与砧木诱导的矮化患者在面包屑中相关的差分转录途径（面包果altilis）分区

背景

面包果（面包果altilis）在整个热带地区都是传统的主食。通过表现覆盖率，玛朗（mar）鉴定了植物高度超过50％的矮化表型（香波罗）使用rootstocks。然而，砧木诱导的面包果矮化矮化的分子机制尚未理解。

结果

接枝识别5409倍差异表达的基因，其中2069个上调，3339是在下调的接穗上马江砧木茎相比，这些自我接枝（DEGS）后在22个月面包果接穗的RNA测序研究。所述DEGS被主要富集涉及碳代谢，细胞壁组织，植物激素信号转导和氧化还原平衡的生物过程。编码液泡酸转化酶和碱性/中性转化酶的基因的下调，是一致的与两种酶的活性降低，具有较高的蔗糖，但较低的葡萄糖和果糖水平在组织中伴随。的生物合成途径氨基酸，脂质和细胞壁的关键基因下调，这反映出对矮化砧木茎生长减少蔗糖利用的。在接穗编码糖转运蛋白，氨基酸转运蛋白，胆碱转运蛋白，随着大量钾通道和水通道蛋白家族成员的基因表达下调茎上马江砧木。质膜H较低的活性⁺- atp酶，以及编码扩张蛋白、壁相关受体激酶和纤维素、木葡聚糖和果胶生物合成和重组关键酶的基因的优势表明，下调的DGEs表明细胞扩张受到损害。下调的DEGs以生长素和赤霉素的信号通路、独角兽和油菜素内酯生物合成基因为主。在马朗砧木上，苯丙素途径富集，关键木质素生物合成基因下调，类黄酮生物合成基因上调。上调的DEGs显著富集水杨酸、茉莉酸、乙烯和MAPK级联信号通路。

结论

提出了调节养分转运，蔗糖利用，细胞壁生物合成和激素转导网络的途径中断，以损害细胞膨胀和茎伸长率，导致面包果区中的矮化表型。该信息提供了开发砧木育种和选择面包果矮化的筛选策略的机会。

矮小的树木有利于高密度种植、树木管理和收获。在温带果树栽培中，通过矮化砧木的广泛应用，实现了果树矮化。尽管砧木诱导矮化的重要性，但其潜在的机制尚不清楚。面包果(面包果altilis（帕金森）Fosberg）是从15到20米到20米的热带树。该物种主要是作为能量食品的，复合碳水化合物，维生素和矿物质来源，并被视为热带地区的食品安全作物[1］．转型向高密度的商业化种植，以及树造成的损失在各地区的强热带风暴已经推动小型面包树的兴趣[2］．面包果有数百个品种，在形态和农艺特性上有很大的多样性[1，但该物种的矮种尚未被报道。通过种间嫁接，马朗(香波罗布兰科）被确定为相比，这些自我移植物和标准的，非接枝的面包果植物[大小控制砧木赋予在面包果接穗尺寸减小50％以上，用较短的超过70％的间长3.那4.］．在马朗砧木上生长的面包果植物除了矮小之外生长正常，这为在商业栽培中控制树木活力提供了一种潜在的解决方案[3.］．在相同的属中arocarpus.，Marang也是25米的大型热带果树，没有识别矮化表型。关于当用作砧木时，玛朗大大减少了其接枝间隙的树尺寸的迷人交互过程。

对于根茎诱导的矮化，人们提出了几种生理机制。首先，嫁接结合周围的解剖变化被认为是砧木和接穗之间营养物质、激素或其他信号运动的障碍[5.］．通过嫁接结合减少溶质和水分运输被认为是砧诱导矮化的原因[6.那7.］．液压电导显示随着苹果砧木的活力增加[7.］．在茎矮化砧木[在桃树干伸长率的降低率为关联于降低水势6.］．矮化的樱桃砧木接枝限制了可溶性糖的运输或淀粉的调动，导致营养生长下降[8.］．另一种假设包括发生在接穗和砧木之间的激素信号改变[9.那10.］．从嫁接植株地上部分减少生长素运输已被提出，以限制根的生长和供应给茎生长的细胞分裂素的产生[9.］．已经显示矮化苹果砧木，限制了根系生产的甘油酸（GA）前体，GA_19.对接穗[10.那11.那12.]，因此，矮化砧木上苹果接穗施用赤霉素可恢复一轴和二次枝的节数[13.］．先前外源GA处理也显示恢复生长在马朗砧木上面包果接穗的茎伸长率和节间长度[4.］．另一方面，Apple Dwarfing砧木上的粘液组织中脱落酸（ABA）浓度较高[10.］．黄酮类化合物的过度积累也被认为会影响矮化苹果砧木上生长素水平和接穗生长[9.那14.］．这些机制中的几次已经过多次测试了，也已经显示出不一致的结果[15.］．

作为了解马朗砧木诱导面包果矮化的分子机制的第一步，我们进行了rna测序研究，结合比较生化分析，以确定在不同砧木上生长的面包果接穗表型变异的生物学过程。为了更好地描述与砧木反应相关的差异基因表达，我们重新组装了接穗茎转录组，并使用转录组比较来识别与茎伸长生长相关的基因队列和调控途径。该研究为面包果矮化的功能研究和矮化砧木育种提供了有价值的基因资源。

砧木对面包果接穗生长特性的影响

马朗砧木上面包果植株的身高明显低于标准非嫁接植株和自嫁接植株，嫁接后18 ~ 26个月，接穗茎高比自嫁接植株低约58%(图2)。1A和B）。有没有在自我移植和非移植的生长习性没有差异。除了是侏儒，马江上砧木面包果植物温室电流条件下正常生长。同那些自我移植的，所有这些植物显示从顶芽或腋芽和顶点绿叶的不断涌现新的节间逐步发展（见图榜样形象1）.与嫁接后3至18个月的生长参数相比[3.] 26个月的生长分析（表S.1)表明，随着接穗高度、茎粗和节数的增加，两种接枝类型植株均有显著的生长。然而，马朗砧木上的植株继续表现出矮小和茎粗的减少，但茎节数没有变化。虽然这些植株的叶片较小，但其他叶片性状，如叶片颜色和叶片形状没有变化。1;数字1）.作为接枝植物的性能和砧木的商业应用不仅取决于CRION和砧木的基因型，还取决于砧木与枝条的相容性[16.那17.那18.因此，有必要对面包果/马朗的接枝组合进行研究。接穗/砧木结合的解剖检查已经成为一种明确识别木本植物嫁接不亲和性的方法[19.那20.那21.］．首先在移植后26个月对3个种间移植物的移植物结合进行移植物界面解剖检查。结果表明，面包果/马朗嫁接与树皮和木材中几乎不可见的嫁接株系具有良好的相容性(A类，参见方法，也[22.]）在检查的所有移植工会中，树皮和木材之间没有不连续性（在检查的所有移植工会中（参见图S中的示例图像）2）.杆直径的上方和下方嫁接结合的比值常常被用来与接枝相关成分不相容的生长特性[19.那20.那21.］．在与解剖学评估一致的情况下，面包果/玛朗组合中的下隙与砧木茎直径的比例非常接近1，自移植物和三个剥离的剥离之间没有显着差异（表S.1）.Chion叶片叶绿素（CHL）浓度，反映了复合嫁接设备的碳同化和正常运作的能力，也用作了非破坏性工具，以识别移植物不相容性[19.那20.那21.］．其中，马朗砧木上的接穗叶片叶绿素浓度，包括Chl一个的背影,b的背影,一个 + Chlb,排名a / b与自体移植无显著性差异(表S1）.与结果一致，通过非破坏性方法的叶绿素每月测量叶绿素的测量也没有在任何时间点叶片在不同的砧木上叶片的总叶绿素没有差异[3.］．此外，三年和2年间之间的三年和三年之间的相容率没有差异（图S1）.这些证据在一起证实，面包果/ Marang组合的移植物在嫁接后的26个月内具有良好的兼容性。因此，玛兰根罗克斯上的面包果区段的矮化表型与移植不相容性无关。

在嫁接后22个月进一步测定非结构性碳水化合物含量(NSC)。1c).马朗砧木接穗茎中葡萄糖和果糖含量显著降低，蔗糖含量显著升高，与自嫁接相比，葡萄糖和果糖含量分别降低84.5%和74.7%，蔗糖含量增加214%以上。所有样品的淀粉含量没有显著差异(图。1C）。

面包果接穗茎转录组分析

首先，转录组文库是De Novo组装用于面包果蝇茎。它包括总共520.6百万个配对末端读取（2×150bp），从所有样品中排序生成。过滤原始读数后，总共生产了516.2百万百万个干净的配对读数，95.0％具有耐比质量得分≥Q20。所有清洁读数都是DE Novo组装成212,878个Contigs（> 297 bp），N50为2928 bp和96.8％在最终的转录组合组件中完成基准通用单拷贝正轨（Busco）（表S2）.Unigenes通过针对各种公共数据库查询注释（参见方法）。结果，77,390（61.41％）unigenes与其中一个或多个数据库匹配。组装的Unigene序列可在NCBI Bioproject数据库中获得（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/)，生物工程编号:PRJNA679862。

为了确定与砧木诱导矮化相关的整体基因表达模式，在嫁接后22个月，从不同砧木上生长的第2个节间提取的总RNA，在Illumina平台上进行RNA测序(RNA-seq)(见Methods)。每个生物复制产生了3200万至4500万个干净的配对端reads，其中92.9%至95.5%映射回组装好的转录组(表S2）.使用截止调整p< 0.05 & |日志₂折叠变化|≥1，鉴定了总共5409个差异表达的基因（DEG），包括2069个上调和3339个中调节和3339个下调基因在与自移植物上的玛兰砧木上生长在Marang Rootstock上（图。2）.顶部主要参数包括编码Bet_v1样病理相关蛋白，过氧化物酶10，逐碱酶和Wuschel相关的Homeobox 1的上调基因，所有这些都有日志₂FC > 6、液泡样酸性转化酶、钾通道AKT1、-胡萝卜素异构酶(DWARF27)和聚半乳糖醛酸酶基因下调，均有Log₂Fc <-5（图。2C）。

基因本体分析(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)对DEGs进行富集。在GO分析中，所有的deg都用GO术语进行注释，并分为三个本体:生物过程、分子功能和细胞成分。富集氧化石墨烯的前20项(图。3.)，碳水化合物代谢过程和细胞对刺激的反应是最丰富的生物学过程。调控营养生长的生物过程高度丰富，包括对蓝光的响应和细胞壁组织或生物发生。细胞保护过程，如磷接力信号转导系统、防御反应和细胞解毒作用也被富集(图)。3.a). DEGs主要富集于过氧化氢氧化还原酶活性、过氧化物酶活性和抗氧化活性相关的分子功能，细胞外周和细胞外区域是主要的细胞成分(图)。3.b）。在上调或下调度的视角中进一步分析GO富集。这些发现与活性氧物质（ROS）的代谢过程中，响应于氧化应激和细胞氧化剂解毒生物过程是最富集的GO术语在上调的基因，和生物过程参与核酸代谢过程，高分子修饰和细胞壁组织或生物合成分别在下调的基因主要富集（图3.c).在20条最丰富的KEGG通路中，主要包括次生代谢产物的生物合成、碳代谢和植物激素信号转导(图2)。3.d）。高度富集的途径还包括植物病原体相互作用，MAPK信号通路，苯丙烷化生物合成和点燃的受体信号传导途径，与与细胞保护方法相关的富集的GO术语一致（图。3.）.

参与营养转运和原发性代谢的基因

膜转运蛋白在促进植物离子和溶质的转运发挥关键作用，他们的活动影响碳分配和植物生长[23.］．与自移植物相比，鉴定为成员转运蛋白基因的246次鉴定为成员转运蛋白基因的总共161种，其茎（表S3.， 桌子1）.这些包括编码蔗糖/ h的基因⁺Symporter Sut1，铜绿素局部化的Sut4样，糖果，胆碱转运蛋白，以及大量的氨基酸转运蛋白（8℃），调色剂二羧酸酯转运蛋白（11次），水素/主要内在蛋白质（26次）和钾和钾通道（AKT1,5°; AKT2 / 3,4°;钾通道冰鞋，11次，表S3.）.编码血浆膜（PM）H的大量基因⁺-Atpase被下调（18只折痕中的13个，表S3.）.PM H活性降低⁺- atp酶以前在马朗砧木嫁接后12个月和18个月的接穗茎中发现[3.[22个月，还发现酶的活性降低，与自移植物相比，减少了36.6％（图。4.一种）。

在蔗糖新陈代谢中，将总共29只鉴定为转化酶基因，包括用于真空酸转化的基因（SAI，20℃）和碱性/中性转化酶（NIVS，9℃），但是10℃编码蔗糖合成酶（Susy）在Scion茎上调节玛兰根罗克斯（表S3.）.蔗糖磷酸合酶基因表达没有变化（表S.3.）.始终如一地，显着降低SAI和NIV的活性，但在这些组织中发现了苏比的较高活动，SAI减少了77.9％，NIV减少54.2％，但与自移植相比，SASY的增加40.8％（图。4.b）。

用于生物合成的淀粉，氨基酸和脂肪酸的键基因在玛兰根罗克斯的Chion茎中调节（表1，表S.3.）.这些包括淀粉合酶的基因（8次，表S3.）淀粉生物合成中的颗粒结合的淀粉合酶;用于5-甲基四氢替替洛酰丁基酯 - 同型半胱氨酸甲基转移酶（METE），氨基酸生物合成中的丝氨酸羟甲基转移酶（DAHP合成酶，3-DHQ酶，AROC）的基因;脂肪酸生物合成脂肪酸合成酶II和脂肪酰基-ACP硫酯酶B的基因（表1）.与此相反，涉及这些化合物降解的基因普遍上调，如α-淀粉酶、nadp特异性谷氨酸脱氢酶和烯酰辅酶a水合酶/3-羟基酰基辅酶a脱氢酶基因(表)1）.

参与植物激素代谢和信号的基因

生长素激活的信号通路在下调的DEGs中富集(图)。3.）.一种yucca.编码黄蛋白单氧基酶的基因，其将吲哚-3-丙酮酸（IPA）转化为吲哚-3-乙酸（IAA）[24.]，被调节（表2）.其他下调的生长素相关基因包括生长素流出载体PIN3基因与七PIN-like基因（表S3.），两个助流吹气载体辅助/松懈基因，两种植物相互作用因子4（PIF4.)基因和生长素反应因子ARF.基因(表2）.相比之下，参与生长素分解代谢和稳态的基因，包括2-氧戊二酸依赖性双加氧酶DAO和吲哚-3-乙酸-氨基合成酶GH3.6的基因上调(表)2）.该DEGS包括早期生长素应答基因组，辅助/ IAA(8度上升，6度下降)，格雷琴·哈根GH3.（中4个中的3个）和小型养蛋白上调的RNA（Saur）基因（Saur50.，1°，最多;SAUR21， 2度，下降;SAUR36， 2度，下降;表的年代3.）.

编码赤霉素20氧化酶(GA20oxs, 3 DEGs)转化GA的基因_12.或遗传算法₅₃对遗传算法_9.或遗传算法_20.和编码基因贝壳杉烯氧化酶（GA3s，2度的视角）催化贝壳杉烯氧化成ENT-贝壳杉烯酸[25.]，在Scion茎上调节在玛兰根罗克斯（表2）.相反，编码Della蛋白（2℃）和GID1B蛋白的基因（6℃，表S3.），则GA受体与DELLA蛋白相互作用[26.]，被上调。

三个异戊基转移酶基因(IPTS.）编码细胞蛋白（CK）生物合成中的速率限制酶[27.]，以及编码组氨酸磷酸转移蛋白的基因和B型拟南芥反应调节基因(ARR)，在矮化砧木的茎中上调(表2）.b型arr下游靶标，编码转录因子WUSCHEL的基因[28.]，高度上调（图。2C）。

芸苔类固醇（BRS）是生长促进的类固醇激素调节生理过程的多个方面，并且BR信号传导中断通常是侏儒症（侏儒）的深刻形态缺陷的特征29.］．在干矮化砧组织表现出下调的四个基因参与BR合成，其中包括三个油菜素内酯-6-氧化酶基因和一个CYP90A1基因(表2）.然而，大多数与BR转导相关的基因的表达没有显着改变。胞嘧啶是一种类胡萝卜素衍生的激素，可控制植物生长的射击分支和多样化方面[30.］．独角兽内酯生物合成基因，矮人27（5次）高度调节（日志₂Fc在玛兰根罗克斯的茎中从-7.8至-4.5分;图。2c;表的年代3.）.这矮人14.Seto等人的研究发现，α/β水解酶蛋白受体与独角兽内酯的感知和失活有关。[31.，在这些组织中有差异调节(表2）.

对应激相关的激素，与乙烯转导中的关键组分相关的基因在Dwarfing砧木上的茎中调节（表2，表S.3.）.其中包括编码1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(ACOs)的3个deg和编码乙烯响应转录因子的20个deg，如ERFs(6个deg)、AP2/ERF(11个deg)和RAP2-3(3个deg)。在茉莉酸(JA)信号转导中，参与生物活性茉莉酸- l-异亮氨酸(JA- ile)生产的茉莉酸-氨基酸合成酶(jar1,5 DEGs)基因表达上调，而茉莉酸信号转导的负调控因子茉莉酸- l-异亮氨酸(JA- ile)的茉莉酸-氨基酸合成酶(JAZ, 3 DEGs)基因表达上调[26.在这些组织中]，表达下调（表2）.在水杨酸(SA)信号转导中，编码异chorismate合酶的两个基因和编码水杨酸3-羟化酶的一个基因，该酶参与2,5-二羟基苯甲酸的生物合成[32.，还有两个PR-1在矮化砧木上，接穗茎中基因表达上调2）.

基因编码玉米黄质环氧化酶(ZEP)下调是在DEGs中检测到的唯一ABA生物合成基因(表)2）.然而，总共有10个编码ABA分解代谢的脱落酸8'-羟化酶的DEGs [33.]，被调控（表S1）.编码ABA响应元结合因子（ABF）的基因进行了下调，以及编码碱性亮氨酸拉链的基因（B-ZIP，11点中的8个，表S4.）.

参与细胞壁生物合成和细胞扩增基因

编码纤维素合成酶CESA1（4℃），CESA2（3℃），CESA3（2℃）和CESA6（1℃）的基因在玛兰根罗克斯的区分中调节（表3.）.下调的Degs包括参与Xyloglucan生物合成的三葡聚糖半乳糖基转移酶（XLT2或MUR3）的三个基因，以及编码木糖葡聚糖内凝血糖基酶/水解酶（XTH6）的两种基因，壁重新启动酶[34.］．在这些组织中有编码半乳聚糖的β-1,4-半乳糖基，果胶合成酶，和11度的视角编码果胶乙酰酯酶5度的视角，涉及果胶脱乙酰酶，所有表达下调（表S =3.）.甘露聚糖1,4-beta甘露糖苷酶基因(2个deg)和果胶裂解酶基因(17个deg)也下调(表)3.，表S.3.）.然而，两次编码葡聚糖内肠-1,3-β-葡糖苷酶，所涉及降解核糖（β-1,3 glulcan）的酶被上调。

扩展蛋白是通过它们的非酶细胞壁松弛能力介导酸诱导的细胞膨胀细胞壁蛋白家族[34.］．有29只均为扩展蛋白，所有人都在玛兰根罗克斯的茎上下调（表S.3.）.编码壁相关的受体激酶（Wak）的五次egs，细胞扩张所需的果胶受体系列[35.在相同的组织中]，和编码fasciclin状阿拉伯半乳聚糖蛋白质（FLA文件）4度的视角，表达下调（表3.）.参与细胞分离和细胞壁修饰的基因[34.]，如聚半乳糖醛酸酶(20个deg)和果胶酯酶(8个deg)基因也下调(Tale S2)。

参与次级代谢的基因

苯丙醇丙烷途径为许多次生代谢物提供前体，包括单醇和黄酮类化合物[36.］．KEGG分析表明该途径在DEGs中富集(图)。3.）.特别地，编码p-coumaroyl酯3-羟基酶（c3'h，3℃）和quinate / shikimate p-羟基氨基酰基酰基酰基酰基 - 转移酶（Hct，5℃）的基因在玛兰根罗克斯的茎上调节，而涉及后一步的基因上调苯丙烷型途径（表4.， 无花果。5.）.C3'H和HCT的活性为主要木质素生物合成途径提供进入，导致G-和S型单溶胶[37.］．黄酮类化合物对植物生长和抗逆性至关重要。共12个与类黄酮生物合成相关的基因表达上调(表)4.）在茎上矮化砧木。这些包括查耳酮合酶（CHS）参与类黄酮合成的第一个关键步骤的基因[38.]，一个双功能二氢黄酮醇4-还原酶/黄酮4-还原酶基因，参与花青素和原花青素生物合成的后期关键步骤[38.]，一个黄酮3-羟化酶基因(F3H)和一个花青素合成酶基因。

参与异戊二烯生物合成的基因在玛兰砧木上的下调茎中，例如编码牛键合酶，脊烯合酶，角鲨烯合酶和Linalool合酶的基因，以及编码β-亚芳基内合成酶/倍二萜合酶的6℃（表4.，表S.3.）.

参与氧化还原稳态和国防反应的基因

矮化砧木的接穗茎中大量ros相关基因上调(表1)5.)，如过氧化物酶(4个DEGs，一个与logFC > 7)，谷胱甘肽转移酶GST23(2个DEGs)和硫氧还蛋白1(4个DEGs)基因。上调的DEGs还包括一个编码血红素加氧酶(HO-1)的基因，该基因参与血红素切割和胆绿素的生产，胆绿素是一种强抗氧化剂细胞保护剂[39.]和编码过氧基金酶的2个基因，其中一组含有含氢过氧化物依赖性的氧化氧，参与奥氧哌汀生产[40］．硫胺素(一种有效的抗氧化剂)生物合成的关键基因也在这些组织中上调(见表)5.，表S.3.），包括编码硫胺素噻唑合酶基因（THI1，3度的视角），半胱氨酸依赖性二磷酸腺苷噻唑合酶（THI4，1 DEG）和phosphomethylpyrimidine合酶（THIC，8度的视角）。

编码MAPK级联，钙信号传导和NOD样受体信号传导途径中的关键部件的基因在矮刀砧木上的茎上上调（表S.4.，表S.3.）.这些包括编码钙调蛋白样蛋白CML29的基因，钙素脲B样蛋白，循环核苷酸门控通道参与应力诱导的Ca₂⁺涌入(41]，电压依赖性阴离子通道，丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2B调节亚基(表5.），随着大量的痕迹转录因子（16次），组织蛋白酶家庭成员（14次）和基本的内切酶/逐蛋白酶家庭成员（6次，表S3.）.总共25个的认定为抗病（R）基因在这些组织中上调，包含R基因候选28度的视角的RGA(oases_423898和trinity_250424),RPS2（rnaspades_2531，rnaspades_118057），RPS5.（rnaspades_11681）和RPM1.(oases_397796、oases_397788和oases_261017)，共30个编码枯草杆菌素样蛋白酶家族成员的基因得到了顺式表达(表S3.）.

使用qRT-PCR对DEGs进行验证

通过QRT-PCR验证了上面分析的21℃的随机选择。这些相对表达水平被呈现为日志₂马朗砧木与自嫁接砧木的对折变化，并以原木为对照绘制₂通过RNA-SEQ方法检测的每个基因的FC值（图。6.）.结果表明，qRT-PCR和RNA-seq检测的基因表达模式相似，相关系数为r= 0.9083,P < 0.01, indicating a high correlation between both methods.

生长在Marang Rootstocks上的面包果植物的特征在于茎伸长率生长的显着抑制，导致矮化表型，植物高度减少超过50％（表1，另见[3.])。对接穗茎的转录组分析显示，这些植物在氨基酸、脂类和细胞壁生物合成的关键基因中表现出下调，反映出茎生长的碳利用减少。在库器官中，蔗糖被转化酶和/或蔗糖合酶水解，以生成己糖，用于能量生产、代谢和高分子生物合成[42］．蔗糖水平较高，但在百叶菌砧座上的茎中的己糖水平降低（图。1)与SAI和NIV的转录和酶活性均显著降低的事实相一致(图2)。4.），反映蔗糖利用的破坏。蔗糖合成酶的相对贡献的增加与蔗糖合成酶活性所示的蔗糖劣化（图。4.）可以代表这些组织中节能的适应策略，因为蔗糖转化为通过蔗糖合成酶的己糖磷酸盐的转化仅使用通过反转酶转化所需的ATP所需的一半[43］．然而，这些组织中的蔗糖的积聚表明蔗糖合酶活性的总增加不能补偿水解损失。此外，抑制了正常的植物生长可能因抑制而受到不利影响Sais.与伸长率生长有关[44那45］．SAI活性的降低是由于aWAK基因导致细胞扩张的丧失[35.］．值得注意的是,四WAK基因在Scion茎上调节玛兰根罗克斯（表3.）.抑制纳伟仕还导致细胞伸长率的切断缺陷[43那46］．

已经显示出高蔗糖浓度通过压制蔗糖转运蛋白的转录和活性来负调节蔗糖流入[47那48那49］．同时，大量编码营养转运体/促进因子的基因，包括糖转运体(SUT1, SUT4, SWEETs)、氨基酸转运体、胆碱转运体样、K⁺马朗砧木接穗茎中通道和水通道蛋白下调(表1)1）.许多养分转运充当加上质子电化学梯度由PM H的活性产生的次级活性转运⁺腺苷三磷酸酶。这些基因的下调，以及PM H活性的降低⁺-ATPase（图。4.，另见[3.]）可以影响细胞膜中营养素（蔗糖，己糖，氨基酸）的通过。具体地，在长途运输糖，Suts或甜食以及k⁺通道AKT2 / 3促进蔗糖检索，以保持沿着韧皮型途径的静水压力[23.那50］．蔗糖卸载到木质物种中的干组织也可能受到影响sut将蔗糖释放的活性作用递减至相邻的Phloem牙科细胞和木质和韧皮细胞之间的蔗糖交换[51那52］．一个编码液泡膜定位SUT4的基因的抑制可能会破坏蔗糖的亚细胞区隔。SUT4的功能是从液泡中提取蔗糖进行下游加工[53］．此外，共质体运输可能会受到参与胞间连丝成熟和筛板发育的胆碱转运样基因的抑制[54那55］．这些营养转运蛋白的下调与转化酶活性的降低，指向碳分配在玛兰根罗克斯的矮化表型发展中的作用。

PM H.⁺-AtPase在通过酸生长机制促进细胞扩张方面发挥着中心作用[56］．马朗砧木接穗茎PM ATPase活性降低，关键基因下调[34.]参与酸生长机制。这些包括编码转化酶和k的基因⁺提供充压以驱动细胞膨胀的通道AKT1 [35.那57和纤维素、木葡聚糖和果胶生物合成和重组的关键酶3.，表S.3.）.已经证明了一些成绩单的一些弗拉S与各种树种的木质纤维中的次级壁沉积和木质性质的发作呈正相关[58］．明显，四佛罗里达州以较低的水平表达矮状砧木（表3.）.符合对二级细胞壁的影响，木质素生物合成基因的下调，HCT和C3'H，在这些组织中表现出（表4.），抑制HCT或者C3'H将助焊剂限制在果皮和sinapyl醇中（图。5.），导致降低木质素含量和发育性增长[37.］．面包果接穗在马朗砧木上木质素生物合成途径的下调与嫁接在矮化砧木‘M27’和‘M9’上的苹果树接穗的研究结果一致[14.］．

细胞扩张可被抑制SAUR21调节PM H的活性基因⁺-ATP酶[59］．其下调可抑制生长素的生物合成yucca.通过IPA途径调控IAA生物合成限速步骤的基因[24.］．植物生长素的极性运输可能被植物生长素流出和流入的载体基因的下调所阻断(表)2）.结果与生长素在根茎诱导的其他物种矮化中的作用一致[9.那13.］．在玛兰砧木上的CARION茎中的GA生物合成可能被两者的下调抑制Ga0oxs.和Ga3s.．结果同意我们以前的发现，显示了组织中GA信号传导的压缩机的增加的丰度[4.］．无论是蟾蜍素流出载体的转录PIN3而PIFs的活性可被DELLA蛋白的过度积累所抑制[26.那60］．3个CK生物合成基因的上调IPTS.表明，可以升高CK的茎局部合成的能力，以补偿从矮化砧木建议的CK供应量[9.］．转录的IPTS.可能是由生长素信号通路下调介导的[27.］．另一方面，生长素外排和内流载体都是b型arr的下游靶标[28.］．三个强大压抑的三个强制要求，可以提出杂珠酮在面包屑矮化中的作用矮人27基因（表S3.）.造成扰乱的植物矮人27显示矮人习惯[30.］．编码芸薹类化合物-6-氧化酶和CYP90A1的基因的下调可能表明BR生物合成中断，因为这两种蛋白质都催化了BR生物合成必需的多种氧化转化，在芸苔类固醇-6-氧化酶处抑制CYP90A1基因表现出严重的矮化表型，细胞伸长率缺陷，很短的间隙[29.］．

来自玛甘砧木茎的上调基因富集了SA，Ja和乙烯的ROS相关基因和信号通路。MAPK级联，钙信号传导和核苷酸结合幼亮重复（NB-LRR）蛋白编码的上调R基因已被描述为植物中的先天免疫应答，类似于动物用于放大防御信号的动物用于扩增的植物的受体信号[61那62］．虽然这些途径通常涉及到对应激信号的快速和强大的反应，如防御相关基因的激活，局部的程序性细胞死亡和应激适应，生长抑制经常被观察到作为具有强大防御反应的植物的一种权衡[62］．生长素信号的抑制已经被证明是sa介导反应的一部分[63］．JA信号传导途径中的Jaz压缩机与Della蛋白相互作用，以优先对生长进行防御[26.］．nod样先天免疫反应也被证明通过DELLA稳定抑制生长[64］．木质素生物合成基因的抑制HCT被显示为触发SA信号通知途径[65］．另一方面，木质素生物合成的抑制与代谢通量向类黄酮的重定向有关[66那67］．黄酮类化合物是生长素运输的天然抑制剂[68］．蔗糖还诱导花青素的积累（一种黄酮类化合物）[69那70]，发现这种诱导被Della蛋白阳性介导，所述Della蛋白也通过蔗糖稳定[71］．蔗糖作用于碳分区和韧皮部运输的调节[47那49[还与各种激素相互作用，如Ga，Ja和SA信号[72］．因此，在有效的逆变酶介导的蔗糖转化对葡萄糖和果糖的破坏，不仅限制了营养和能量供应，而且扰乱了复杂的激素相互作用和生长和防御之间的串扰。

结合RNA-seq转录组和生化分析表明，生长在马朗砧木上的面包果植株在茎伸长生长的营养物质运输和蔗糖利用方面表现出中断。PM-H + atp酶的活性下降,结合下调的基因编码各种细胞壁蛋白质和酶参与膨监管、纤维素的生物合成/ re-modelling xyloglucans,果胶,和木质素提出损害细胞扩张和细胞壁生物合成的主要和次要的细胞,导致矮化表型。植物生长素和GA信号通路，以及油菜素内酯和独角金内酯生物合成基因在差异下调基因中占主导地位，表明这些转导网络的破坏在包括矮化在内的根茎中起着重要作用。大量参与防御反应的基因上调，包括应激相关激素信号通路、MAPK级联和nod样受体信号通路，被认为抑制植物生长，并促进矮秆表型的发展。

砧木诱导的矮化是一种复杂的机制。我们的研究结果支持，与碳分区一体化的多种途径网络破坏了增长和防御的平衡，导致抑制细胞伸长率生长。未来需要评估Marang Rootcocks对面包果表型的长期影响。目前工作中产生的有价值的基因资源可以有助于促进涉及涉及面包果矮化的卵形中的潜在分子过程的功能研究和连续表征。此外，该信息提供了设计筛选策略以协助培育和选择潜在的尺寸控制砧木的机会。虽然在果园实践中，虽然使用植物生长阻燃剂，如紫杉蛋白酶[73，对于木本物种来说，这通常涉及长期重复使用这些化学物质，以达到有效的树木尺寸缩小。矮化砧木的发育和特性为面包果树的活力控制提供了可持续的解决方案。

植物材料

面包果（面包果altilis简历。萝莉)和马朗(香波罗在凯恩斯从商业幼儿园获得）的植物，昆士兰北部。面包果植物，根插条，和马江植物为苗，进行温室条件下在25-28℃下用自然采光，每日供水生长。如先前所描述的植株在含有蛭石花盆和土壤混合物中生长3.］．从30〜50厘米的植物中选择的面包果区层通过接近嫁接嫁接到类似尺寸的Marang幼苗上[74］．作为对照，面包果接穗也嫁接到相同品种的面包果砧木上(自嫁接)。每个嫁接植株在嫁接6个月后转移到85升的花盆中，在相同条件下继续生长。为了比较生长情况，在相同的条件下，我们也同时种植了自己的根面包果(非嫁接)。

生长参数，包括主接穗的伸长率茎枝，最终接穗高度，接穗茎粗，节点号，分支号，节间长，叶的大小和叶数，如先前所述接枝后26个月检查[3.］．干直径的上方和下方嫁接结合的比例从5厘米以上和以下嫁接结合测量的茎周长计算。叶字符，包括叶色和静脉颜色，叶基，先端和余量，和叶数的形状还检测了在同一时间。三个完全展开的每种生物复制的叶（叶源）被选择用于叶绿素浓度的测量。三个圆盘从每个叶冲压并立即用96％乙醇萃取。叶绿素浓度一个和b根据Lichtenthaler的方法计算从648nm和664nm的吸光度计算[9.］．术后3 ~ 26个月，每12个月进行一次移植物相容性评估。两个独立试验的结果(每个移植组合从开始有8个重复)记录了移植后3个月存活率的1年和2年移植相容性。用Fisher精确检验对不同砧木的数据进行了检验。下游分析只使用相容性好的移植物，包括生长比较、生化分析和基因表达分析。显示嫁接相容性的植株被定义为生长活跃，从顶端芽或腋芽逐渐发育新的节间，并从顶端不断出现绿叶(图S1）.贪污联合的目视检查显示所有移植物的裂缝都没有裂缝。在收集其对下游测定的间隙和叶样品之后，在26个月内进一步对移植接口的解剖检查进一步进行。为了实现这一点，锯切工会被锯成透露横截面和纵向部分。根据Mosse和Herroero的五分类评级（从A到e）目视评估移植不相容性[22.］．A类A代表了吠声和木材之间的接枝线几乎不可见的完美联盟。B类表示良好的工会，连续树皮和木材，尽管木材中的联合线往往通过过度的射线形成来区分。C类别C的特点是通过血管木不连续性的树皮不连续性和D类。C类e涉及移植工会的破裂[22.］．

非结构性碳水化合物分析

从植株上取下节间第2段茎组织，用液态氮快速冷冻₂．将每个茎标本(50 mg)的可溶性糖在80%乙醇中60℃三次提取2 h，蒸发上清液，无菌水中溶解。用酶法测定可溶性糖水平，葡萄糖和果糖根据d -果糖/ d -葡萄糖测定试剂盒(Megazyme, Bray, Ireland)，蔗糖根据Birnberg和Brenner [75］．丸乙醇提取在0.1 N resuspended氢氧化钠和煮30分钟。调整后的pH值5,淀粉消化一夜之间在50°C 1000 U的淀粉转葡糖苷酶和20 U(α淀粉酶,并确定酶葡萄糖单位根据starch-determination工具包(Megazyme、布雷、爱尔兰)。

酶测定

蔗糖代谢酶的提取方法是，将从茎尖开始计数的第2节间的新鲜茎组织(0.5 g)在液体氮条件下立即冷冻并粉碎成粉末₂，用1.5mL萃取缓冲液均质化，按照Mirajkar等人的方法。[76］．转化酶的活性是在37°C通过添加50µL的透析酶到含有90 mM醋酸钠缓冲液pH 4.5(酸性转化酶)或pH 7.5(中性转化酶)和60 mM蔗糖的混合试验中测量的，如前所述[76］．然后按上述方法进行葡萄糖测定。转化酶活性的一个单位定义为在实验条件下1分钟内形成1µmol葡萄糖的酶的量。根据Tomlinson等人的方法测定了蔗糖合酶的活性[77］．然后按上述方法进行果糖测定。蔗糖合酶活性在mol果糖min中表达⁻¹米⁻¹蛋白质。用于质膜H⁺-ATPase，微粒体级分从下列先前协议的相同茎组织制备74］．在38℃下测量ATP水解活性，并加入到反应混合物中的微粒体悬浮液[50mM Tris-MES，pH6.5，具有3mm Tris-ATP，50mM KCl，3mM MgSO。_4.，0.5毫米钼酸铵，50毫米Kno_3.和0.1％（w / w）triton x-100]，然后是如前所述的无机磷酸盐测定[74］．钒酸敏感性ATP酶的活性由在不存在和存在的活性之间的差异和1mM NA之间的差异计算_3.vo._4.．根据Bradford测定蛋白质浓度[78］．

RNA分离，cDNA-图书馆施工和illumina测序

进行RNA提取用于转录分析从主在22个月接枝后茎面包果接穗。在每个嫁接植物的节间第二阀杆部进行取样作为一种生物复制。重复三次每个接枝组合来执行。在从植物去除，茎组织立即浸入RNA晚些时候（Life Technologies，澳大利亚），之前储存在-80°C之前。通过使用带有柱DNA酶消化（Qiagen，Australia）的RNeasy试剂盒提取总RNA。由于没有用于面包果实物种的参考基因组，因此同时制备参考文库来帮助DE Novo组件。为了实现这一点，通过在顶点处的茎切片的总RNA的总体RNA等组合产生混合的RNA文库，并且每个节省的每个都是每次重复的第六个间节点。通过25s和18s RNA与Agilent 2100生物分析仪（Agilent，USA）的完整性验证了总RNA质量。使用Truseq®链状总RNA文库制备试剂盒制备cDNA文库，其具有核毒植物（Illumina，USA）并用独特的核酸标识符（Illumina Truseq V2指数序列）分析。汇集所有索引的cDNA文库以为SP流量细胞（Illumina，USA）的一个通道产生一个多路复用样品。进行了不平等的样品汇集，以便参考文库花了一半的车道，六个图书馆（来自玛甘砧木的三个图书馆和来自自嫁接的三个图书馆）均匀分享了一半的车道。在Illumina Novaseq 6000平台上使用150bp成对结束测序策略进行测序最终混合cDNA池（Ramaciotti Genomics，新南威尔士大学，悉尼）。

转录组库的从头组装和注释

通过宫殿和杰克逊描述的协议，将CDNA文库的过滤读取并将De Novo汇集并将De Novo陷入Contigs（Agrf，Brisbane）[79］．简而言之，三位一体进行三个独立组件（K-MER = 55 [80])，绿洲(k-mer = 53,63,73 [81]）和rnaspades（k-mer = 55,77 [82])。每个组件的结果与CD-HIT-EST聚集，参数：-G 0 -C 1.00 -AS 1.00 -A100 [83]并且从每个组件代表转录物合并。Transdecoder [84]被用于提取的开放阅读框（ORF）有100个氨基酸长。的编码序列，使用CD-HIT-EST与参数进一步聚集：-c 0.98 -G 0 -M 16000 -T 16 -As 1.0 -Al 0.0583］．下游分析采用具有代表性的编码序列进行注释，其来源的contigs作为最终的转录组组装。使用基准通用单拷贝直方图(BUSCO)识别通用单拷贝直方图并估计组装的完整性。读取被映射回程序集以评估映射效率。

从最终转录组组件获得的肽序列用于使用软件Interprancan V5.28-67.0的功能注释（https://www.ebi.ac.uk/Interpro/）.Kegg注释是在KAAS进行的（https://www.genome.jp/tools/kaas/）.此外，组装的单基因序列通过对准注释以公共数据库：NCBI NR（非冗余，见http：//www.ncbi.nlm.nih）;Swissprot（http://www.uniprot.org/)和COG (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cog/）with a threshold of e ≤ 10⁵．对的基因组也进行了BLAST搜索莫属籼稻在NCBI数据库中有完整注释和公开的基因组序列的最近缘种。

差异基因表达和途径分析

EdgeR package v. 3.16.5 (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html）用于进行差异表达分析。保留在任何3个样品中显示至少1cpm（百万读数计数）的基因进行进一步分析。广义线性模型（GLM）用于在组之间进行差异表达比较。如果他们的FDR <0.05和记录，基因被认为是差异的表达₂褶皱变化|≥1。R package topGO v2.36.0 (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/topGO.html）用于对差异表达基因进行途径分析。通过Fisher的确切测试测试基因本体（GO）和基因组（KEGG）富集的基因内容和京都百科全书。

定量实时聚合酶链反应

用上标逆转录酶和寡核苷酸（DT）（DT）（DT）（澳大利亚）转化为CDNA的等分试样。用Qualifast Sybr Green PCR套件（如前所述）对Corbett Sybr Green PCR套件（Qiagen，澳大利亚）进行了实时PCR。4.］．热循环以95°C孵育5分钟开始，随后45个循环(95°C 10 s;扩增的特异性在每次测试结束时通过高分辨率熔体曲线分析得到证实。各引物组的效率(见表S4.对于使用CDNA样品的串联稀释液，通过标准曲线评估了引物序列。每一份反应（技术重复）与非反转转录的cDNA重复进行（RT^-）作为阴性对照（非模板控制）。四个家务基因候选人，伸长因子1-一个，如前所述，测试肌动蛋白，α-微管蛋白和γ-微管蛋白的稳定性[4.］．每个基因的表达是平均三种生物重复。

统计分析

所有数据在SPSS (IBM Statistics version 24)中进行统计分析。采用方差分析(ANOVA)检验生长速率、茎高和茎粗、代谢产物浓度、酶活性和基因表达水平之间的显著差异，然后进行Tukey的多重比较试验P< 0.05。采用Kruskal-Wallis检验节点数、分枝数、叶片数差异有统计学意义。采用Fisher精确法检测1年和2年配合率的途径富集和显著差异。

RNA排序的原始读数和支持本文的参考转录组文库的DE Novo组装可在NCBI Bioproject数据库中获得（https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/bioproject/sub8554792/overview.)，登录号:PRJNA679862。接穗茎相关差异表达基因列表见Supplementary Table S3.．

昆士兰农业和渔业部生态科学区的植物病理学和园艺学小组提供了持续的实验室支持。作者感谢审稿人，他们的评论改进了原稿。

这项工作得到了澳大利亚国际农业研究中心（ACIAR）的支持，通过2014/077项目。

隶属关系

1. 澳大利亚太平洋岛屿研究中心，阳光海岸大学，Sippy Downs, QLD 4556，澳大利亚

   玉南围史蒂文J. R. Underhill

2. 昆士兰农业和食品创新联盟，昆士兰大学，圣卢西亚，QLD, 4072，澳大利亚

   玉南围史蒂文J. R. Underhill

贡献

概念化和项目设计，yz和su;方法论，yz;调查和数据分析，yz;稿件草案，yz;恢复和评论，Y.Z.和s.j.r.u.所有作者都读过并批准了稿件。

通讯作者

对应于周玉蝉．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版物

不适用。

利益争夺

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意事项

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。

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