域与RNA碱基的相互作用在拟南芥前rRNA的5.8s-ITS2结中。的确，据报道，人PUF-A及其同源物APUM24在C-R5中具有长随机线圈，可防止C末端PUF结构域与RNA结合[14］．ChPUM3有一个比APUM24长80 aa的随机线圈(图。2b）;因此，CHPUM3可能无法识别拟南芥前rRNA。其次，在CHPUM3中，贴剂1b的N-R2和N-R3包括带负电（E210）和没有充电的（Q249）氨基酸，与APUM24的两个位置的正氨基酸（k）不同，这可能导致差异结合Apum24对5.8s-its2区域的特征。人PUF-A蛋白的N-R2和N-R3结构域对于RNA结合至关重要[14］．第三，ChPUM3可能对长ITS2序列的识别进行了优化。ITS2的c .最纯粹pre-rRNA比拟南芥长156 nt(附加文件7:图S7)。除了ChPUM3中C-R5结构域的长侧链外，拟南芥pre-rRNA相对较短的ITS2序列也可能阻止ChPUM3与底物结合。事实上，ITS2进化迅速，已被用于评估遗传差异[36，37］．

在本研究中，我们鉴定了两个核仁Pumilio蛋白，分别是ChPUM2和ChPUM3c .最纯粹在系统发育和结构上分别与拟南芥核仁Pumilio蛋白APUM23和APUM24接近。互补分析使用35 s: ChPUM2和35 s: ChPUM3显示,ChPUM2拯救了有缺陷的表型apum23突变体，但是ChPUM3没有恢复apum24突变体。与这些互补结果一致的是，ChPUM2在一阶氨基酸序列中具有与APUM23相似的Puf结构域，并具有预测的三维蛋白质结构。ChPUM3在C-R5结构域有一个长长的随机线圈，在n端结构域含有与APUM24不同的氨基酸。ChPUM3与APUM24在结构上存在差异，拟南芥pre-rRNA的短ITS2序列可能会阻碍ChPUM3对拟南芥5.8S pre-rRNA的加工。综上所述，ChPUM2在拟南芥中具有功能，与APUM23相似，但ChPUM3不能替代APUM24。进一步研究Charophyta中ChPUM2和ChPUM3的核仁功能将有助于我们了解绿色植物中rRNA加工的进化。

植物材料和生长条件

c .最纯粹在韩国的私人土地（38°33'N'n，128°50'e）收集，具有土地所有者的惯用许可，并在室温下在一个小水族馆的室温下种植。基因组DNA和优惠券标本c .最纯粹国立生物资源研究所植物资源科金敏河博士(https://www.nibr.go.kr/)，并以号码NIBRGR0000609814存放。这apum23［10),apum24［15]突变体，从拟南芥生物资源中心获得，之前报道过，用于互补分析。这35 s: ChPUM2和35 s: ChPUM3转基因拟南芥植物apum23和apum24背景是通过使用转换产生的农杆菌肿瘤术GV3101带花浸渍法[38］．答:芥野生型Col-0和对照(由pB2GW7转化的Col-0)apum23-2^−−/, apum24-1^+/-，35 s: ChPUM2,35 s: ChPUM3在16小时光下在22℃下在MS培养基中或在土壤中生长过表达线（120μmol光子m⁻² s⁻²）和8小时黑暗循环。对于抗生素，盐和葡萄糖抗性，种子在补充50mg L的1/2 MS板上发芽⁻¹分别用链霉素、150 mM NaCl和200 mM葡萄糖在生长室内培养10 ~ 12天。播种前将所有种子在4℃下分层3天。

鉴定ChPUM2和ChPUM3成绩单

关键词:Pumilio蛋白c .最纯粹（Chpum.S）通过搜索从全植物产生的PACBIO ISO-SEQ转录组数据来获得，包括Thallus，Rhizoids，小球（Antheridia）和肺炎（Archegonia）。表达Chpum.使用RT-PCR验证S.通过拟南芥核仁蛋白质（APUM23和APUM24）与Pumilio蛋白的比较鉴定了核仁Chpumsc .最纯粹并显示有nol [28］．

ChPUM2和ChPUM3同源基因的系统发育分析

为了进行系统发育分析，从Phytozome (v 12.1)的Viridiplantae(绿色植物)的代表物种中获得ChPUM2、ChPUM3、APUM23和APUM24蛋白的氨基酸序列COGs (Orthologous Groups) [35]，Klebsormidium flaccidum在klebsormedium基因组数据库(http://www.plantmorphogenesis.bio.titech.ac.jp/~algae_genome_project/klebsormidium/）和Ensembl植物数据库中的两种红藻类（http://plants.ensembl.org)．通过使用基于LG + G模型的MEGA7软件使用最大似然方法来构建系统发育树[29，39］．使用CLUSTALW进行氨基酸序列比对（http://www.clustal.org/)，并使用BioEdit软件编辑(https://bioedit.software.informer.com/)．

质粒构建

为了建造35s：chpum.质粒，编码序列(CDSs)ChPUM2和ChPUM3通过RT-PCR扩增使用引物CHPUM2-F和CHPUM2-R1和CHPUM3-F和CHPUM3-R1（参见附加文件8引物序列见表S1)。PCR产物插入到pENTR-D-TOPO载体(Invitrogen)，然后通过Gateway™LR Cloase II (Invitrogen)转移到pB2GW7或pK2GW7(根特大学弗拉姆斯研究所voor生物技术)。为了建造35 s: ChPUM-RFP和35S：APUM-GFP质粒,信用违约掉期ChPUM2，ChPUM3，APUM23岁,APUM24通过RT-PCR通过底漆组合CHPUM2-F / CHPUM2-R2，CHPUM3-F / CHPUM3-R2，APUM23-F / APUM23-R和APUM24-F / APUM24-R进行扩增。将PCR产物插入PETR-D-TOPO载体中，然后转移到PB7RWG2或PK7FWG2载体中[40Gateway™LR克隆酶II。

ChPUM和APUM融合蛋白共定位分析

ChPUM2和ChPUM3的c端RFP融合蛋白和APUM23和APUM24的c端GFP融合蛋白瞬时表达n benthamiana利用农业渗透的叶片[41］．简单地说，携带融合构建物的农杆菌在固定相收获，并在MMA缓冲液(10 mM MES, 10 mM MgCl)中重悬₂和150 μM acetosyringone)的OD值₆₀₀= 0.8。对于chpumr - rfp和APUM-GFP的共表达，两种农杆菌培养物的体积相同35 s: ChPUM-RFP或35S：APUM-GFP渗透前混合Construct。用无针注射器对烟叶背面进行浸润。将植株置于22℃、高湿度的黑暗环境下保存30-34 h，在荧光显微镜下观察渗入叶片。

定量逆转录酶- pcr (qRT-PCR)用于分析未加工的rRNA

使用RNEasy植物迷你套件（Qiagen，Cat。＃74904）分离出总RNA。从100毫克幼苗中，用2个单位的RNase-Fious Turbo™DNase（Ambion，Cat.＃AM2238）在37°C下进行处理50分钟。使用寡核苷酸（DT）从5μg的总RNA合成第一链cDNA₁₈引物在20 μL反应，稀释3倍。将1 μL的cDNA与0.6 μL的10 mM引物和10 μL的2 × SYBR®Green Supermix (Bio-Rad, cat。# 172-5261)，在20 μL的反应中进行PCR，并按照制造商的说明进行。为检测未加工poly(A) rrna，采用3种不同的引物组合(5’ets /18S、18S/ITS1和5.8S/ITS2)。微管蛋白(Tub4,以At5g44340) cDNA作为内部对照。qPCR检测使用了两个技术重复和三个生物学重复。数据采用2^——ΔΔCT方法(42］．

的cdna序列数据ChPUM2和ChPUM3在GenBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）分别在加入号码MN652915和MN652916下。在识别期间分析的转录组数据集ChPUM2和ChPUM3转录本可在GenBank数据库(NCBI SRA登录号;SRP249259)。

C-R：

C终端重复

它的：

内部转录序列

女士:

Murashige和斯库

N-R:

氨基端重复

前rRNA：

预核糖体RNA

我们感谢Jungho Lee博士，了解文化条件的建议。

本研究由下一代BioGreen21计划，农村发展管理局（NO.PJ013663），韩国，向SBC提供资金。资金代理商支持这项研究项目，但在稿件的研究，数据分析，解释和写作的设计中没有发挥作用。这些是作者的唯一责任。

隶属关系

1. 迈通峡大学生物科学与生物信息学分工，永宁，Kyunggi-Do，449-728，韩国

   朴秀贤，金亨世，Prakash Jyoti Kalita，崔相奉

贡献

SHP和SBC设计了实验并撰写了文章。SHP生成构建物并进行互补分析。HSK协助亚细胞定位研究。PJK有助于杂合突变体的互补。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到Sang-Bong崔．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。

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