跳到主要内容gydF4y2Ba

含有榴莲胱天斯坦甘氨酸二肽酶活性的果实成熟相关的白氨基肽酶表明其参与谷胱甘肽回收gydF4y2Ba

摘要gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

榴莲(gydF4y2BaDurio zibethinusgydF4y2Ba是泰国和其他几个东南亚国家非常受欢迎的水果。它富含必需营养素和含硫化合物,如谷胱甘肽(GSH)和γ-谷氨酰半胱氨酸(γ-EC)。半胱氨酸甘氨酸(Cysteinylglycine, Cys-Gly)是由谷胱甘肽分解代谢产生的,发生在榴莲果肉中。半胱氨酸(Cys)是果实成熟过程中产生的含硫挥发物的前体。上述物质使成熟的水果散发出浓郁的香味。然而,植物半胱甘肽二肽酶的编码基因尚不清楚。本研究旨在测定榴莲果肉中亮氨酸氨基肽酶(LAP)的活性。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

我们鉴定出DzLAP1和DzLAP2,前者在果肉中高度表达。gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba在不同的成熟期表达,对乙烯利/1-MCP处理有响应。因此,gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba在果实成熟的早期阶段是活跃的。DzLAP1是尺寸的金属酶〜63kDa。它由mg激活gydF4y2Ba2+gydF4y2Ba或锰gydF4y2Ba2+gydF4y2Ba和其他圈一样,其最佳碱性pH值为9.5。动力学研究表明DzLAP1含有KgydF4y2Ba米gydF4y2Ba = 1.62 mM for its preferred substrate Cys-Gly. DzLAP1-GFP was localised to the cytosol and targeted the plastids.在Planta.gydF4y2Ba确认Cys-Gly水解gydF4y2Ba尼古利亚娜·宾夕法尼亚州gydF4y2Ba用Cys-Gly患有Cys-Gly并表达gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba.gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

DzLAP1在γ-谷氨酰基循环中具有胱氨酸-甘氨酸二肽酶活性。本研究揭示了在完全成熟的榴莲果肉中发现的高含硫化合物水平的原因。gydF4y2Ba

关键信息gydF4y2Ba

Dzlap1在榴莲中的表征(gydF4y2BaDurio zibethinusgydF4y2BaL.)果实纸浆表明它在成熟期间参与胱硫基甘氨酸降解和谷胱甘肽回收。gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

榴莲(gydF4y2BaDurio zibethinusgydF4y2BaL.)是一种非常美味的水果,生长在泰国和其他东南亚国家。新鲜榴莲的生产和出口利润很高。多项研究表明,榴莲富含蛋白质、碳水化合物、脂肪[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]、生物活性酚类及抗增殖化合物[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba].榴莲具有独特的质地、味道和气味。在成熟过程中,含硫挥发相关基因蛋氨酸γ-裂解酶(gydF4y2BaMGL.gydF4y2Ba)和乙烯相关基因氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(gydF4y2BaACS.gydF4y2Ba)是调节。相应地,它们各自的代谢物(硫挥发物和乙烯)积累起来。因此,乙烯的生物合成与成熟过程中挥发性硫的产生存在相关性[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba].2017年榴莲基因组草案发表后[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba],我们的小组确定了与成熟过程相关的几个转录因子。例如,DZDOF2.2参与了蟾蜍蛋白生物合成的调节[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]和DzARF2A可以结合多个乙烯生物合成基因的启动子,从而控制榴莲果实成熟[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba].gydF4y2Ba

几种含硫挥发物负责成熟的榴莲果实的刺激性气味。谷胱甘肽(GSH),γ-戊二醇氨基(γ-EC),gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba-腺苷蛋氨酸(SAM)、半胱氨酸(Cys)和半胱氨酸甘氨酸(Cys- gly)在泰国品种Chanee和Monthong的成熟果肉中检测到[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba].前者气味较强,采后成熟快。此外,Chanee成熟果实的Cys和Cys- gly含量高于月桂成熟果实[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba].gydF4y2Ba

胱氨酸甘氨酸是硫代谢γ-谷氨酰基循环中的重要中间体。它参与氧化还原稳态,并在活细胞中回收氨基酸。在哺乳动物中,Cys-Gly是GSH通过γ-谷氨酰转肽酶(GGT)、γ-谷氨酰环转移酶(GGCT)和5-氧脯氨酸酶(OPase)反应降解的产物[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba].然而,只有GGCT和OPase的协同作用或ggt独立的途径控制Cys-Gly的产生gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba].Cys-Gly被二肽酶水解成Cys和Gly。胱氨酸甘氨酸是一种前氧化剂,可能有助于细胞内氧化还原环境。过量的Cys-Gly对酵母细胞有毒[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba].因此,酶联性Cys-Gly调节可能是至关重要的。此外,Cys的释放是重要的,因为该氨基酸可以转化为在果实成熟期间硫挥发产生的甲硫氨酸[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba].gydF4y2Ba

Leucylaminopeptidases(圈,EC。3.4.11.1)是M17酶家族成员。它们可能处理细胞内的蛋白质,但它们的精确代谢功能仍不清楚。它们优先水解Cys-GlygydF4y2Ba牛gydF4y2Ba(牛)gydF4y2Ba13gydF4y2Ba],gydF4y2Ba梅毒denticolagydF4y2Ba[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba),而gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba].他们最初被命名为圈,因为早期的报告表明他们会反应gydF4y2BaNgydF4y2Ba- 终亮氨酸[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba].胞质M20金属肽酶Dug1p具有Cys-Gly肽酶活性。其同源物存在于哺乳动物和酵母中,但不存在于植物中[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba].环有六个相同的单体,每个亚基包含两个保守的锌结合位点[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba].它们都参与氨基酸的转换,但它们的其他生物学功能是复杂的和特定物种的。gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaLAP,又称XerB、PepA或CarP,是一种氨基肽酶无关的dna结合蛋白[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba].它介导特异性质粒和噬菌体重组[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba并激活转录gydF4y2BacarABgydF4y2Ba操纵子(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba].哺乳动物的lap有多种功能。干扰素-γ (IFN-γ)的诱导促进了LAP的高聚集。LAP可参与人类的抗原呈递[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba].动物圈与晶状体氧化老化有关[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba].植物LAP-A是一种防水蛋白,在索尔纳科西的花卉发育中起重要作用[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba,gydF4y2Ba29gydF4y2Ba].gydF4y2Ba

根据其Pi,植物圈是酸性圈或中性的LAP-N。LAP-A和LAP-N具有不同的生化特性,并对发育和环境提示不同。Lap-a仅在茄科发生,由生物和非生物胁迫引起[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba,并在生殖器官中积聚[gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba].相反,LAP-N在所有植物中构成型生成[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba].gydF4y2Ba包裹gydF4y2Ba-沉默的番茄相对更容易受到gydF4y2BaManduca sextagydF4y2Ba(番茄角虫)的入侵比它们的野生类型的对手[gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba].LAP-A和LAP-N是保护蛋白质免受热量损伤的分子伴侣[gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba].在这里,我们在榴莲果肉中鉴定了两种LAP亚型。其中LAP-N DzLAP在髓部高表达。我们用生物化学方法鉴定了表达为his标记蛋白的DzLAP1gydF4y2Ba大肠杆菌。gydF4y2Ba我们的目的是明确其在通过Cys- gly裂解释放Cys生产硫挥发份中的协同作用。我们发现DzLAP1定位于细胞质和叶绿体。我们研究了它在胞质谷胱甘肽和质体肽分解代谢中的生理作用。据我们所知,目前的工作是第一次报道了lap的参与,并将DzLAP1与榴莲果实成熟联系起来。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

腿上gydF4y2Ba鉴定,蛋白序列比对,系统发育分析gydF4y2Ba

根据开源穆斯兰王榴莲品种基因组数据库,gydF4y2Badzlap1_mk.gydF4y2Ba和gydF4y2BaDzLAP2_MKgydF4y2Ba被确定。只有一个ChaneegydF4y2BaDzLAPgydF4y2Ba同种型存在于内部RNA-SEQ数据中,从成熟的果实纸浆组织(数据未显示)。全长Chanee Dzlap与穆斯兰王和番茄圈对齐(gydF4y2Ba茄属植物lycopersicumgydF4y2Ba;SlLAP1和SlLAP2),马铃薯(gydF4y2Ba茄属植物tuberosumgydF4y2Ba;STLAP1和STLAP2),和gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba(gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba;AtLAP1 AtLAP3)。在假定的ChaneegydF4y2BaDzLAPgydF4y2Ba被标注为gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba(加入。MN879753),编码DzLAP1。在多序列比对和系统发育邻域连接(NJ)中以DzLAP1_CN表示。DzLAP1_CN与猫山王聚集在一起。DzLAP1与DzLAP1_MK和DzLAP2_MK的同一性分别为99.3和89.7%。DzLAP1和DzLAP1_MK的高同源性可能是由于不同品种间存在SNP位点。DzLAP1中有8个高度保守的残基(K350、D355、K362、D375、D435、E437、R439和L463)参与底物结合或催化功能(图)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,箭头)。五个保守的残留物(K350,D355,D375,D435和E437)与金属离子相互作用[gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba]这是重要的酶辅因子。这些保守的残基包含催化残基的子集(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba盒)。包括DzLAP1在内的所有蛋白质序列中,SlLAP1和StLAP1均未包含所有28个la - a特征残基(图1)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba, 强调)。在中检测到完全保守的残留物gydF4y2BaCgydF4y2Ba- 含有参与催化的所有基本活性残基的终端区域(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,星号)。相比之下,gydF4y2BaNgydF4y2Ba- 终极区域患有高度可变的氨基酸序列[gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba].atlap1缺少信号肽序列,但是gydF4y2BaNgydF4y2Basllap和stlap的-末端区域略短于其他序列。SlLAP和StLAP的两种亚型分别与DzLAP_MK和AtLAP的两种和三种亚型比较,鉴定率仅为~ 64-77%。gydF4y2Ba

图1gydF4y2Ba
图1gydF4y2Ba

各种植物圈的氨基酸序列对准。推导的Chanee Dzlap1(Dzlap1_cn)的氨基酸序列与穆斯兰王Dzlap1_MK和Dzlap2_MK对齐(gydF4y2BaDurio zibethinusgydF4y2Ba),gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba(gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba) AtLAP1-AtLAP3;土豆(gydF4y2Ba茄属植物tuberosumgydF4y2Ba) StLAP1和StLAP2;和番茄(gydF4y2Ba茄属植物lycopersicumgydF4y2Ba) SlLAP1和SlLAP2。八个底物结合/催化残基被箭头标记。八个残基中有五个是保守的金属离子配位残基(盒)。28个lapa签名残留被突出显示。星号、冒号和圆点分别表示严格、高度和中度保守的氨基酸残基gydF4y2Ba

系统发育分析显示,所有植物的圈聚在一起,与细菌的圈分离(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba).然而,在某些植物和细菌的环磷酸腺苷中检测到Cys-Gly肽酶活性。西红柿和土豆是分开的gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba并参与防御反应和蛋白质分解代谢(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba).相比之下,他们对Cys-gly的活动很少[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba].不同的圈位于不同的细胞室,可能有不同的假定功能(图)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba).gydF4y2Ba

图2gydF4y2Ba
figure2gydF4y2Ba

系统发育分析与比较。在MEGA v. 7中使用1000个bootstrap复制构建了邻居连接(NJ)树。gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba: AtLAP1 (NP_179997), AtLAP2 (NP_194821), AtLAP3 (NP_001328632);gydF4y2Ba茄属植物lycopersicumgydF4y2Ba:SLLAP1(NP_001233862.2)和SLLAP2(NP_001233884.2);gydF4y2Ba茄属植物tuberosumgydF4y2Ba: StLAP1 (XP_006350102.1)和StLAP2 (XP_015165363.1);gydF4y2BaDurio zibethinus:gydF4y2Ba穆斯兰国王Dzlap1_MK(NW_019167860.1)和DZLAP2_MK(NW_019168159)和CHANEE DZLAP1_CN(MN879753);gydF4y2Ba梅毒denticolagydF4y2Ba: TdLAP (WP_010698434.1);gydF4y2Ba牛gydF4y2Ba:BTLAP(NP_776523.2);gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba: SaLAP (ORO33369.1)。右边的表格代表了通过硅预测或经验证据和基于它们假定的作用分析的lap的位置gydF4y2Ba

qRT-PCR分析基因表达gydF4y2Ba

在Silico分析中透露gydF4y2Badzlap_mk.gydF4y2Ba不同组织类型的表达有很大差异。gydF4y2Badzlap1_mk.gydF4y2Ba在榴莲果肉中表达量最高gydF4y2BaDzLAP2_MKgydF4y2Ba表达于其他组织(补充图。gydF4y2BaS1gydF4y2Ba).因此,我们专注于gydF4y2Badzlap1_mk.gydF4y2Ba因为它和Chanee几乎一模一样gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba.QRT-PCR透露差异gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba在Chanee和Honthong果实纸浆的未成熟,中美洲和成熟阶段的表达gydF4y2Ba.DzLAP1gydF4y2Ba在未熟至中熟阶段显著上调,而在成熟阶段则显著下调。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba一个)。gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba在Chanee品种(白条)中的表达有点类似于云地品种(黑条)(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba一个)。植物激素eThephon和1-MCP被应用于验证与之间的关联gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba和水果成熟。gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba与经历自然熟化(对照)的果肉相比,用1-MCP处理的果肉中的果肉中显着下调,或用熟化剂乙烯处理(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab)。然而,Ethephon治疗对影响相对较少gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba表达式。gydF4y2Ba

图3gydF4y2Ba
图3gydF4y2Ba

中存在的分析gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba在Chanee和Monthong榴莲品种果实成熟的不同阶段(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)和不同月龄榴莲果实品种成熟条件(gydF4y2BabgydF4y2Ba).gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba在Chanee(白色酒吧)和幼儿(黑条)品种的榴莲果浆中的表达在未成熟,中风和成熟阶段(黑条)品种(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)、自然成熟(对照)、乙烯利处理和1- mcp处理(gydF4y2BabgydF4y2Ba).伸长因子1α(gydF4y2BaEF-1α.gydF4y2Ba)为内参基因。柱:三个独立生物重复的平均值±标准差。星号表示基于Tukey的HSD多量程测试的显著差异(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)gydF4y2Ba

在Planta.gydF4y2Ba胱甘肽二肽酶活性分析gydF4y2Ba

在未熟和中熟阶段对果肉粗提物的半胱氨酸二肽酶活性进行了测定(补充图。gydF4y2BaS3.gydF4y2Ba).中风(白条)中的Cys-Gly二肽酶活性比未成熟(黑条)样品(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)。这一结果与基因表达分析结果一致。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa). Cys-Gly二肽酶活性也得到证实gydF4y2Ba尼古利亚娜·宾夕法尼亚州gydF4y2Ba叶片与15mm Cys-Gly共浸润,并含有pEAQ-gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba或pEAQ(控制)。采集叶片,采用高效液相色谱法测定叶片中胱氨酸-甘氨酸的含量。对照组的Cys-Gly显著高于对照组gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba-overexpressing叶子(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba).gydF4y2Ba

图4gydF4y2Ba
装具gydF4y2Ba

在Planta.gydF4y2Ba胱甘肽二肽酶活性测定gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba-Overexpressing.gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba叶子。叶子共同渗透gydF4y2BaA. Tumefaciens.gydF4y2BaGV3101窝藏pEAQ -gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba或用0.1M HCl(比率为1mg /50μl)萃取PABQ空载体+ 15mm Cys-Gly。内标为10毫米 NgydF4y2Ba- 乙酰琥珀酸。显示相对Cys-Gly含量。样品是从单独的叶子获得的三个独立的生物学复制。学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba-测试 (gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)identified significant differences (asterisks) betweenDzLAP1gydF4y2Ba-overexpressing和控制叶gydF4y2Ba

rDzLAP1的体外生产及生化特性研究gydF4y2Ba

纯化的可溶性rDzLAP1gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba在SDS凝胶上显示为单带蛋白。其分子量为~ 63kda,经western blot证实(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba一个)。相对于BSA标准,纯化的DZLAP1浓度为约1.16mg mLgydF4y2Ba- 1gydF4y2Ba.gydF4y2Ba

图5gydF4y2Ba
figure5gydF4y2Ba

SDS-PAGE和Western Blot(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)金属离子依赖性(gydF4y2BabgydF4y2Ba)最佳pH(gydF4y2BacgydF4y2Ba)重组基因DzLAP1。M道:标准蛋白质阶梯。1和3道:原油rDzLAP1。通道2和4:纯化的rDzLAP1。将两微克粗蛋白和纯化蛋白装入SDS凝胶(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba).3.5微克rDzLAP1与7.5 mM Cys-Gly在25 mM K中孵育gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba宝gydF4y2Ba4gydF4y2Ba缓冲液(pH 7.2)在0 mM和1 mM Ca存在下gydF4y2Ba2+gydF4y2Ba、锌gydF4y2Ba2+gydF4y2Ba,mg.gydF4y2Ba2+gydF4y2Ba, 你gydF4y2Ba2+gydF4y2Ba、锰gydF4y2Ba2+gydF4y2Ba37°C, 15分钟。总反应体积为50 μL。酶活性的测定采用改进的酸性茚三酮法[gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba在560nm (AgydF4y2Ba560gydF4y2Ba) (gydF4y2BabgydF4y2Ba).用7.5 mM Cys-Gly和1 mM Mg共培养3.5 μg酶,得到rDzLAP1的最适pH值gydF4y2Ba2+gydF4y2Ba在不同pH(醋酸缓冲液,pH 4-6;磷酸盐缓冲液,pH 6-8;三盐酸缓冲液,pH 8-9.5;甘氨酸- naoh缓冲液,pH 9.5-11), 37°C, 15 min (gydF4y2BacgydF4y2Ba).相对于最多100%计算酶活性gydF4y2Ba

将DzLAP1与Cys-Gly底物在Ca存在下孵育,检测其金属酶活性gydF4y2Ba2+gydF4y2Ba、锌gydF4y2Ba2+gydF4y2Ba,mg.gydF4y2Ba2+gydF4y2Ba, 你gydF4y2Ba2+gydF4y2Ba、锰gydF4y2Ba2+gydF4y2Ba.通过检测检测到释放释放的半胱氨酸的改性酸性茚三酮方法测量DzLAP1活性。当反应系统含有mg时获得最高的DzLAP1活性gydF4y2Ba2+gydF4y2Ba和锰gydF4y2Ba2+gydF4y2Ba.相反,CagydF4y2Ba2+gydF4y2Ba、锌gydF4y2Ba2+gydF4y2Ba,倪gydF4y2Ba2+gydF4y2Ba在它们的存在下,DzLAP1的活性与无金属离子对照的活性没有显著差异(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab)。毫克gydF4y2Ba2+gydF4y2Ba作为DzLAP1辅助因子进行酶动力学分析。将DzLAP1酶与Cys-Gly在pH 4.0-11.0的条件下孵育,获得最佳pH值。DzLAP1在pH为9.5时对Cys-Gly的活性最大(图5)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac) ~ 80%的酶活性发生在pH为8.0-11.0的范围内。在pH < 7.0时,DzLAP1活性< 50%;在pH 4.0-5.0时,酶无活性。gydF4y2Ba

为了鉴定酶底物特异性,在1mM MgCl存在下,将3.5μg纯化的RDZLAP1与各种底物浓度一起温育gydF4y2Ba2gydF4y2Ba+ 25mm KgydF4y2Ba3.gydF4y2Ba宝gydF4y2Ba4gydF4y2Ba缓冲液(pH 8.0)在37°C以进行特定的时间长度。GSH或γ-Glu-Cys存在下没有DzLap1活动(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba).DzLAP1对多种α联二肽具有正活性。因此,该酶被认为是一种Cys-Gly二肽酶,因为在Cys-Gly存在时,该酶的催化效率最高。的gydF4y2BakgydF4y2Ba猫gydF4y2Ba/ KgydF4y2Ba米gydF4y2BaCys-Gly分别比Met-Gly和Leu-Gly高~ 118×和~ 6×gydF4y2Ba1gydF4y2Ba).然而,以前的一份报告表明LAP更可取gydF4y2BaNgydF4y2Ba- 对Leu-gly具有高亲和力(K.gydF4y2Ba米gydF4y2Ba= 0.35 mM) [gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba].gydF4y2Ba

表1不同基底上的DzLAP1动力学gydF4y2Ba

亚细胞DzLAP1定位于gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba

在硅分析中预测DZLAP1是叶绿体局部化蛋白质。pgwb5-gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba和沉默抑制因子gydF4y2Bap19gydF4y2Ba发生在gydF4y2Ba根癌土壤杆菌gydF4y2BaGV3101渗透在4-WKgydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba叶子。的gydF4y2Ba在Planta.gydF4y2Ba测定表明,GFP标记的DzLAP1是可能局限于细胞溶溶胶的可溶性蛋白质(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba).在叶绿体中检测到荧光信号(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,插入)。因此,榴莲DzLap1可以定位为细胞溶胶或叶绿体。gydF4y2Ba

图6gydF4y2Ba
figure6gydF4y2Ba

亚细胞gfp标记的DzLAP1在gydF4y2Ba尼古利亚娜·宾夕法尼亚州gydF4y2Ba叶子。的共聚焦显微图像gydF4y2Ban benthamianagydF4y2BapGWB5渗入叶表皮细胞(对照;pGWB5-gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba(下图)。显示GFP荧光(GFP)、叶绿体自身荧光(叶绿体)和合并图像。质体DzLAP1-GFP的定位在插图中放大显示。比例尺:20 μmgydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

榴莲果肉中积累了大量谷胱甘肽[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba对植物细胞的稳态至关重要[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba],并在γ-谷氨酰循环中与谷氨酸和甘氨酸结合储存Cys [gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba].Cys从Cys-gly的水解中回收,这是GSH分解的副产物。该机制可以通过MET合成产生丰富的乙烯前体和硫 - 挥发性化合物。这两种途径促进了榴莲果实成熟和与之相关的恶臭。在榴莲果浆中检测到Cys-Gly [gydF4y2Ba8gydF4y2Ba].因此,在榴莲果实成熟过程中,γ-谷氨酰胺循环必须被激活。在本研究中,我们旨在识别和表征上述生化过程中涉及的dzlap。关于胱甘肽二肽酶参与γ-谷氨酰基循环的报道很少[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba].gydF4y2Ba

金属肽酶是动物、植物和微生物中高度保守的金属肽酶[gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba].几个gydF4y2Ba腿上gydF4y2BaS在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba和榴莲(这个作品)。gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba有三个gydF4y2Ba腿上gydF4y2Bas编码atlap1-atlap3。gydF4y2Badzlap1_mk.gydF4y2Ba和gydF4y2BaDzLAP2_MKgydF4y2Ba在榴莲品种猫桑王基因组中检测到[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba].我们专注于gydF4y2Badzlap1_mk.gydF4y2Ba在榴莲果肉(补充无花果。gydF4y2BaS1gydF4y2Ba),谷胱甘肽和γ-EC积聚在那里[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba].Dzlap1_mk在榴莲品种Chanee中显示了Dzlap1的99.3%的身份。Dzlap1是我们内部RNA-SEQ数据中唯一检测到的同种型。一次蛋白质序列分析(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)证实DzLAP1为LAP-N,因为它含有与酶机制相关的保守底物结合、催化和金属离子结合残基。gydF4y2Ba

采后gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba表达分析显示中熟期表达上调。因此,DzLAP1可能水解Cys-Gly为Cys和Gly,导致榴莲果肉成熟过程中产生强烈的不良气味。相对gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba在所有成熟阶段的Chanee和Honthong中表达式类似(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa).但Chanee的Cys-Gly含量显著高于Monthong (gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01) (gydF4y2Ba8gydF4y2Ba].因此,gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba不依赖于品种,也不能解释Chanee和Monthong在果实气味强度方面的相对差异。竞争性乙烯抑制剂1-MCP明显抑制gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba在采后成熟(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)(图gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab)。因此,gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba可能在这个过程中发挥重要作用gydF4y2BaLAP1.gydF4y2Ba可能与成熟的早期阶段有关。相比之下,gydF4y2BaLAP-NgydF4y2Ba其他植物物种中的S在所有器官中构成性地表达[gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba43.gydF4y2Ba].我们比较gydF4y2Ba腿上gydF4y2Ba在番茄果实成熟过程中表达,并发现gydF4y2Ba包裹gydF4y2Ba在破碎期和产乙烯期的水平略低于成熟青果期(补充无花果。gydF4y2BaS2gydF4y2Ba一个西红柿)。gydF4y2BaLAP-NgydF4y2Ba在所有果实发展阶段组成型表达(补充图。gydF4y2BaS2gydF4y2Ba因此,b)。gydF4y2Ba腿上gydF4y2BaS在番茄果实发育或成熟过程中不受影响。gydF4y2Ba

对榴莲果实粗提物进行了半胱氨酸二肽酶活性的测定。gydF4y2BaS3.gydF4y2Ba)和共渗透的本氏拟南芥叶片中过表达DzLAP1(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba).米德拉米氏水解活性比未成熟的榴莲纸浆提取物更高(补充图。gydF4y2BaS3.gydF4y2Ba).该发现与中风阶段的Dzlap1上调一致(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa).由此可见,Cys-Gly二肽酶在植物中具有功能。植物DzLAP1中Cys- gly二肽酶的活性支持了我们的假设,表明Cys- gly水解生成的Cys转化为硫挥发物,导致榴莲果实成熟后的恶臭。因此,γ-谷氨酰胺循环对GSH及其氨基酸组分的循环和榴莲果实的成熟至关重要。然而,在其他植物中也提出了谷胱甘肽回收的替代途径。在成熟的番茄果实中,氧化谷胱甘肽(GSSG)分解酶γ-谷氨酰转肽酶(GGT)在谷胱甘肽降解中起主要作用,释放Cys-Gly和Glu [gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba].在拟南芥中,与野生型植物相比,ggt1敲除株GSH含量增加,Cys-Gly含量下降[gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba].与番茄和拟南芥不同的是,榴莲果实富含硫。因此,在榴莲成熟过程中γ-谷氨酰胺循环可能进化得更加活跃。gydF4y2Ba

RDZLAP1的体外生物化学测定(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)披露,lap的pH值在8.0-11.0范围内,且与金属离子有关[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba,gydF4y2Ba46.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba47.gydF4y2Ba].DzLAP1具有很高的催化效率(gydF4y2BakgydF4y2Ba猫gydF4y2Ba/ KgydF4y2Ba米gydF4y2Ba)为Cys-Gly (KgydF4y2Ba米gydF4y2Ba = 1.6 mM). Therefore, DzLAP1 is a metalloenzyme and a Cys-Gly dipeptidase. The aforementioned K米gydF4y2Ba类似于其他半胱甘肽酶,如AtLAP1 [gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,酵母Dug1p [gydF4y2Ba17gydF4y2Ba],以及细菌TdLAP [gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]所有这些都≤1.3毫米。因此,LAP对Cys-Gly的亲和力对应于活细胞中的毫摩尔生理GSH浓度范围[gydF4y2Ba48.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba49.gydF4y2Ba].榴莲比许多其他水果和蔬菜更丰富[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba50.gydF4y2Ba].因此,榴莲中的细胞GSH水平应高于这种物质的一般生理浓度,并且Cys-Gly二肽酶在物种中具有高度保守的活性。对于其他可降解的α-连接的二肽,DzLap1不能水解γ-glu-cys-gly(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba).因此,该酶可能对α-肽键具有特异性。然而,早期的研究并没有研究γ连接二肽的lap亲和力。gydF4y2Ba

亚细胞蛋白定位可以阐明酶的天然功能和生理底物之间的相关性。DzLAP1是叶绿体和细胞质中的双靶蛋白(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba).然而,它有一个质体过境肽序列。gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba转录本可能有一个替代密码子来启动核糖体翻译,绕过第一个启动密码子[gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba]和/或在邻近序列中形成次级RNA结构[gydF4y2Ba51.gydF4y2Ba].delta -2-异戊烯基焦磷酸:tRNA异戊烯基转移酶(MOD5)由一个基因编码,有两个翻译起始位点,并定位于线粒体、细胞质和细胞核[gydF4y2Ba52.gydF4y2Ba].质体DzLAP1可以回收蛋白质并执行其他任务。由于叶绿体参与细胞代谢,它们可能对各种应激源作出反应[gydF4y2Ba53.gydF4y2Ba].本研究没有阐明塑性DzLAP1的功能。但是,我们提出,如图已经一样,它是防止错误折叠的蛋白质积累和其他不利影响的分子伴侣[gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba].DzLAP1在叶绿体上的部分定位增强了它的伴侣和/或蛋白酶活性在特定的亚细胞器区。crp样蛋白(Clp)和丝状温敏蛋白(FtsH)也有类似的观察结果。它们分别是基质和类囊体膜上的主要保守atp依赖伴侣蛋白和降解蛋白酶[gydF4y2Ba54.gydF4y2Ba].DzLAP1在果实成熟过程中质体中的作用有待进一步研究。gydF4y2Ba

随着Cys-Gly具有促氧化活性,必须对其浓度进行调节。Cys-Gly促进在某些金属离子存在下的反应性氧物质(ROS)如过氧化氢和超氧化物阴离子[gydF4y2Ba55.gydF4y2Ba].下一步是氧化高度还原的硫醇,如谷胱甘肽[gydF4y2Ba56.gydF4y2Ba].细胞溶质定位和Dzlap1的酶动力学表明它在细胞质γ-谷氨酸循环中水解Cys-Gly并控制细胞溶质Cys-Gly水平。Cys-Gly也可以是体内细胞溶质DzLAP1的底物。以这种方式,DzLAP1调节Cys-Gly浓度。作为gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba定位于细胞质,在乙烯和硫挥发物积累的地方表达,它可能参与榴莲果实的成熟。事实上,细胞质的微碱性pH值[gydF4y2Ba57.gydF4y2Ba]和叶绿体间质[gydF4y2Ba58.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba59.gydF4y2Ba]有利于Dzlap1活动。gydF4y2Ba

的lap1和lapngydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba和茄科植物都有相似的催化、底物和金属离子结合残留物。然而,gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba表达不同于后一种基因。榴莲含有大量的硫磺挥发物,给水果带来强烈的味道和独特的气味。然而,这些硫醇的含量必须严格控制。在果实成熟过程中,硫代谢酶基因的表达必须受到调控。的gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba在果实成熟过程中,启动子区域可能被修饰以产生最佳的DzLAP1含量,限制Cys- gly的含量,催化Cys的循环,产生硫挥发物和乙烯。榴莲特有的蛋氨酸γ-裂解酶基因上调也有类似的发现[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba].后者负责植物和细菌产生挥发性硫[gydF4y2Ba60.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba61.gydF4y2Ba].已经鉴定了与果实成熟相关的这种酶的同种型[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba].数字gydF4y2Ba7gydF4y2Ba是一个概述DzLAP1在榴莲果肉、细胞质和叶绿体中可能的功能的示意图。gydF4y2Ba

图7gydF4y2Ba
figure7gydF4y2Ba

DzLAP1在榴莲果肉、细胞质和叶绿体中的功能示意图。DzLAP1存在于γ-谷氨酰循环(盒子)中的叶绿体和细胞质中。虚线表示至少涉及一个反应。所有的酶都有下划线。DzLAP1: leucylaminopeptidase1;GGCT:γ-glutamylcyclotransferase;OPase: oxoprolinase;GCL:谷氨酸半胱氨酸连接酶;g:谷胱甘肽合成酶;5-Oxo: 5-oxoprolinegydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

基于榴莲品种猫桑王的基因组数据,对编码leucylaminop肽酶(LAP)的LAP- n基因进行了鉴定和鉴定。该酶在榴莲果肉中高度表达,并被指定gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba.我们建立了,gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba在榴莲果实成熟的早期活跃。然而,它并不依赖于品种,也可能不是成熟的Chanee榴莲果实比成熟的Monthong榴莲果实气味更强烈的原因。一个gydF4y2Ba在Planta.gydF4y2Ba试验在gydF4y2Ba尼古利亚娜·宾夕法尼亚州gydF4y2Ba叶子证明了Cys-gly二肽酶活性。酶动力学和亚细胞定位gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba提示其具有体内半胱氨酸二肽酶活性gydF4y2Ba.gydF4y2Ba其在细胞溶溶胶中的存在表明它参与γ-谷氨酸循环,并且与细胞内乙烯和硫挥发性生产位点相邻。塑性性DzLAP1同种型可以参与蛋白质周转和/或保护。本研究部分阐述了积累了高水平硫挥发物的植物组织中硫代谢的机制。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

植物材料和生长条件gydF4y2Ba

成熟的榴莲果实取自泰国两个不同的商业果园。2017年4月初,在特拉特省的一个商业果园(12°09′56.6″N 102°41′13.1″E),花后95 d采收樟子松果实。样品保存在室温(30°C)下,然后在第1、2和4天(分别为未熟、中熟和采后成熟阶段)去皮。在昌武里省的一个商业果园(12°40 ' 39.2″N 102°05 ' 35.2″E),花后105天采收月果。以月ong为代表样本进行基因表达分析。它的三个不同的成熟阶段也进行了评估,但它们的时间(天)与Chanee略有不同。将未熟、中熟和熟月果样品在室温下贮藏后1d、3d和5d分别去皮分析[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba].收集这些样本不需要特别许可。植物材料的收集符合国家和国际准则。gydF4y2Ba

调查与之间的关联gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba用乙烯利或1-甲基环丙烯(1-MCP)处理成熟、未成熟的榴莲月月果样品。这些合成的植物激素具有相反的作用方式。乙烯利转化为乙烯,促进成熟。相反,1-MCP是一种乙烯拮抗剂,可以延缓成熟。根据Khaksar等人的方法,将处理过的样品与自然成熟的对照样品进行比较[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba].研究使用了三个生物重复,每个重复都包括从不同的树上收获的单个榴莲果实。gydF4y2Ba

采用榴莲果肉粗提物测定半胱氨酸二肽酶活性。榴莲品种Chanee是在泰国Nonthaburi省的当地市场上获得的。采后样品分别在未熟和中熟阶段采集。研究人员使用了三个生物复制,每个复制都包括从单独的榴莲果实上收获的单个叶。gydF4y2Ba

尼古利亚娜·宾夕法尼亚州gydF4y2Ba种植作物用于农业渗透。种子播种于泥炭苔藓上,幼苗在25℃、16 h/8 h光暗周期、4500 lx(人工光)条件下生长。将两周大的植株单独移栽到花盆中,在同样的条件下再饲养2周。gydF4y2Ba

榴莲果实的系统发育分析和LAP鉴定gydF4y2Ba

含有Cys-Gly二肽酶活性的lap蛋白序列gydF4y2Ba梅毒denticolagydF4y2Ba(加入编号WP_010698434.1)[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba),gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba(AtLAP1和AtLAP3;登录号分别为P30184.1和Q8RX72.1) [gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]担任爆炸搜索的疑问gydF4y2BaD. Zibethinus.gydF4y2Ba品种猫桑王NCBI数据库。MaGenDB数据库[gydF4y2Ba62.gydF4y2Ba)确认gydF4y2BaDzLAPgydF4y2Ba同种型。gydF4y2Ba

通过ClustalW多序列比对,对NCBI中推测的dzlap和其他lap的氨基酸序列进行系统发育关系分析。MEGA v. 7创建了一个邻居连接(NJ)树[gydF4y2Ba63.gydF4y2Ba使用1000个引导复制。gydF4y2Ba

组织特异性的测定gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba表达gydF4y2Ba

搜索gydF4y2BaDzLAPgydF4y2Ba对榴莲品种穆斯兰国王的基因组数据披露了两种候选基因(登录号XM_022894525.1(LOC11299369)和XM_022874012.1(LOM11284913)注释为gydF4y2BaDzLAP1-likegydF4y2Ba和命名gydF4y2Badzlap1_mk.gydF4y2Ba和gydF4y2BaDzLAP2_MKgydF4y2Ba,分别。注意榴莲果肉,因为它积累了一些硫磺挥发物。gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba在不同的果实组织中进行了硅质表达分析。比较相对gydF4y2BaDzLAPgydF4y2Ba来自Illumina reads的归一化总读计数(normalised total read count, RCs)从序列读存档(Sequence read Archive, SRA)资源中获得,并根据Khaksar等人的方法进行处理[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba].获得SRX3188225(根)、SRX3188222(茎)、SRX3188226(叶)和SRX3188223(假种/果肉)的RNA-seq数据[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba].使用MetaboAnalyst v构建基于RCS的热线图。4.0 [gydF4y2Ba64.gydF4y2Ba].gydF4y2Ba

qRT-PCR分析基因表达gydF4y2Ba

在制造商的说明书之后,使用Purelink®植物RNA试剂(Thermo Fisher Scientific,Waltham,Ma,Ma,USA)从Chanee和Honthong Durian品种纸浆中分离出总RNA。评估DNase处理的RNA样品量和完整性。用再逆向第一链CDNA合成试剂盒(Thermo Fisher Scientific,Waltham,Ma,Ma,USA)反转录约1μg总RNA与cDNA反转转录。在补充表中列出的基因特异性引物gydF4y2BaS1gydF4y2Ba.中存在的阐明gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba在未熟、中熟和成熟的榴莲果实中表达。96孔PCR板,总体积10 μL。cDNA和引物与Luna®通用qPCR master mix (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)结合。PCR在CFX Connect™实时PCR检测系统中进行,该系统与CFX Manager™(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)耦合。通过熔化曲线分析,验证了单次扩增产物的产生。通过2gydF4y2Ba−ΔΔCtgydF4y2Ba方法(gydF4y2Ba65.gydF4y2Ba基于相对于内参基因延伸因子1 α的周期阈值(Ct) (gydF4y2BaEF-1α.gydF4y2Ba).qRT-PCR中有3个独立的生物学重复。对乙烯利和1- mcp处理的样品和自然未成熟的样品(对照)进行基因表达分析。gydF4y2Ba

在Planta.gydF4y2Ba胱甘肽二肽酶活性测定gydF4y2Ba

为测定榴莲果肉中半胱氨酸-甘氨酸二肽酶的活性,分别从榴莲果肉的未熟和中熟阶段提取粗酶。分别采集纸浆样品,在液氮中冷冻,并在MM400混合机(Retsch GmbH, Haan, Germany)中以30 Hz的频率粉碎1分钟。然后每个样品250 mg溶解在2.5 mL裂解缓冲液(50 mM KgydF4y2Ba3.gydF4y2Ba宝gydF4y2Ba4gydF4y2Ba, pH 8.0),在4°C温和混合1小时。样品在14000 ×离心gydF4y2BaggydF4y2Ba和4℃5分钟,收集上清液。通过在反应缓冲液中用20mM Cys-Gly孵育榴莲果皮提取物进行酶活性测定(50mm K.gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba宝gydF4y2Ba4gydF4y2Ba缓冲液(pH 8.0)+ 1 mm mgclgydF4y2Ba2gydF4y2Ba)在30分钟,1小时和3小时。用改良的酸性茚三酮法测定酶活性[gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba].分别用50 μL冰醋酸终止各酶反应体系50 μL,然后用50 μL酸性茚三酮溶液(250 mg茚三酮在6 mL冰醋酸+ 4 mL盐酸中),煮沸9 min,用自来水冷却。粉红色端点表示在酸性条件下释放的Cys与茚三酮的反应。用分光光度法在AgydF4y2Ba560gydF4y2Ba(美国佛蒙特州维诺斯基生物tex公司)。采用三个独立的生物学重复。gydF4y2Ba

在Planta.gydF4y2Ba还研究了Cys-Gly二肽酶活性。总长度gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba采用Phusion Hot Start II高保真DNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA),以Chanee cDNA为模板进行扩增。附录中所列基因特异性引物(不包括终止密码子)gydF4y2BaS1gydF4y2Ba用于PCR。PCR产物克隆到PCR™8/GW/TOPO®TA克隆载体(Invitrogen公司,Carlsbad, CA, USA)中,生成pTOPO-gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba.然后对后者进行测序。gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba被转移到PEAQ3目的地向量并融合在gydF4y2BaCgydF4y2Ba- 6×他的终端[gydF4y2Ba66.gydF4y2Ba]通过Gateway®LRClonase®II(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)。PEAQ-gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba产品转化为gydF4y2Ba根癌土壤杆菌gydF4y2BaGV3101电穿孔。gydF4y2Ba

A. Tumefaciens.gydF4y2Ba轴承的gydF4y2BaDzLAP1-6xHisgydF4y2Ba或将空的pEAQ载体(对照)浸润至4周。植物。简单地说,从每个培养细胞洗涤和悬浮在MM缓冲液(10 MM MES缓冲液+ 10 MM氯化镁)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba;pH值5.6)。细胞悬浮液在a下调整gydF4y2Ba600gydF4y2Ba至OD = 0.6。加入乙酰丁香酮至200 μM终浓度,悬浮液在30°C黑暗保存2 h后进行渗透。农渗后第3天,用15mm Cys-Gly浸透叶片,孵育1 h [gydF4y2Ba67.gydF4y2Ba],冷冻干燥,并在30°C的干燥处保存,直到随后的代谢产物的HPLC分析。为了测量叶面Cys-Gly水平,将共渗入的叶片在MM400混合机(Retsch GmbH, Haan, Germany)中以30 Hz的频率粉碎1分钟。每个样品悬浮在0.1 M盐酸萃取缓冲液中,浓度为1 mg/50 μL。然后,10毫米gydF4y2BaNgydF4y2Ba加入-乙酰半胱氨酸(内标),在37°C, 250转,摇匀2.5 h。样品在14000 ×离心gydF4y2BaggydF4y2Ba和30°C 5分钟。将可溶组分转移到新的微离心管中,与乙腈(1:1)结合,14000 ×离心gydF4y2BaggydF4y2Ba和30°C 5分钟。用centrevap台式真空浓缩器(Labconco Corp., Kansas City, MO, USA)将球团去除,上清液干燥。干燥后的样品用200 μL去离子化H重新溶解gydF4y2Ba2gydF4y2BaO,通过0.22 μm注射器过滤器,进行高效液相色谱分析。每样10微升注入C18色谱柱(250 mm × 4.6 mm;Phenomenex, Torrance, CA, USA),采用乙腈(5%)在2%高氯酸中作为流动相。流速为1 mL/min,温度为40℃。在210 nm处检测到Cys-Gly峰[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba].采用3个独立的生物重复,每个重复由一片独立的叶子组成。gydF4y2Ba

DzLAP1gydF4y2Ba克隆与表达gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba

在假定的gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba采用Phusion Hot Start II DNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA),以中熟榴莲Chanee cDNA为模板进行扩增。PCR反应温度分布如下:98℃初始变性30 s;98°C 10 s 30个循环;57°C for 10 s;72°C 1分钟;最后在72°C下拉伸5分钟。基因特异性正、反引物设计gydF4y2Badzlap1_mk.gydF4y2Ba序列(补充表gydF4y2BaS1gydF4y2Ba).排除了Clorop1.1和TargetP服务器预测的信号序列。在假定的gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2BaPCR产物用限制性内切酶(FastDigest™;并克隆到pET21b载体(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)。产品为pET21b-gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba18个核苷酸编码6× His残基gydF4y2BaCgydF4y2Ba- 重量。它被转变为gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaTOP10(K2500-20; Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)。在补充1mg ml的Lb琼脂上升高了细菌菌落gydF4y2Ba- 1gydF4y2Ba菌落PCR分析。阳性克隆的核苷酸序列通过1base测序进行验证。gydF4y2Ba

重组DzLAP1 (rDzLAP1)的生产和纯化gydF4y2Ba

PET21B-gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba转化成了T7宿主gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaSoluBL21 (DE3)。将含有重组质粒的细胞置于含1mg mL的LB肉汤中孵育过夜gydF4y2Ba- 1gydF4y2Ba氨苄青霉素。将发酵剂接种到添加1mg mL的新鲜LB肉汤中gydF4y2Ba- 1gydF4y2Ba氨苄青霉素并在37℃下孵育,摇动为250 rpm直至ODgydF4y2Ba600gydF4y2Ba-0.5 = 0.4。用1 mM异丙基β-诱导产生rDzLAP1gydF4y2BaDgydF4y2Ba-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG), 30°C, 250 rpm摇晃17小时。5000×离心收获细胞gydF4y2BaggydF4y2Ba和37℃持续10分钟,悬浮在缓冲液A(25 mm kgydF4y2Ba3.gydF4y2Ba宝gydF4y2Ba4gydF4y2Ba缓冲+ 0.3米NaCl;pH 7.2),并通过超声波裂解。通过以7500×离心收集可溶性细胞内蛋白质gydF4y2BaggydF4y2Ba和4℃持续30分钟,通过Western Blot分析(6×他的表位标签抗体; Thermo Fisher Scientific,Waltham,Ma,USA),并储存在4°C直至净化。gydF4y2Ba

将粗提物加载到与缓冲液A预平衡的HistRap™柱(Merck,Darmstadt,GER)上。用过量缓冲液A洗涤柱,用缓冲液B洗脱RDZLAP1(25mm kgydF4y2Ba3.gydF4y2Ba宝gydF4y2Ba4gydF4y2Ba缓冲+ 0.3M NaCl + 150mM咪唑;pH 7.2)。通过SDS-PAGE和Western印迹分析样品。汇集纯化的RDZLAP1级分透析25mm kgydF4y2Ba3.gydF4y2Ba宝gydF4y2Ba4gydF4y2Ba缓冲(pH值7.2)。蛋白浓度由改良的Bradford试验测定[gydF4y2Ba68.gydF4y2Ba].参考蛋白标准是BSA。gydF4y2Ba

酶rDzLAP1化验gydF4y2Ba

评价了rDzLAP1对金属离子的依赖性。酶与7.5 mM Cys-Gly在25 mM K中37°C孵育15分钟gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba宝gydF4y2Ba4gydF4y2Ba缓冲液(pH 7.2)在0 mM或1 mM Ca存在下gydF4y2Ba2+gydF4y2Ba、锌gydF4y2Ba2+gydF4y2Ba,mg.gydF4y2Ba2+gydF4y2Ba, 你gydF4y2Ba2+gydF4y2Ba或者mn.gydF4y2Ba2+gydF4y2Ba.总反应体积为50 μL。通过改性酸性茚三酮方法测量酶活性[gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba].为了确定最佳酶pH,通过将RDZLAP1与7.5mM Cys-Gly和1mm Mg孵育来制备50-μL反应体系。gydF4y2Ba2+gydF4y2Ba在不同pH(醋酸缓冲液,pH 4-6;磷酸盐缓冲液,pH 6-8;三盐酸缓冲液,pH 8-9.5;甘氨酸- naoh缓冲液,pH 9.5-11), 37°C, 15分钟。最大酶活定义为100%相对酶活。gydF4y2Ba

为了评估酶动力学,将3.5 μg纯化的rDzLAP1与0-10 mM Cys-Gly、γ-Glu-Cys、GSH、Met-Gly或Leu-Gly在1 mM MgCl存在的条件下孵育gydF4y2Ba2gydF4y2Ba在25 mm kgydF4y2Ba3.gydF4y2Ba宝gydF4y2Ba4gydF4y2Ba缓冲液(pH 8.0)在37°C以进行特定的时间长度。用0.13 N HCl终止反应。对于γ-glu-cys和GSH,通过改性酸性茚三酮测定评估反应。对于Cys-Gly,Met-Gly和Leu-Gly,通过监测A型自由肽的吸光度降低来分析反应gydF4y2Ba230.gydF4y2Ba,稍作改动[gydF4y2Ba69.gydF4y2Ba].使用OriginPro®2017 (OriginLab Corp., Northampton, MA, USA)测定酶动力学。gydF4y2Ba

亚细胞定位gydF4y2Ba

总长度gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba扩增并克隆到pCR™8/GW/TOPO®TA载体(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)gydF4y2Ba在Planta.gydF4y2BaCys-gly二肽酶活性测定。ptopo-gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba然后测序产物。的gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba转移到pGWB5目标载体,并在gydF4y2BaCgydF4y2Ba- 绿色荧光蛋白(GFP)的终端[gydF4y2Ba70gydF4y2Ba]通过Gateway®LRClonase®II(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)。pgwb5-gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba产品转化为gydF4y2BaA. Tumefaciens.gydF4y2BaGV3101电穿孔。gydF4y2Ba

根癌土壤杆菌gydF4y2Ba轴承的gydF4y2BaDzLAP1-GFPgydF4y2Ba建设和gydF4y2BaA. Tumefaciens.gydF4y2Ba使用沉默抑制器gydF4y2Bap19gydF4y2Ba基因(gydF4y2Ba71.gydF4y2Ba]被共渗透到4周植物中,如前所述,经过一些修改。简单地说,从每个培养细胞洗涤和悬浮在MM缓冲液(10 MM MES缓冲液+ 10 MM氯化镁)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba;pH值5.6)。细胞悬浊液窝藏gydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba和gydF4y2Bap19gydF4y2Ba在A点调整gydF4y2Ba600gydF4y2Ba到OD = 0.8和0.6,分别在1:1中组合。将乙酰菌酮加入到混合物中,终浓度为200μm,在室温下在浸润之前将悬浮液保持在黑暗中2小时。在第3天浸润后,在FluoView®FV10i-Doc共聚焦激光扫描显微镜(日本Olympus Corp.)下可视化自发荧光。GFP,叶绿体自发荧光和相位对比检测激发/排放分别以473/510nm,559 / 600nm和559/600nm记录。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

使用SPSS统计信息v.22.0(IBM Corp.,Armonk,Ny,USA)分析所有数据。单向ANOVA在没有和存在金属离子的情况下鉴定了平均酶活性水平的显着差异。通过Tukey的HSD多次比较测试分析了在各种成熟阶段的Cys-Gly二肽酶基因表达水平和酶活性,并响应于不同的成熟调节剂(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)。学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba-测试 (gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)identified significant differences betweenn benthamianagydF4y2Ba叶子overexpressinggydF4y2BaDzLAP1gydF4y2Ba以及控制gydF4y2Ba在Planta.gydF4y2BaCys-Gly二肽酶的活动gydF4y2Ba.gydF4y2Ba

可用性数据和材料gydF4y2Ba

在当前的研究中使用和/或分析的数据集可从通信作者在合理的要求。gydF4y2Ba

缩写gydF4y2Ba

谷胱甘肽:gydF4y2Ba

谷胱甘肽gydF4y2Ba

γ-EC:gydF4y2Ba

γ-glutamylcysteinegydF4y2Ba

Cys-Gly:gydF4y2Ba

CysteinylglycinegydF4y2Ba

半胱氨酸:gydF4y2Ba

半胱氨酸gydF4y2Ba

膝盖:gydF4y2Ba

LeucylaminopeptidasegydF4y2Ba

DzLAPgydF4y2Ba:gydF4y2Ba

Durio zibethinusgydF4y2Bal . leucylaminopeptidase基因gydF4y2Ba

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下载参考gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

作者感谢Kittiya Tantisuwanchkul和Pinnapat PINSORN,用于提供榴莲cDNA样本,DRS。Gholamreza Khaksar和Lalida Sangpong为他们提供了RNA-SEQ数据分析,Shimane大学的Tsuyoshi Nakagawa,日本Shimane,Shimane®表达矢量PGWB5,Sainsbury实验室,诺维奇,诺福克,诺福克,英国提供gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba.gydF4y2Ba农gydF4y2BaGV3101窝藏pJL3:gydF4y2Bap19gydF4y2Ba和Plant Bioscience Ltd. (Norwich, UK)共同提供pEAQ载体。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

该研究得到了泰国研究基金(No.RSA6080021),Chulalongkorn大学(No.Gru 6203023003-1至S.)。P. P收到了Chulalongkorn大学的第二世纪基金(C2F)博士后奖学金。融资机构没有参与研究和工厂样本收集,数据分析,数据解释和手稿的写作。gydF4y2Ba

作者信息gydF4y2Ba

隶属关系gydF4y2Ba

作者gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

S.S.构思了这项研究。P.P.和S.S.设计了实验。P.P.进行实验。P.P.和S.S.分析了数据并准备了稿件。所有作者都读过并批准了稿件。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaSupaart Sirikantaramas.gydF4y2Ba.gydF4y2Ba

道德声明gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版物gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

额外的信息gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

补充信息gydF4y2Ba

附加文件1:补充表S1。gydF4y2Ba

本研究使用的引物。限制地点下划线。gydF4y2Ba

附加文件2:补充图S1。gydF4y2Ba

组织gydF4y2BaDzLAPgydF4y2Ba穆斯兰王榴莲果浆中的表达曲线。gydF4y2Badzlap1_mk.gydF4y2Ba和gydF4y2BaDzLAP2_MKgydF4y2Ba用RNA-seq分析果肉、茎、叶和根的表达水平。红色:基因表达水平较高;蓝色:基因表达水平降低。数据经过求和归一化、对数转换和自动缩放。gydF4y2Ba

附加文件3:补充图。S2。gydF4y2Ba

相对gydF4y2Ba包裹gydF4y2Ba(一)和gydF4y2BaLAP-NgydF4y2Ba(b)在番茄果实各种发育阶段的表达。gydF4y2Ba包裹gydF4y2Ba(a)和(Solyc12g010020)gydF4y2BaLAP-NgydF4y2Ba(solyc12g010040)(b)番茄中的表达水平(gydF4y2Ba茄属植物lycopersicumgydF4y2Ba)由基于illumina和rpcm归一化的数据确定[gydF4y2Ba72.gydF4y2Ba]并以番茄EFP浏览器v.2.0表示。成熟的绿色,破碎机和断路器+ 10 d番茄果实成熟阶段。gydF4y2Ba

附加文件4:补充图S3。gydF4y2Ba

榴莲果肉提取物中半胱氨酸二肽酶活性的测定。20微升未熟(黑色条状)和中熟(白色条状)榴莲果实提取物与20 mM cyys - gly在50 mM K中孵育gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba宝gydF4y2Ba4gydF4y2Ba缓冲液(pH 8.0)在1 mM MggydF4y2Ba2+gydF4y2Ba在37°C下放置30分钟,1小时,3小时。总反应体积为50 μL。用修饰过的酸性茚三酮分光光度法在560nm (agydF4y2Ba560gydF4y2Ba).柱:三个独立生物重复的平均值±标准差。根据Tukey的HSD多量程测试(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)。gydF4y2Ba

权利和权限gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文是基于知识共享署名4.0国际许可,允许使用、共享、适应、分布和繁殖在任何媒介或格式,只要你给予适当的信贷原始作者(年代)和来源,提供一个链接到创作共用许可证,并指出如果变化。本文中的图像或其他第三方材料都包含在本文的知识共享许可中,除非在该材料的信用额度中另有说明。如果资料不包括在文章的知识共享许可协议中,并且你的预期用途没有被法律规定允许或超过允许用途,你将需要直接从版权所有者获得许可。如欲查阅本许可证副本,请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba.创作共用及公共领域专用豁免书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本文提供的数据,除非在数据的信贷额度中另有说明。gydF4y2Ba

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PANPETCH,P.,Sirikantaramas,S.果实成熟相关的白氨基氨基肽酶,来自榴莲的胱天斯坦甘氨酸二肽酶活性,表明其参与谷胱甘肽回收。gydF4y2BaBMC植物BIOL.gydF4y2Ba21,gydF4y2Ba69(2021)。https://doi.org/10.1186/s12870-021-02845-6gydF4y2Ba

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关键字gydF4y2Ba

  • Cys-GlygydF4y2Ba
  • 榴莲gydF4y2Ba
  • 果实成熟gydF4y2Ba
  • 腿上gydF4y2Ba
  • LeucylaminopeptidasegydF4y2Ba
  • 硫化合物gydF4y2Ba