两种β-葡萄糖醛酸转移酶参与II型阿拉伯半乳聚糖的生物合成，在粘液多糖基质组织中起作用GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGPS）都严重与连接到羟脯氨酸残基的蛋白质骨架II型阿拉伯半乳聚糖（AG）多糖的糖基化。II型的AG所必需的植物生长和建立正常的细胞功能至关重要。尽管II型的AG在植物发育的重要性，我们在粘液形成和种皮表皮细胞的发育，这些聚糖/糖残基的潜在作用的认识缺乏了解，远远没有完成。一种这样的糖残基是由β-葡萄糖醛酸转移基因/酶的作用转印到AGP聚糖的AGP的葡糖醛酸残基。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

在这里，我们描述了两个β-葡萄糖醛酸转移酶基因，GydF4y2BaGLCAT14AGydF4y2Ba和GydF4y2BaGLCAT14CGydF4y2Ba它参与β-葡萄糖醛酸(GlcA)向II型AGs的转移。通过反向遗传学方法，我们观察到GydF4y2Baglcat14a-1GydF4y2Ba与野生型相比，突变体在胶质果胶同半乳糖醛酸(HG)上表现出细微的变化GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba突变体表现出更严重的黏液表型，包括黏液的损失和纤维素射线形成和种皮形态的显著改变。单糖组成分析表明，糖的含量有显著变化GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba粘附和非粘附种子黏液中与WT相关的突变体。此外，总黏液含量也有所下降GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba相对于WT的突变体。此外，GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba突变体在果胶形成、钙含量和果胶甲基酯化程度(DM)方面均有缺陷，结晶纤维素含量和种子大小均有下降。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

这些结果提出了有关黏液形成过程中细胞壁聚合物相互作用和组织的重要问题。我们认为GLCAT14A和GLCAT14C的酶活性发挥部分冗余的作用，这对粘液基质的组织和种子大小是必需的GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba．这项工作使我们更接近识别工业应用工程植物壁壁的潜在基因靶标的一步。GydF4y2Ba

植物的正常发育在很大程度上取决于植物细胞壁不同成分之间的相互作用。这种动态结构定义了植物的形态结构，并负责细胞形状、细胞粘附和器官内聚[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba］.通过单个壁组分 - 纤维素，半纤维素，果胶和羟脯氨酸和富羟脯氨酸的合成，分泌，改性和交联来启动植物细胞壁 - 通过甘糖基转移酶的含量的配位作用合成。了解复杂多糖网络组装中涉及的潜在机制，并阐明其生物学作用不是一个琐碎的任务[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba]，并且仍有日期为有志于植物细胞壁结构的操作，以便更好地了解其生理功能，并允许其商业开发的科学家的主要目标。GydF4y2Ba

在细胞壁多糖相互作用的研究中，一个越来越受到重视和重要性的模型系统是拟南芥种子表皮细胞(SCE)，也称为粘液分泌细胞(MSC) [GydF4y2Ba1GydF4y2Ba］.SCE是一种理解细胞壁生物合成，分泌，组装和改性的遗传基础的优秀模型系统[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba因为大量的细胞壁多糖可以很容易地提取，并在很短的时间内进行分析。花期后5- 8天，大量的果胶分泌到外切向和径向初生壁交界处的质外体间隙，在细胞质柱周围形成一个环状的粘液囊[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba］.然后表皮细胞合成火山状的次级壁(9到11 DPA)，称为小柱，它从粘液囊的中心突出，与初级壁相连。当干燥、成熟的种子吸水时，快速的粘液膨胀破坏了切向SCE，释放出富含多糖的粘液，粘液组织在两个不同的层:一个是外层，可溶于水的非粘附层，一个是内层，粘附层，紧密地附着在种皮表面。拟南芥胶浆主要由不分枝的鼠李半乳糖醛酸-1 (RG-I)组成，内层有少量的同半乳糖醛酸(HG)、纤维素和阿拉伯木聚糖[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba］.已经通过分析粘液突变体来更好地了解糖基转移酶的功能作用，以更好地了解粘液聚合物中所涉及的细胞壁生物合成，分泌和递送粘膜聚合物的功能作用。近年来，已经确定并表征了缺乏粘液生物合成和挤出所需的功能酶的遗传突变体，但许多其他人正在等待功能调查。GydF4y2Ba

迄今为止迄今为止鉴定了粘液生物合成的几种基因/蛋白质，包括称为盐过度敏感的5（SOS5），GALT2和GALT5的粘稠的阿拉伯乳糖蛋白（AGP），其负责启动AGPS的糖基化的两个半乳糖基转移酶和受体- 样激酶称为Fei2;对应于这些基因/蛋白质的个体以及高阶突变体的特征在于粘液果胶屈服，并且显着的纤维素射线的不存在，而漫射纤维素染色保持完整[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba］.如SOS5，这也被称为FLA4，是唯一的良好表征的AGP报道参与在粘液生物合成，所述SOS5聚糖部分和潜在的其他的AGP到粘液形成的贡献还远远没有完成，并提出一个谜值得散开。GydF4y2Ba

AGP是一类富含羟脯氨酸的糖蛋白，被II型AGs广泛糖基化，这些AGs共价附着在AGP蛋白主干中的羟脯氨酸残基上[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba］.一个单独的II型AG聚糖由β-1,3-半乳糖主链和β- 1,6-半乳糖分支组成，以阿拉伯糖基残基装饰，经常与其他次要糖残基，如葡萄糖醛酸(GlcA)，鼠李糖(Rha)，和Fuc [GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba］.虽然它们在粘液形成中的确切作用尚不清楚，但AGP与壁多糖的相互作用，它们参与细胞内信号传导级联，以及它们对各种生物过程的影响[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10GydF4y2Ba]. 值得注意的是，AGPs与RG-I和阿拉伯木聚糖形成共价键的发现可能最能说明细胞壁聚合物网络相对于AGPs的复杂性[GydF4y2Ba10GydF4y2Ba］.GydF4y2Ba

功能表征三种葡糖醛糖基糖苷酶（Glcatt14a，Glcat14b和Glcat14c，并发现将Glca残基转移到AGPS [GydF4y2Ba11GydF4y2Ba]，而另外两种glcat (GLCAT14D和GLCAT14E)也被报道参与agp的葡萄糖醛酸化[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba]. 在此，我们提出证据表明，在碳水化合物活性酶（CAZy）分类系统中，两种GLCAT（GLCAT14A和GLCAT14C）属于GT14家族(GydF4y2Bahttp://www.cazy.orgGydF4y2Ba；[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba)在拟南芥粘液基质形成过程中起着至关重要的作用。GydF4y2Ba

系统发育、突变体特征及基因表达分析GydF4y2BaGLCAT14AGydF4y2Ba和GydF4y2BaGLCAT14CGydF4y2Ba基因GydF4y2Ba

glcat参与GlcA向II型AG聚糖的转移。虽然在拟南芥中已鉴定出11种β-GLCATs，但系统发育分析表明，β-GLCATs在拟南芥中可能存在GydF4y2BaGLCAT14AGydF4y2Ba（GydF4y2BaAT5G39990GydF4y2Ba),GydF4y2BaGLCAT14BGydF4y2Ba（AT5G15050GydF4y2Ba)似乎是助手，而GydF4y2BaGLCAT14C（AT2G37585）GydF4y2Ba在系统进化上不同于GydF4y2BaGLCAT14AGydF4y2Ba和GydF4y2BaGLCAT14BGydF4y2Ba（无花果。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.eFP浏览器显示的种子微阵列数据[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15GydF4y2Ba]透露，GydF4y2BaGLCAT14AGydF4y2Ba和GydF4y2BaGLCAT14CGydF4y2Ba在种子涂层中表达升高（补充图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba)和种子发育，主要是在心脏和线形子叶阶段(图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba为此目的，我们检查了GydF4y2Baglcat14a-1GydF4y2Ba和GydF4y2Baglcat14c-1GydF4y2Ba单突变体和GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba双突变体揭示这些基因在种子黏液生物合成中的作用。GydF4y2Ba

单突变体(GydF4y2Baglcat14a-1GydF4y2Ba和GydF4y2Baglcat14c-1GydF4y2Ba)和双突变体(GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba）检查用于表达GydF4y2BaGLCAT14AGydF4y2Ba和GydF4y2BaGLCAT14CGydF4y2Ba定量逆转录(qRT)-PCR。给出GydF4y2BaGLCAT14AGydF4y2Ba和GydF4y2BaGLCAT14CGydF4y2Ba跨越种子发育阶段(图GydF4y2Ba2GydF4y2Baa)，我们检测了野生型(WT)线形子叶期(8 DAP)的表达，GydF4y2Baglcat14a-1GydF4y2Ba那GydF4y2Baglcat14c-1GydF4y2Ba和GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba突变体，并观察到基因表达显著减少GydF4y2BaGLCAT14AGydF4y2Ba和GydF4y2BaGLCAT14CGydF4y2Ba在单和双突变体两者（图GydF4y2Ba2GydF4y2BaC）。虽然我们无法确认在Salk_051810线中存在第二个T-DNA插入的情况GydF4y2Baglcat14c-2GydF4y2Ba，我们利用了CRISPR敲除GydF4y2BaGLCAT14CGydF4y2Ba基因5′端附近缺失一个178 bp的基因，产生与该基因相似的表型GydF4y2Baglcat14c-1GydF4y2Ba（SALK_005705）突变体GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba］.GydF4y2Ba

这GydF4y2Baglcat14a-1GydF4y2Ba和GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba突变体具有不同的种子涂层粘液表型，响应于不同的化学提取物GydF4y2Ba

WT和突变体种子在蒸馏水和钠中水合GydF4y2Ba_2GydF4y2BaCO.GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba并用钌红（RR）染色，钌红是一种优先与未酯化果胶结合的红色染料[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba］.种子在水中摇匀，用RR染色GydF4y2Baglcat14a-1GydF4y2Ba种子有一个较小的粘膜胶囊，而粘附的粘膜层GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba与wt相比未检测到突变种子（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba一种）。类似地，水合种子中粘液区域的定量显示，相对于WT，GydF4y2Baglcat14a-1GydF4y2Ba和GydF4y2Baglcat14c-1GydF4y2Ba粘液面积分别在粘液面积减少57.5％和2.7％，而粘液区域GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba无法确定（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bad）。由于附着的粘液中的损失GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba种子（补充图。GydF4y2Ba2GydF4y2Bad，H，L，N），目前还不清楚这粘液缺陷表型是否是由于粘液挤出缺陷或对粘液层的重新分区。要回答这个问题，我们调查了突变如何通过降低成熟的0.01％RR染料干种子挤出粘液。结果表明GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba种子挤出粘液，如WT和单个突变体，但在轻轻摇动后开始“剥离”粘液（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bac).当种子在水中水合时，绝大多数的GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba漂浮的种子（图GydF4y2Ba4.GydF4y2BaD)，即使在与水延长接触1小时后。同时，将双突变体种子包装在一起(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bah)， 48h后仍保持漂浮状态甚至发芽(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bal)。GydF4y2Ba

用na化学提取GydF4y2Ba_2GydF4y2BaCO.GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba用交联酯键裂解提取果胶[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba那GydF4y2Ba23GydF4y2Ba那GydF4y2Ba24GydF4y2Ba］.该WT的治疗，并用1M的Na单突变体的种子GydF4y2Ba_2GydF4y2BaCO.GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba结果导致细胞壁破裂，形成有组织的“锥体”排列的初生细胞壁残余物附着在小柱上，在种子表面可以看到黑色染色点。在GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba种子，切向和/或径向细胞壁似乎完整，既缺乏“锥体结构”和粘附粘液(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bab).同样，黏附粘液的RR染料染色强度较低GydF4y2Baglcat14a-1GydF4y2Ba相比WT，而在染色GydF4y2Baglcat14c-1GydF4y2Ba与wt无法区分。在1M na中水合成熟种子中粘液区域的定量GydF4y2Ba_2GydF4y2BaCO.GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba透露GydF4y2Baglcat14a-1GydF4y2Ba和GydF4y2Baglcat14c-1GydF4y2Ba突变体的黏液面积分别减少24%和6%，而突变体的黏液面积则减少GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba由于种子涂层中的粘附粘膜的显着损失，不能确定种子（补充图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba情况;图3 e)。GydF4y2Ba

GLCAT14A和GLCAT14C影响纤维素射线形态和纤维素沉积GydF4y2Ba

WT和GydF4y2Baglcat14GydF4y2Ba突变体种子在蒸馏水和50 mM EDTA中水合，并使用结合纤维素的S4B染料检测黏液胶囊中纤维素的精确分布[GydF4y2Ba25GydF4y2Ba]. 结果表明，WT和单突变种子粘液胶囊显示出有序和强烈的S4B标记的纤维素射线，这些射线从小柱顶部向外投射，并且在水下射线之间扩散S4B信号（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Baa，上面板)和EDTA提取(图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba一个，下面的面板）。相比之下，GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba水分水合种子的特征是纤维素射线组织不规则，初生细胞壁不完全脱落，而EDTA水合种子的初生细胞壁残余与挤压的黏液边缘紧密结合(图2)。GydF4y2Ba5.GydF4y2Baa).为了进一步表征种子黏附粘液中纤维素的精细结构和分布，我们使用了钙氟，一种结合β-葡聚糖的染料[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba]，以及两个糖结合模块（的CBMs; CBM3a和CBM28）并联免疫标记与S4B污点。CBM3a优先结合结晶纤维素的结构，而CBM28优先结合无定形纤维素的结构[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba］.与RR染色相似，我们观察到钙氟染色黏液层的羽毛射线结构消失GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba与WT相比的种子（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bab,补充图。GydF4y2Ba2GydF4y2BaN） 。在WT和单突变体中，CBM3a显示出一种胡须状尖端结构，尤其集中在外周，而S4B染色了内粘附层和小柱上方的射线。与WT相比GydF4y2Ba，glcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba种子有更严重的缺陷，这表明没有S4B染色的射线样结构，在最接近种皮的区域检测到一些CBM3a免疫标记(图)。GydF4y2Ba5.GydF4y2BaC;参考图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba一种）。CBM28标签GydF4y2Baglcat14a-1GydF4y2Ba和GydF4y2Baglcat14c-1GydF4y2Ba具有与WT类似的模式，但强度降低;而在GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba双突变体，粘液标记几乎完全不存在（图GydF4y2Ba5.GydF4y2Bad）。类似地，通过存在的任何结晶纤维素观察到双折射的粘附粘膜，结果表明wt和单突变种子显示出粘附粘膜内的结晶纤维素的可见光射线的明亮区域，但是这种双折射不存在GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba种子，除了在种子上的边缘上的亮点（图GydF4y2Ba5.GydF4y2Bae).同样，总胶浆、去胶浆和整粒种子的结晶纤维素含量也表现为GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba与野生型相比，突变体的结晶纤维素含量显著降低(图。GydF4y2Ba5.GydF4y2BaF）。GydF4y2Ba

胶浆果胶成分改变GydF4y2Baglcat14a-1GydF4y2Ba并且高度改变了GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba

除了在水和钠中保湿成熟的种子GydF4y2Ba_2GydF4y2BaCO.GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba并用rr，wt和染色GydF4y2Baglcat14GydF4y2Ba用50 mM EDTA振荡突变种种子，观察种皮中是否有残留粘液。通常，像EDTA这样的阳离子螯合剂可以通过破坏未酯化的HG链的交联来促进粘液挤压[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba那GydF4y2Ba29GydF4y2Ba］.在50mM EDTA成熟种子的水合，pH 8.0中表明，在对比的WT和两个单突变体，GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba双突变体种子的初生细胞壁残片附着在种皮上，并失去粘附粘液。GydF4y2Ba4.GydF4y2BaD和H)。鉴于已有报道葡萄糖醛酸在钙结合中的作用[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba那GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba，我们研究了钙离子的加入是否影响胶黏剂的果胶凝胶基质GydF4y2Baglcat14GydF4y2Ba突变体种子。而RR染色的黏液强度GydF4y2Baglcat14a-1GydF4y2Ba和GydF4y2Baglcat14c-1GydF4y2Ba种子在50 mm cacl中摇动GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba可比性到WT（参考图。GydF4y2Ba4.GydF4y2BaI-K，M-O），RR染色强度GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba黏附粘液仍表现为黏附性缺失。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba三种果胶抗体，JIM5和JIM7，以及CCRC-M35，结合S4B染色，检测粘附黏液中果胶相对于纤维素的分布。JIM5和JIM7分别针对部分甲基化(高达40%)和甲基化(高达80%)的汞柱[GydF4y2Ba31GydF4y2Ba那GydF4y2Ba32GydF4y2Ba]，而CCRC-M35识别拟南芥种子黏液中存在的未取代RG-I脊骨[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba那GydF4y2Ba33GydF4y2Ba那GydF4y2Ba34GydF4y2Ba］.WT和CCRC-M35标记GydF4y2Baglcat14GydF4y2Ba在粘液晕周围的射线结构周围出现了单株突变体种子。GydF4y2Ba5.GydF4y2BaA1-L1)，而GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba在种子中，CCRC-M35标记出现在种皮表面，而不是像射线一样集中(图2)。GydF4y2Ba6.GydF4y2Baa、 d；补充图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba，面板J1-L1）。同样，也使用JIM5抗体检测部分甲基酯化汞的分布。令人惊讶的是，WT中存在的小柱之间的弥漫性JIM5染色在WT中不存在GydF4y2Baglcat14a-1GydF4y2Ba并减少了GydF4y2Baglcat14c-1GydF4y2Ba突变种子（补充图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba，面板A2-I2）。与wt相反，GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba种子在靠近小柱的区域和初生细胞壁碎片不完全分离的区域被强烈标记(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bab, e;参考图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba面板J2-L2)。用JIM7标记进行了类似的观察，在柱状区周围观察到强烈的染色GydF4y2Baglcat14a-1GydF4y2Ba和GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba（无花果。GydF4y2Ba6.GydF4y2BaC;参考图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba，面板D3-F3和J3-L3)。为了排除表位可达性增加导致HG酯化变化的可能性，采用生物化学方法测定了总黏液中HG的钙含量和甲基化程度(DM)。相对于WT，钙含量分别降低4.5%、5%和37.5%GydF4y2Baglcat14a-1GydF4y2Ba那GydF4y2Baglcat14c-1GydF4y2Ba和GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2BaHG的DM分别增加47%、32%和5.3%GydF4y2Baglcat14a-1GydF4y2Ba那GydF4y2Baglcat14c-1GydF4y2Ba和GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba分别突变体（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2BaF）。类似地，与WT相反，在单一和双突变体中，非粘附粘膜的尿酸含量显着增加，而在此期间观察到显着减少GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba突变体在粘附层(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2BaG）。使用免疫印迹分析的粘液聚合物进行进一步评估和显示，在WT和聚合物之间的差异组分GydF4y2Baglcat14GydF4y2Ba突变体（补充图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Baa - c)。而我们观察到的CCRC-M35表位结合增加GydF4y2Baglcat14a-1GydF4y2Ba和GydF4y2Baglcat14c-1GydF4y2Ba在黏附粘液中，观察到明显的减少GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba与WT相关的突变体(补充图。GydF4y2Ba6.GydF4y2BaD).值得注意的是，我们发现JIM13表位被检测到并定位到小柱上，但我们没有观察到WT和JIM13信号之间的任何差异GydF4y2Baglcat14GydF4y2Ba突变体（补充图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba， A4, D4, G4和K4)。综上所述，我们采用生物化学和免疫标记方法获得的结果提供了证据，表明种皮胶浆中的果胶组织受到了严重的影响GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba突变体。GydF4y2Ba

糖的分布在GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba粘液GydF4y2Ba

阳性碳水化合物的两种最丰富的糖是芝麻糖和半乳糖醛酸;它们一起占总粘膜的大约80％[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba35GydF4y2Ba］.检查效果GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba黏液成分发生突变，进行糖分析。我们观察到显著降低的GlcA含量(摩尔%)GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba相对于wt的非粘附粘膜中的突变体。类似地，在粘附的粘膜中未检测到GLCAGydF4y2Baglcat14GydF4y2Ba突变体，仅在WT中(表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.虽然，我们观察到Gal和Xyl的轻微增加GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba但对种子的生长无显著影响(P > 0.05)。WT相比,GydF4y2Baglcat14a-1GydF4y2Ba和GydF4y2Baglcat14c-1GydF4y2Ba在粘液层中的半乳糖醛酸（GALA）含量具有显着的改变，而剩余的糖与wt相对相似。令人惊讶的是，这是GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba突变体表现出在非粘附粘膜层中的其他糖中的相应减少的GALA显着增加，而在粘附层中，我们观察到除了GALA之外的其他糖增加（表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.此外，我们还观察到总黏液含量显著降低GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba相对于WT（图GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba）.以草酸铵、0.2 N NaOH和2 N NaOH对WT和突变体种子进行连续提取，结果表明，WT和突变体种子的总糖含量显著增加GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba在草酸铵和0.2 N NaOH提取物中突变，2 N NaOH提取物(贴壁层)显著降低(表2)GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

种皮表皮细胞发育所需的GLCAT14A和GLCAT14CGydF4y2Ba

我们采用SEM观察其是反射的细胞壁聚合物特性的变化的SCE细胞的任何潜在改变。尽管表面形貌的GydF4y2Baglcat14a-1GydF4y2Ba和GydF4y2Baglcat14c-1GydF4y2Ba种子从WT（参考图难以区别。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba），表面形态的GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba种子表现为SCE细胞的改变，其特征是六角形面径向细胞壁的形态结构改变(图2)。GydF4y2Ba8.GydF4y2Baa和b），再加上在小柱的吸水性后的外观（图的变化。GydF4y2Ba8.GydF4y2Bac，和d)。同样，与WT相比，我们观察到小鼠小柱面积显著增加GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba在摇动水中的种子之前和之后的种子（图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Bae和f)。我们还测量了种子的大小，发现GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba与野生型相比，种子的长度和宽度显著减少。GydF4y2Ba9.GydF4y2Baa，b和c）中。GydF4y2Ba

多年来，研究工作一直致力于确定黏液多糖的组成部分，在黏液基质的组织中是重要的。尽管在发现黏液形成的GTs方面取得了重大进展，但越来越多的证据表明，我们对黏液多糖基质的形成和组织的理解还远远不够完整。在这里，我们提供了证据二GydF4y2BaGLCATGydF4y2BaAGPs中葡萄糖醛酸向II型AGs转移的相关基因对于控制粘液多糖基质的结构完整性和种子大小至关重要，并阐明了AGPs中β-连接葡萄糖醛酸残基与粘液多糖结构稳定性之间的关系。GydF4y2Ba

GLCAT14A和GLCAT14C功能丧失导致种子浮选GydF4y2Ba

拟南芥种子在水中吸收时，在种子上形成致密的粘液层，使它们沉入。有趣的是，种子浮动表型显示GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba浮胶释放(FMR)天然拟南芥材料的黏液突变体。由于FMR突变种子的粘附层上没有纤维素标记，推测导致FMR缺陷的基因参与了纤维素的形成[GydF4y2Ba36GydF4y2Ba］.在水稻中也观察到类似的种子漂浮表型GydF4y2Bairx14GydF4y2Ba木聚糖合成受损的突变体[GydF4y2Ba37GydF4y2Ba]这表明，除了纤维素的减少外，其他粘液聚合物的缺失也有助于FMR表型。我们的结果表明GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba种子表现出的表型类似于GydF4y2Bairx14GydF4y2Ba突变体(GydF4y2Ba37GydF4y2Ba]和FMR天然拟南芥种质[GydF4y2Ba36GydF4y2Ba]，并扩展我们对如何错综复杂地交织在一起，相互依存的基体聚合物，以及如何相互作用的合作伙伴之一的遗传中断可能会对粘液矩阵架构产生深远的影响的知识。值得注意的是种子浮动表型也导致从粘液释放受损[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba38GydF4y2Ba]，但这不是对的情况下GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba种子与溶于水的RR染料接触后释放粘液(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bac).这种种子漂浮的表型在进化上似乎有利于提高种子在河流上的传播，同时仍保留其萌发特性[GydF4y2Ba37GydF4y2Ba］.GydF4y2Ba

GLCAT14A和GLCAT14C功能丧失导致严重的粘液表型GydF4y2Ba

调查的基因的功能的丧失一些研究/参与粘液形成酶已被粘液层在吸水性的重新分区。在水水合种子，我们观察到GydF4y2Baglcat14a-1GydF4y2Ba与野生型相比，种子的粘附黏液明显减少，而种子的粘附黏液则减少GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba种子(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba一种）。独特的粘液表型GydF4y2Baglcat14a-1GydF4y2Ba和GydF4y2Baglcat14c-1GydF4y2BaATGLCAT14A偏好β-1,6-半乳糖，而ATGLCAT14C偏好β-1,3-半乳糖作为底物GydF4y2Ba体外GydF4y2Ba测定[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba］.因此，我们的观察结果加强了Glcat14a和Glcat14c可以执行不同的功能，如GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba缺乏功能性GLCAT14A和GLCAT14C的种子表现出比两个单一突变种子更严重的表型。值得注意的是，在生成的CRISPR-Cas9中也观察到黏液的减少GydF4y2Baglcat14abcGydF4y2Ba突变体(GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]通过用RR染色揭示。GydF4y2Ba

鉴于盲目的粘液表型GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba考虑到像EDTA这样的阳离子螯合剂可以破坏交联的未酯化的HG链，并促进粘液的挤出，我们通过在50 mM EDTA pH 8.0中水合种子并在RR染料中染色来测试潜在的粘液挤出缺陷[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba28GydF4y2Ba］.有趣的是，两者的粘液囊GydF4y2Baglcat14a-1GydF4y2Ba和GydF4y2Baglcat14c-1GydF4y2Ba类似于wt（补充图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba得了,eg);但令人惊讶的是,GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba双突变体的种子缺乏任何可检测的粘附粘液（参考图。GydF4y2Ba4.GydF4y2BaD, H)，提示其黏液表型特征GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba种子是由于粘液重新分区，而不是粘液挤出缺陷。GydF4y2Ba

除钙交联汞形成“蛋盒”结构外，钙GydF4y2Ba^{２＋GydF4y2Ba}在agp和果胶酸的糖醛酸残基之间的羧基驱动交联已经被推测[GydF4y2Ba39GydF4y2Ba那GydF4y2Ba40GydF4y2Ba］.增加钙GydF4y2Ba^{２＋GydF4y2Ba}离子浓度有助于粘附层中的粘膜粘附[GydF4y2Ba41GydF4y2Ba]，我们分析了RR染色GydF4y2Baglcat14GydF4y2Ba用氯化钙处理的突变体种子GydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba尽管粘着性黏液在CaCl中固有损失GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba对待GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba突变种子（补充图。GydF4y2Ba4.GydF4y2BaL, P)，我们不能排除这种可能性，即由GlcA残基损失介导的黏附粘液的损失可能已经被钙的减少进一步削弱[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba]，从而可能导致在GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba突变体种子。GydF4y2Ba

GLCAT14A和GLCAT14C都是粘液基质聚合物组织和组装所必需的GydF4y2Ba

针对粘液形成中涉及的分子机制的几项研究已经确定了一些参与粘液多糖形成的关键参与者[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba］.so5 /FLA4是迄今为止唯一一种广泛表征的参与粘液形成的AGP，与维持细胞壁结构有关[GydF4y2Ba42GydF4y2Ba那GydF4y2Ba43GydF4y2Ba那GydF4y2Ba44GydF4y2Ba]，是黏液粘附和射线结构形成所必需的[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba］.因为GlcA是II型AG聚糖中唯一有钙结合作用的酸性糖[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba[我们证明GLCA对于拟南芥种子粘液中的果胶和纤维素基质组织是必不可少的，如免疫标签和生化分析所揭示的。通过用COMPOFLUOR标记，用于纤维素和其他β-葡聚糖的荧光探针，我们展示了从霉菌顶部发出的强烈射线的预期组合，并在粘附层中扩散染色的粘附层，GydF4y2Baglcat14a-1GydF4y2Ba和GydF4y2Baglcat14c-1GydF4y2Ba（无花果。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bab).除了柱状柱周围的钙氟标记外GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba种子，射线的弥漫性染色完全没有。类似地，与WT相比，GydF4y2Baglcat14a-1 glcat14c-1GydF4y2Ba经pontamine S4B染色的种子显示纤维素射线分布不规则，EDTA染色时射线间扩散射线染色减弱，外细胞壁脱离不完全，经pontamine S4B染色后水浸种子显示纤维素射线分布不规则，EDTA染色时纤维射线间扩散射线染色减弱，外细胞壁脱离不完全。GydF4y2Ba5.GydF4y2Baa） 。二者都GydF4y2BaSOS5.GydF4y2Ba和GydF4y2Bafei2GydF4y2Ba突变种子有一些粘液缺陷，如纤维射线缺失，但弥漫性染色完整[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba35GydF4y2Ba]这与在中观察到的相似GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba种子。先前的遗传突变体分析表明GALT2，GALT5，SOS5，FEI1和FEI2在线性，非添加途径起作用，并表明糖基化的SOS5与FEI1 / FEI2相互作用[GydF4y2Ba45GydF4y2Ba］.葡萄糖醛酸AG多糖在agp(如so5)中的钙结合可能促进受体-配体相互作用，这是类受体激酶活动所必需的[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba］.我们推测GydF4y2BaGLCAT14AGydF4y2Ba和GydF4y2BaGLCAT14CGydF4y2Ba基因可能会干扰这种相互作用，从而导致相关的受体样激酶活性。也许除了so5 /FLA4之外，还有一些agp参与了黏液的形成，这些黏液agp的生物活性可能依赖于GLCAT14A和GLCAT14C。值得一提的是，虽然有85个agp被鉴定为细胞壁蛋白超家族成员[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba，只有so5与粘液的形成有关。此外，GlcA的减少(表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba)可能提示其他GLCAT可能参与粘液组织，其他GLCAT在粘液形成中的确切作用有待阐明。GydF4y2Ba

纤维素已被证明在锚定附着到粘液种皮中发挥重要作用[GydF4y2Ba44GydF4y2Ba那GydF4y2Ba46GydF4y2Ba］.在晶体纤维素中排列的纤维素微纤维产生偏振光的双折射，根据这种改变的双折射已经识别出在晶体纤维素含量中有缺陷的突变体[GydF4y2Ba47GydF4y2Ba］.WT和单个突变体种子的外表皮细胞表现出强烈的双折射，可见黏液内的结晶纤维素。相比之下,GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba种子在偏振光下的双折射要小得多，种子边缘的亮点就证明了这一点。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bae）。这表明结晶纤维素含量降低GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba黏液，因此可能导致粘附黏液的损失。可以理解，晶体纤维素在GydF4y2Bacesa5GydF4y2Ba[GydF4y2Ba46GydF4y2Ba]，并报道了类似的观察结果GydF4y2BaSOS5.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba44GydF4y2Ba),GydF4y2Bairx14-1GydF4y2Ba[GydF4y2Ba48GydF4y2Ba];但在β-中，GlcA含量降低的观察到的效果（表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba)影响结晶纤维素含量是相当意外的。我们的发现有助于说明粘液聚合物是多么复杂地交织在一起，并且应该成为导致植物细胞壁组装过程解构的研究工作中的一个重要考虑因素。GydF4y2Ba

多项证据表明II型AGs和果胶之间存在潜在的相互作用。例如，用果胶降解酶处理细胞壁组分可以增加agp的释放[GydF4y2Ba49GydF4y2Ba那GydF4y2Ba50.GydF4y2Ba］.类似地，AGPs的已显示结合在钙依赖性方式果胶[GydF4y2Ba51.GydF4y2Ba]. 因为葡萄糖醛酸与钙结合[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba]，鉴于Hg交联和酯化中钙的重要性[GydF4y2Ba41GydF4y2Ba]，在表位JIM5结合的显著改变（图GydF4y2Ba6.GydF4y2BaB补充图。GydF4y2Ba5.GydF4y2BaA2-L2）和JIM7（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2BaC;参考图。GydF4y2Ba5.GydF4y2BaA3-L3），特别是在GydF4y2Baglcat14a-1 glcat14c-1GydF4y2Ba突变体表明，ATGLCAT14A和ATGLCAT14C功能的丧失导致HG酯化过程发生剧烈变化。虽然我们观察到钙含量减少，尤其是在GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba突变体中，我们只观察到DM的增加GydF4y2Baglcat14a-1GydF4y2Ba和GydF4y2Baglcat14c-1GydF4y2Ba总黏液提取物中的突变体(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Baf） 。令人惊讶的是，美国的情况并非如此GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba突变体，因为钙的显着降低不会导致粘蛋白DM的增加。然而，我们观察到Jim5和Jim7的强烈染色紧紧地绑在孔耳周围的种子涂层表面GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba突变体(无花果。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bab和c）。很遗憾，我们无法检测全种子免疫标记和免疫印迹实验中LM2，MAC207和JIM8表位;然而，进行检测，并定位于小柱（参考图JIM13表位。GydF4y2Ba5.GydF4y2BaA4-L4)。JIM13是一种单克隆抗体，可检测agp相关的聚糖，特别是表位:β-GydF4y2BaD.GydF4y2Ba-GlcA-（1,3）-α-GydF4y2BaD.GydF4y2Ba联欢晚会- - - - - - -α-(1、2)GydF4y2BaL.GydF4y2Ba-RHA;[GydF4y2Ba52.GydF4y2Ba］.这一发现证实了早期的观察结果，即黏液中存在agp [GydF4y2Ba35GydF4y2Ba］.鉴于AGPS葡萄糖醛酸的鉴定在稳定APAP1中稳定果胶RG-I骨架的rhamosyl基残基的共价附着至AGPS的作用[GydF4y2Ba10GydF4y2Ba]，AGPs中GlcA残基的减少或丢失可能是导致AGPs中粘附层粘液松散的原因GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba突变体在水中温和释放在水中（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2BaC）。GydF4y2Ba

GLCAT14A的作用，并在GLCAT14C种皮的表皮细胞的发育GydF4y2Ba

成熟WT和WT的表面形貌GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba种子用SEM观察，调查β-中，GlcA是否在种皮表皮（SCE）细胞发育的作用。我们观察到，SCE细胞GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba种子因其多边形结构的坍塌而变形(图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba具体地说，我们观察到放射状细胞壁塌陷，同时柱状体的大小增加(图2)。GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba氟)。西方等GydF4y2Ba．GydF4y2Ba[GydF4y2Ba53.GydF4y2Ba，提示粘胶囊变小，小柱变平，导致粘胶囊合成量减少。这似乎是这里的情况，因为我们的数据显示在粘液挤压前柱状体的大小增加，而粘液挤压后柱状体的大小保持不变。这可能解释了为什么总黏液含量下降GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba突变体(无花果。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba）超前已知先于小柱形成较小的粘液口袋[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba］.显然，CESA2，CESA5和CESA9涉及径向细胞壁增强和霉菌沉积[GydF4y2Ba54.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba55.GydF4y2Ba，但其结晶纤维素含量的减少是否GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba种子可能影响了小柱的形成。值得注意的是，完全糖基化的fl4 / so5分子被鉴定为未充分运输到质膜的候选分子GydF4y2BaO.GydF4y2Ba-糖基化蛋白区域是液泡降解的目标[GydF4y2Ba56.GydF4y2Ba]. 在这种情况下，SOS5聚糖的修饰（即葡萄糖醛酸的损失）可能干扰了SOS5的细胞内运输[GydF4y2Ba56.GydF4y2Ba及其与FEI异位结构域的相互作用，从而影响黏液聚合物组装和SCE细胞形成(图。GydF4y2Ba10GydF4y2Ba）.我们观察到种子的大小显著减少GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba突变体(无花果。GydF4y2Ba9.GydF4y2BaA-C）相对于WT。虽然观察到在加尔增加GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba与野生型相比，这种增加并不显著。因此，β- glca终止β-(1→6)-半乳糖侧链延伸的假说有待进一步验证[GydF4y2Ba57.GydF4y2Ba］.GydF4y2Ba

我们对两种β-葡萄糖醛酸转移酶GLCAT14A和GLCAT14C进行了表征，并证明它们参与维持植物种子粘液多糖基质的组织GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba. 而基因敲除GydF4y2BaGLCAT14AGydF4y2Ba和GydF4y2BaGLCAT14CGydF4y2Ba不导致中，GlcA残基在种皮的AGPs的总损耗，其他的角色分担GydF4y2BaGLCATGydF4y2Ba待确定的基因在种子粘液遗迹。此外，GLCAT14A / C在GALT2GALT5 / SOS5 / FEI1FEI2途径，因为它涉及到细胞壁功能遗迹可能卷入进行调查。我们的研究结果在此处添加到将种子粘液生物合成关键基因的列表。将来调查在种皮参与细胞壁聚合物相互作用的生物化学将进一步提高我们的参与粘液组件和种皮发展底层机械过程的理解。GydF4y2Ba

植物系和植物生长条件GydF4y2Ba

Arabidopsis Thaliana Accestion Columbia-0（Col-0）和两个T-DNA插入线GydF4y2BaAT5G39990.GydF4y2Ba－(GydF4y2Baglcat14a-1GydF4y2Ba、Salk_064313和GydF4y2Baglcat14a-2GydF4y2Ba，salk_043905）和GydF4y2BaAt2g37585GydF4y2Ba- （GydF4y2Baglcat14c-1GydF4y2Ba；Salk_005705)从拟南芥生物资源中心(ABRC, Ohio State University)获得。种子在含有0.5% MS培养基的培养皿中发芽，在4°C黑暗下分层4天后，在生长室中长日条件(光照16 h /黑暗8 h, 22°C, 60%湿度)下生长。幼苗于7天后移栽，在长日照条件下(光照16 h /黑暗8 h, 22℃，湿度60%)生长。这GydF4y2Baglcat14a-1glcat14c-1GydF4y2Ba从两个单突变亲本杂交的F2群体中分离得到双突变体。GydF4y2Ba

通过PCR和qRT-PCR验证突变体GydF4y2Ba

利用基因特异性引物结合LBb1.3插入特异性引物，采用2 × CTAB法提取突变植株的DNA，进行基因分型(表SGydF4y2Ba1GydF4y2Ba)针对如图所示的特定区域。GydF4y2Ba2GydF4y2Bab在PCR中。分析转录水平GydF4y2BaGLCAT14AGydF4y2Ba和GydF4y2BaGLCAT14CGydF4y2Ba在突变体中，总RNA，长角果在直线子叶阶段（8 DAP）萃取。RNA（1微克）用于第一链cDNA合成与寡核苷酸（DT20）引物和Superscript III逆转录酶（Thermo Scientific）进行沿。qPCR的是使用适当的qPCR引物（表秒内未执行GydF4y2Ba1GydF4y2Ba)下面介绍以下步骤[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]. 此外GydF4y2BaGLCAT14AGydF4y2Ba和GydF4y2BaGLCAT14CGydF4y2Ba还使用拟南芥种子涂层特异性表达式浏览器检查种子涂层开发过程中的表达（GydF4y2Bahttp://bar.utoronto.ca/efp_seedcoat/cgi-bin/efpWeb.cgiGydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

粘液含量的测定GydF4y2Ba

将野生型、单突变体和双突变体种子的100 mg独立样本精确称重，在1ml蒸馏水中大力摇匀5min，分离出非粘附黏液。上清完全转移到分离的管中。将1 mL蒸馏水加入到剩余的种子中，超声处理20 s [GydF4y2Ba58.GydF4y2Ba]在室温下，使用100型声波分离膜，探针强度设置为1。将上清液转移到Eppendorf管中以形成非粘附性粘液。将非粘附和粘附粘液内容物冷冻干燥并称重以确定粘液内容物。GydF4y2Ba

显微与图像分析GydF4y2Ba

钌红染色和粘液区的定量GydF4y2Ba

野生型和突变体的成熟干种子用蒸馏水和50 mM CaCl水合GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba，50 mm EDTA，pH 8.0和1米NAGydF4y2Ba_2GydF4y2BaCO.GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba30分钟后，用水洗涤，然后用钌红（RR）染色使用0.01％RR（Sigma公司，圣路易斯，MO，USA）在室温下染色30分钟如别处所描述[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba］.用25 μg/ml荧光增白剂28 (Sigma)在室温下染色20分钟，如前所述[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba］.在这两种情况下，用旋转器摇动种子，用尼康SMZ1500立体显微镜和CCD Infinity 2相机拍摄钌红染色的种子，用蔡司LSM 510共聚焦显微镜拍摄钙氟染色的种子。如前所述，对在水和50 mM EDTA中水化的成熟种子进行Pontamine染色[GydF4y2Ba25GydF4y2Ba]使用0.01％滂胺坚牢猩红S4B（Sigma）的50mM NaCl中30分钟。种子然后利用共聚焦显微镜去沾上水四次考试前。干燥成熟种子在12孔板含有0.01％滴入钌红染色无晃动和晃动很短暂后，用光学显微镜获得的图像。钌红染色的粘胶区是使用斐济（ImageJ的）如先前所述定量[GydF4y2Ba59.GydF4y2Ba］.感兴趣区域（ROI）中斐济被分段，并且使用分析功能的颗粒，测定针对所述ROI的区域。粘液一种rea was obtained by subtracting Seed area from Seed + Mucilage. Evaluation of statistical significance was conducted using R program by Tukey–Kramer HSD (P.GydF4y2Ba < 0.05).

免疫组织化学GydF4y2Ba

根据发表的方法进行全种子免疫标记，除了在免疫标记之前将种子在水中摇动并且在免疫标记后用S4b染色种子[GydF4y2Ba60.GydF4y2Ba］.简单地说，将成熟的干种子在pH为7.4的PBS (phosphate-buffered saline, PBS)中摇匀1小时，去除上清液(含可溶性黏液成分)，其余黏液紧密结合的种子进行免疫荧光处理，方法如下:种子在5% BSA和PBS中摇匀30分钟，PBS洗涤，与一抗CCRC-M35孵育[GydF4y2Ba34GydF4y2Ba] 1/10稀释在1％BSA在PBS中1.5小时。不作为阴性对照的初级抗体处理的样品。第一抗体JIM5，JIM7，JIM13和CCRC-M35（CarboSource）的特异性已被广泛描述[GydF4y2Ba34GydF4y2Ba］.主要特异于结晶纤维素的CBM3a和主要特异于无定形纤维素区域的CBM28 [GydF4y2Ba27GydF4y2Ba[在用小鼠抗组氨酸（QIAGEN）处理之前，在相同的溶液中被视为原发性抗体。与Alexafluor488缀合的山羊抗大鼠二抗针对Jim5，Jim7和Jim13使用，而山羊抗小鼠与Alexafluor488（分子探针; Invitrogen）缀合物，用作CCRC-M35和CBMS的二级和三级抗体，稀释1/ 100在PBS中1％BSA为1.5小时。免疫标有的种子用S4b染色[GydF4y2Ba44GydF4y2Ba]并使用蔡司LSM 510共焦显微镜成像。每个抗体处理的信号强度在不同基因型之间保持不变；然而，不同处理的信号强度不同。使用imageJ进一步处理共焦显微照片[GydF4y2Ba61.GydF4y2Ba]GydF4y2Ba

CCRC-M35的酶联免疫吸附试验(ELISA)GydF4y2Ba

精确称量野生型、单突变体和双突变体的种子（5mg），并通过在1ml蒸馏水中剧烈摇动5min提取，以分离非粘附粘液。将上清液完全转移到单独的试管中。向剩余的种子中添加1毫升蒸馏水，并进行超声波处理20秒[GydF4y2Ba58.GydF4y2Ba]在室温下，使用带有探头强度的Sonic Dismber型号100设定为1.上清液转移到Eppendorf管中以形成非粘附的粘膜。将两百（200μl）的粘液提取物转移到96孔ELISA板上的四个孔（3598;康宁，Wiesbaden，德国），而200μlmilliq水用作阴性对照。elisa是在别处描述的以下方法进行的[GydF4y2Ba62.GydF4y2Ba]，用Synergy H1酶标仪(BioTek, Bad Friedrichshall, Germany)读取450 nm和655 nm处吸收值的差值作为光密度(OD)值。每口测试井的读数减去阴性对照井的读数。GydF4y2Ba

斑点免疫印迹试验GydF4y2Ba

非粘附和粘附的粘液提取物（1毫克/毫升）再悬浮在水冷冻干燥之后。一系列稀释液制备和1微升等分试样点样到硝酸纤维素膜（默克Millipore）上。空气干燥后，将膜封闭在PBS中的3％BSA 1个小时，然后将其在初级抗体的稀释十倍温育1.5小时。洗涤后三次，用PBS，将膜温育在辣根过氧化物酶（HRP）1.5小时偶联的在1000倍稀释的抗大鼠（对于JIM5和JIM7）或抗 - 小鼠（对于M35 CCRC）的第二抗体在1％BSA于PBS中。Membranes were washed prior to color development in substrate solution [25 mL de-ionized water, 5 mL methanol containing 10 mg mL − 1, 4-chloro-1-naphthol and 30 μl 6% (v/v) H_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba］.温育在室温下30分钟后，将印迹与去离子水漂洗，并拍照。GydF4y2Ba

扫描电子显微镜GydF4y2Ba

使用JEOL JSM-6390扫描电子显微镜（日立高新技术）种皮形态进行了研究。采用双层粘合剂tapestubs种子被安装在铝存根和溅涂使用Cressington 208C高分辨率溅射镀膜机（特德佩拉公司）钯合金。电子显微照片进行处理并且使用ImageJ [测量GydF4y2Ba61.GydF4y2Ba］.GydF4y2Ba

单糖组成的通过HPAEC和总糖含量的测定。GydF4y2Ba

非粘附和粘附的粘液和整个种子醇不溶性残渣如前所述（AIR）的萃取物进行了[GydF4y2Ba58.GydF4y2Ba］.将100微升粘膜萃取物（粘附和非粘附剂）和50μl10mg/ ml空气转移到玻璃管中，并在121℃下在121℃下使用2n三氟乙酸（TFA）水解90分钟。用n蒸发除去TFAGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba气体。样品以含0.2 mM纤维二糖的500 μL milliq水为内标。标准糖混合物(焦糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸)被用来制作标准曲线。单糖组成以摩尔百分比(mol %)和绝对含量(μg/mg种子)计算。所有样品和标准品均使用Dionex PA-20色谱柱(Thermo Fisher Scientific, Sunnyvale, CA, USA)进行高pH阴离子交换色谱-脉冲安培检测(HPAEC-PAD)，基本如下所述[GydF4y2Ba63.GydF4y2Ba］.GydF4y2Ba

总糖(μg/mg种子)采用苯酚-硫酸法测定[GydF4y2Ba64.GydF4y2Ba]用0.2%草酸铵、0.2 N和2 N氢氧化钠连续提取1 h后，在37°C下剧烈摇晃。GydF4y2Ba

结晶纤维素的观察和测定GydF4y2Ba

为了测定的结晶纤维素含量，1毫升蒸馏水的溶液中加入到10mg成熟干种子的和如先前所描述进行20秒超声波处理[GydF4y2Ba58.GydF4y2Ba在室温下。将上清转移到一个单独的管中，将去黏液的种子保存以便进一步分析。用钢球将大约10(10)毫克的种子(记录准确重量)与去胶种子一起研磨5分钟。用1 mL 70% (v/v)乙醇连续两次洗涤分离去胶种子和整粒种子中的空气，并在13200离心10分钟GydF4y2BaGGydF4y2Ba．以1:1 (v/v)氯仿:甲醇洗涤，丙酮洗涤，60℃干燥5 min。然后按上文所述测定晶体纤维素含量[GydF4y2Ba65.GydF4y2Ba，稍作修改。2 mg干AIR(全籽和去胶籽)和500 μl前提取的总胶，与1 mL Updegraff试剂(醋酸:硝酸:水，8:1:2 [v/v])混合，100℃孵育30 min [GydF4y2Ba65.GydF4y2Ba］.水解后，用清水冲洗一次，丙酮冲洗一次，干燥后用200 μL 72% (v/v)硫酸水解。使用蒽酮试剂在620 nm分光光度计中比色法定量晶体纤维素量[GydF4y2Ba65.GydF4y2Ba]. 种子也被安装在显微镜载玻片上的水中，并用配备有偏振滤光片的荧光显微镜观察所研究基因型中任何结晶纤维素的双折射。GydF4y2Ba

HG中钙、DM含量的糖醛酸测定和生化测定GydF4y2Ba

采用上述方法，将20 mg成熟干种子在500 μL蒸馏水中振荡提取整个粘液。甲基化度(DM):将200μL上清转移到新管中，用0.25 M NaOH在室温下旋转管皂化1 h。0.25 M HCl中和反应(总体积600μL)， 10000 g离心10分钟。用比色法测定皂化反应后的甲醇释放量[GydF4y2Ba66.GydF4y2Ba］.将五百微升的上清液转移到新的1.5ml管中，用0.5单位的醇氧化酶（Sigma-Aldrich）在25℃下氧化15分钟，并用500μl新制备的0.02m 2,4-戊酰胺温育（溶于2M乙酸铵和0.05μm乙酸），在60℃下以1mL总体积在60℃下溶解15分钟。在冰上冷却2分钟后，在412nm下测量吸光度并使用甲醇标准曲线定量。GydF4y2Ba

糖醛酸含量采用间羟基二苯基法测定[GydF4y2Ba67.GydF4y2Ba]使用Gala作为标准。将一百μl皂化的粘液溶液转移到新的1.5ml微量纤维管中，并用1.2ml含有0.0125μm硫酸钠（Sigma-Aldrich）的浓硫酸（Sigma-Aldrich）以100℃加氢5分钟。在冰上冷却样品后，加入25μl0.15％（w / v）羟基羟基苯基（Sigma-Aldrich），加入0.5％（w / v）NaOH，在525nm下测量吸光度。粘液提取物中的Hg的DM计算为甲醇与尿酸甲醇的百分比摩尔比[GydF4y2Ba68.GydF4y2Ba］.用前面介绍的方法从AIR样品中估计去胶和全籽的糖醛酸含量[GydF4y2Ba41GydF4y2Ba］.为了估计钙含量，按照制造商的方案，使用了一个商用钙比色测定试剂盒(MAK022, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)进行钙测量。黏液提取后，总黏液提取液中的钙离子与检测试剂盒中的邻甲酚酞形成复合物，导致颜色从透明变为粉红色。用紫外分光光度法测定钙的含量GydF4y2Ba_575GydF4y2Ba并用不同浓度的氯化钙制成标准曲线GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba数值用百分比表示。GydF4y2Ba

在本研究中使用和/或分析的数据集可在合理要求下从通讯作者处获得。GydF4y2Ba

我们感谢Alexander Ford帮助使用图形设计。我们还要感谢以下本科生，Savannah Bisson，Sean McGovern和Weiheng Yu和Ashton Smith，用于帮助突变体筛查和表型分析。我们还感谢Yuan Zhang博士进行验证阅读和在稿件上提供质量反馈。这项工作得到了俄亥俄大学学生增强奖的支持;俄亥俄大学的A＆S研究生研究基金;和纳米级和量子现象研究所（NQPI）俄亥俄大学的奖学金。MH希望承认Nifa-USDA-AFRI探索性研究计划，奖励2019-67030-29670。该工作得到了从国家研究资源研究资源中心的研究设施改进计划补助金奖励号码C06 RR-014575-01所建造的工具支持。GydF4y2Ba

这项工作是由来自俄亥俄大学贝克基金A.M.S.的资助出资者必须在实验设计，数据分析，决定发表或准备手稿没有作用。GydF4y2Ba

隶属关系GydF4y2Ba

1. 环境与植物生物学，俄亥俄州立大学，雅典，OH，45701，USA系GydF4y2Ba

   Oyeyemi O. Ajayi & Allan M. ShowalterGydF4y2Ba

2. 俄亥俄大学分子与细胞生物学专业，雅典45701，美国GydF4y2Ba

   Oyeyemi O. Ajayi，Michael A.举行＆Allan M. ShowalterGydF4y2Ba

3. 俄亥俄大学化学与生物化学系，雅典45701，美国GydF4y2Ba

   Michael a .举行GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

OA进行了实验，解释了稿件数据并起草了大部分手稿。MH帮助了单糖组成分析和校对手稿。OA和AMS构思了这项研究并写了稿件。所有作者都读过并批准了稿件。GydF4y2Ba

相应的作者GydF4y2Ba

对应到GydF4y2BaAllan M. Showalter.GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

道德认可和参与意愿GydF4y2Ba

不是Aplicable。GydF4y2Ba

出版物的浓度GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

相互竞争的利益GydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。艾伦M. Showalter的是这个期刊的编辑部（即，副主编）的成员。GydF4y2Ba

出版商的注意GydF4y2Ba

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。GydF4y2Ba

开放获取GydF4y2Ba本文根据知识共享署名4.0国际许可证获得许可，该许可证允许以任何媒体或格式使用、共享、改编、分发和复制，前提是您给予原作者和来源适当的信任，提供知识共享许可证的链接，并说明是否进行了更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的知识共享许可证中，除非在材料信用额度中另有说明。如果文章的知识共享许可证中未包含材料，且您的预期用途未经法定法规许可或超出许可用途，则您需要直接获得版权持有人的许可。要查看此许可证的副本，请访问GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba．创作共用及公共领域专用豁免书(GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba)适用于本文提供的数据，除非在数据的信贷额度中另有说明。GydF4y2Ba

再版和权限GydF4y2Ba